黄色瘤胃球菌双功能酶xynD基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征.pdf

南京农业大学学报():/.:./.收稿日期:基金项目:中央引导地方科技发展专项资金项目()新疆维吾尔现代农业产业技术体系()作者简介:王蕾博士研究生通信作者:陈勇教授主要研究方向为动物营养与饲料科学:.王蕾李文菁杨东林等.黄色瘤胃球菌双功能酶 基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征.南京农业大学学报():.():.黄色瘤胃球菌双功能酶 基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征王蕾李文菁杨东林陈勇(新疆农业大学动物科学学院新疆 乌鲁木齐)摘要:目目的的 黄色瘤胃球菌 基因编码葡聚糖酶和木聚糖酶 个独立的催化结构域 本研究在毕赤酵母中导入 基因表达蛋白并对其酶活性及酶学性质进行研究 方方法法 根据毕赤酵母的密码子偏爱性对 基因优化(优化后的基因命名为)构建重组质粒 转化至毕赤酵母 通过筛选获得基因工程菌株 经诱导表达获得重组 再对其酶学性质进行初步研究 结结果果 的木聚糖酶与葡聚糖酶在 和 酶活性和比活性均达到最大值分别为.、.和 .、.的木聚糖酶活性在温度 、值为.时较稳定最适酶活性温度和 值分别为 和.对 甲基葡萄糖醛酸木聚糖、高黏度阿拉伯木聚糖和桦木木聚糖有良好的水解作用 的葡聚糖酶活性在温度 、值为.时较稳定最适酶活性温度和 值分别为 和.对大麦 葡聚糖有水解作用 双功能酶活性被、和激发和 使其酶活性几乎丧失 结结论论 木聚糖酶和葡聚糖酶的最适底物分别为 甲基葡萄糖醛酸木聚糖和大麦 葡聚糖最适温度分别为 和 最适 值均为.关键词:黄色瘤胃球菌双功能酶毕赤酵母异源表达酶学性质中图分类号:.文献标志码:文章编号:()():.().:第 期王蕾等:黄色瘤胃球菌双功能酶 基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征酶制剂在饲料、食品、造纸、医药及生物能源等多领域具有广泛的应用从环境中筛选酶的基因资源一直都是该领域的研究热点 反刍动物瘤胃是高效降解植物纤维的“发酵罐”其中纤维降解菌及其产生的纤维素酶和半纤维素酶发挥着重要作用 瘤胃中的纤维素降解菌包括瘤胃球菌()、产琥珀酸丝状杆菌()、溶纤维丁酸弧菌()和梭菌()等 其中黄色瘤胃球菌()和白色瘤胃球菌()是瘤胃中主要的纤维降解菌 黄色瘤胃球菌可编码糖苷水解酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶等多种酶通过产生木聚糖酶复合体、多种内切葡聚糖酶以及外切葡聚糖酶来降解纤维素 黄色瘤胃球菌甚至能降解那些通常难以降解的、坚韧的棉花纤维这说明黄色瘤胃球菌纤维素及半纤维素基因资源的独特性及其潜在的应用价值研究发现黄色瘤胃球菌 基因组共有 个糖苷水解酶基因分布在 个糖苷水解酶家族中黄色瘤胃球菌 基因组中共有 个开放阅读框()编码 木聚糖酶(.简称木聚糖酶)其中有 个 编码双功能木聚糖酶 另一黄色瘤胃球菌 至少有 个编码木聚糖酶的基因其中 和 编码双功能酶 基因编码的双功能酶由 个不同的木聚糖酶结构域组成并由 个非常规连接区连接 基因编码的双功能酶由 个木聚糖酶和 个 葡聚糖酶(.简称葡聚糖酶)结构域组成 由于植物性饲料中含丰富的葡聚糖和木聚糖添加木聚糖酶与葡聚糖酶具有提高饲料的消化利用率、促进动物生长的作用 因此通过基因工程技术异源表达 基因生产重组木聚糖酶和葡聚糖酶具有开发利用价值 在大肠杆菌()中 基因的表达产物可降解燕麦木聚糖和地衣多糖不降解羧甲基纤维素其木聚糖酶和葡聚糖酶比活性分别为.和.如此低的酶活性限制了该木聚糖酶和葡聚糖酶的进一步应用与大肠杆菌表达系统相比酵母表达系统具有表达水平更高、培养简单、可分泌表达等优点还可以使重组蛋白适当折叠并以 作为信号肽酶分泌至细胞外 因此在毕赤酵母()中表达 基因有望获得更高的酶活性本研究在不改变氨基酸序列的情况下对来源于黄色瘤胃球菌的双功能酶 基因进行密码子优化再在毕赤酵母中表达并对其酶学特征进行研究为重组工程菌应用到饲料工业中提供参考 材料与方法.菌株与试剂大肠杆菌、毕赤酵母 和表达载体 均为本课题组保存 聚合酶、限制性内切酶、和蛋白质标准分子质量购自宝生物工程(大连)有限公司质粒小提试剂盒和 纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司地衣多糖、大麦 葡聚糖、阿拉伯木聚糖购自 公司甲基葡萄糖醛酸木聚糖、燕麦木聚糖购自 公司其他试剂为国产分析纯 毕赤酵母 使用的培养基为酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基().主要仪器与设备 发酵罐和 型低温高速离心机(德国 生命科学公司)酶标仪(瑞士 集团公司)型电转仪(美国 公司的 子公司)梯度 仪和 全自动凝胶成像系统(美国 公司)半自动部分收集器(美国 公司)水浴恒温振荡器(上海金怡医疗科技有限公司)气浴摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)型核酸蛋白仪(德国 公司)等.黄色瘤胃球菌双功能酶 基因的优化与合成根据黄色瘤胃球菌 基因序列(:.)使用 .在线分析基因的信号肽编码序列 为提高重组蛋白的表达水平去除 的信号肽编码区()以及催化模块间的连接序列()根据毕赤酵母密码子的偏爱性消除稀有密码子降低 二级结构自由能和调整 含量消除限制酶切位点在不改变氨基酸序列的情况下利用 对 基因进行密码子优化优化后的基因命名为 以进一步提高重组蛋白表达水平 将 序列送至 公司合成 合成的 和表达载体 经 /双酶切构建重组质粒 并转化至感受态大肠杆菌 经培养后采用碱裂解法提取重组质粒 经 和 双酶切初步鉴定后分别由 公司和 公司重复测序南 京 农 业 大 学 学 报第 卷.重组毕赤酵母工程菌的构建及筛选鉴定用限制性内切酶 将 线性化经琼脂糖凝胶电泳后纯化并回收电转化至毕赤酵母 感受态细胞 将电转后的细胞涂布于最小葡萄糖培养基()平板上 培养 挑选生长良好的菌落在 平板和最小甲醇培养基()平板上进行甲醇利用慢型()和甲醇利用正常型()表型的筛选再分别经、和 遗传霉素()的抗性筛选得到高拷贝阳性转化子 将得到的转化子进行 平板培养挑取单菌落液体培养 提取重组酵母基因组 以序列()和()为引物(由 公司合成)采用 验证 基因是否插入.的逐级诱导表达及活性测定.的试管、摇瓶表达及酶活性的定性和定量测定 根据 的毕赤酵母 表达手册将抗 的 个转化子从缓冲复合甘油培养基()转接至 缓冲复合甲醇培养基()使菌悬液的 值为.进行试管甲醇诱导表达于 、水浴恒温振荡器中培养每 添加甲醇至终含量为.诱导表达 结束采集样品经低温高速离心机以 离心 后取上清液用于测定葡聚糖酶和木聚糖酶活性 从上述转化子中挑取酶活性最高的转化子在 摇瓶中扩大培养甲醇诱导 摇瓶表达为每瓶 培养基培养条件及样品的处理和测定与试管培养一致分别取摇瓶中诱导培养 和 的 和 以及分别诱导表达、和 的 的培养上清液以高黏度阿拉伯木聚糖或大麦 葡聚糖为底物采用刚果红平板染色法定性检测 的酶活性 分别以高黏度阿拉伯木聚糖或大麦 葡聚糖为底物采用 法定量测定 的木聚糖酶和葡聚糖酶活性酶活性均测定 次 个木聚糖酶活性单位()是以 高黏度阿拉伯木聚糖为底物在.、条件下每分钟分解木聚糖生成 还原糖所需的酶量 个葡聚糖酶活性单位()是以 大麦葡聚糖为底物在.、条件下每分钟分解葡聚糖生成 还原糖所需的酶量.在发酵罐中的高密度发酵表达及纯化鉴定 将工程菌划线培养后挑取单克隆进行液体培养当菌液中菌浓度为 时取 菌液加入 培养基中培养 得到的菌液为种子液()在装有 培养基(、()、的发酵罐中接种 种子液分别以甲醇或山梨醇/甲醇(体积比为)为碳源(单碳源和双碳源的添加量均为 持续添加)诱导表达 每 收集样品 离心后取上清液用于酶活性的测定和 及酶谱分析活性酶谱的凝胶配制与(分离胶及浓缩胶:双蒸水 丙烯酰胺.、.、.过硫酸铵 四甲基乙二胺)相同酶谱凝胶中分别加入 阿拉伯高黏度木聚糖和大麦低黏度葡聚糖酶液与未加二硫苏糖醇的上样缓冲液(、.溴酚蓝 甘油)(体积比)混匀上样电泳 取下凝胶置于洗涤液(、.、.)中洗涤 次每次 以去除凝胶中的 再置于孵育液(、.)中清洗 次每次 更换新的孵育液并将凝胶放入 和 中孵育 将凝胶使用 的刚果红染色 用 溶液脱色至出现清晰条带取发酵上清液经超滤浓缩后用葡聚糖凝胶 层析选用长为 、直径为 的层析柱使用.磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液为洗脱液以部分收集器每 收集 管根据 值绘制吸收曲线 合并同一吸收峰的组分采用 法测定 各吸收峰的木聚糖酶和葡聚糖酶活性并进行.酶学特性测定.的最适 值及不同 值下的稳定性取纯化后的 与不同 值的缓冲液(.、.甘氨酸盐酸缓冲液 值.、.磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液 值.、.甘氨酸氢氧化钠缓冲液)适当稀释在 值 条件下分别于 和 反应 第 期王蕾等:黄色瘤胃球菌双功能酶 基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征 测定木聚糖酶和葡聚糖酶活性 每.个 值为 个间隔以酶活性最高为 以相对酶活性判断 的最适 值 在 值 条件下将 于 和 保持 后分别测定剩余的木聚糖酶和葡聚糖酶活性以酶活性最高为 以相对酶活性判断 在不同 值下的稳定性.的最适温度及不同温度下的稳定性取纯化后的 分别在 条件下于.反应 测定其酶活性温度间隔为 以酶活性最高为 以相对酶活性判断 的最适温度 取 在上述温度条件下放置 后于.条件下测定剩余酶活性以酶活性最高为 以相对酶活性判断 在不同温度下的稳定性.的底物特异性 取纯化后的 以浓度为 (终浓度为.)的桦木木聚糖()、燕麦木聚糖()、甲基葡萄糖醛酸木聚糖()、高黏度阿拉伯木聚糖()和对硝基苯酚木糖苷()为底物参考上述方法在最适条件下测定木聚糖酶的最适底物以 的地衣多糖()、低黏度大麦 葡聚糖()、高黏度大麦 葡聚糖()和羧甲基纤维素()为底物在最适条件下测定葡聚糖酶的最适底物以酶活性最高为.金属离子、螯合剂和表面活性剂对 活性的影响测定 取 的双蒸水配制的含金属离子溶液(、()、)和乙二胺四乙酸()、十二烷基硫酸钠()、巯基乙醇()、二硫苏糖醇()(参与作用的金属离子及试剂的浓度均为 )与 酶液混匀后在室温下保持 在.、温度分别为 和 条件下测定木聚糖酶和葡聚糖酶活性以加入 双蒸水的酶活性(对照)为 计算各底物的相对酶活性.酶解反应的动力学参数测定 将酶液与不同质量浓度(、和 )和不同底物的溶液在最适条件下反应并测定酶活性使用 双倒数作图法计算 酶解反应的米氏方程并计算米氏常数()和最大反应速度()图 双酶切重组质粒的鉴定 .标准品 .重组质粒 .经 和 双酶切的重组质粒 .图 重组酵母鉴定 .标 准 品 .基因组 .基因组 .重组毕赤酵母 .结果与分析.黄色瘤胃球菌 基因的密码子优化优化后的 基因经 测序基因全长 编码 个氨基酸残基理论相对分子质量为.优化前后 序列的一致性为.提交至 后获得的登录号为.重组酵母表达质粒的构建与鉴定从图 可以看出:重组质粒 经 和 双酶切电泳显示有 条 条带相对分子质量与预期相符初步说明 基因已插入到 从图 可以看出:提取、和 基因组 经 和电泳后 在 左右出现 条带此条南 京 农 业 大 学 学 报第 卷带为野生型乙醇氧化酶()基因扩增产物 有 条带分别在 和 左右分别为野生型 基因和 因子编码基因扩增产物 的 产物在 和 左右分别有 条带分别为野生型 基因和 因子及目的基因扩增产物表明目的基因 成功导入 基因组.的逐级诱导表达及酶活性.转化子的初筛 经筛选共得到抗 的 转化子 个 在试管中的木聚糖酶平均酶活性为.的葡聚糖酶平均酶活性为.其中 号转化子的木聚糖酶活性为.葡聚糖酶活性为.木聚糖酶活性是平均活性的.倍葡聚糖酶活性是平均活性的.倍 后续试验均选取 号转化子图 在试管表达下的酶活性 .在摇瓶中经甲醇诱导表达酶活性的定性测定 号转化子的 木聚糖酶经诱导 随诱导时间的延长酶活性逐渐增加在 的酶活性达到最大(.)之后随着时间的延长酶活性快速下降(图)葡聚糖酶经诱导 随着诱导时间延长酶活性升高在诱导 时酶活性达到最大值(.)之后随着时间延长酶活性趋于稳定(图)图 在摇瓶培养条件下的酶活性 .刚果红平板染色法定性检测 活性 从图 可知分别诱导 和 的酶液在含阿拉伯木聚糖的平板中产生直径分别为 和 的透明圈(、)如图 可知分别诱导 和 的酶液在含大麦 葡聚糖的平板中产生直径分别为 和 的透明圈(、)这表明 在 中得到表达产生了木聚糖酶和葡聚糖酶 分别诱导 、的 、转化空表达载体 的 以及 号未诱导时的发酵液均未产生透明水解圈说明它们没有酶分泌.在发酵罐中表达的酶活性如图 所示:以甲醇为碳源时 木聚糖酶活性在诱导 时达到最大值为.比活性最高为.之后随着时间增加而平稳下降而以甲醇/山梨醇为碳源表达时木聚糖酶活性随着时间的增加而上升在 达到最大且趋于稳定酶活性为.比活性仅为.如图 所示:葡聚糖酶活性在以甲醇以及以甲醇/山梨醇为碳源时变化曲线基本一致酶活性随着时间的增加而上升并在 达到最大分别为.和 .且比活性也达到最大分别为 .和 .单碳源时的酶活性随着时间增加趋于平稳双碳源时的酶活性有较明显的波动 第 期王蕾等:黄色瘤胃球菌双功能酶 基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征图 阿拉伯木聚糖(高黏度)和大麦葡聚糖(低黏度)刚果红琼脂平板染色法测定 酶活性 ()()、.诱导 和 的 、.诱导 和 的 .诱导前的 、.诱导 和 的毕赤酵母 )、.诱导 和 的 .图 在发酵罐中 木聚糖酶()和葡聚糖酶()的酶活性随诱导时间的变化 ()()图 不同时间发酵上清液的 .蛋白标准品.诱导、和 .的 分析及酶谱分析如图 所示:发酵上清经 在.与.出现了明显的蛋白条带由于 时在.左右有 条条带而 几乎没有酶活性因此该条带应当为非目的条带如图 所示:对 和 的摇瓶酶液和发酵罐酶液进行酶谱分析泳道 和 为摇瓶表达 和 的葡聚糖酶活性在.左右出现条带泳道 和 为发酵罐表达葡聚糖酶活性在.左右出现条带泳道 由于摇瓶中的木聚糖酶活性在 很低因此未出现条带可能由于发酵罐高密度表达后的酶活性较高也有可能是在.左右时具有 种酶活性如图 所示:对 和 的酶液进行层析纯化得到 个组分其中组分 和组分 均含有蛋白质且具有酶活性 经测定组分 具有葡聚糖酶活性组分具有木聚糖酶活性及葡聚糖酶活性组分 无蛋白质且不具有酶活性有可能是培养基的成分 对比图 与图 可以推断具有酶活性的条带如同图 所指位置分别为具有葡聚糖酶活性的条带出现在.左右和.左右均具有木聚糖酶活性的条带出现在.左右南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 的酶谱()及不同酶谱组分的()()().在摇瓶中 和 的葡聚糖酶谱 .在发酵罐中 和 的葡聚糖酶谱 .在摇瓶中 和 的木聚糖酶谱 .在发酵罐中 和 的木聚糖酶谱 .蛋白标准品 、.和 的浓缩上清液 、.和 的组分 、.和 的组分 、.和 其他酶谱组分 .酶学性质研究.的最适反应温度及温度稳定性 从图 可知:在 随着温度的升高木聚糖酶活性迅速升高在 时酶活性到达最高之后随着温度升高酶活快速下降木聚糖酶在 保持 相对酶活性均随后酶活性迅速降低 因此木聚糖酶最适温度为 并在 较稳定 在 随着温度的升高葡聚糖酶活性逐渐提高并在 时酶活性达到最高之后随着温度升高酶活性逐渐下降葡聚糖酶在各温度下保持 相对酶活性均之后酶活性迅速下降 因此葡聚糖酶最适温度为 并在 热稳定较好图 的最适温度及温度稳定性 .的最适反应 值及 稳定性 由图 可知:木聚糖酶在.时相对酶活性为.在 值.时相对酶活性均在 以上在 时相对酶活性仅为.将其在各 值下保持 在.时剩余酶活性为.在 值.时酶活性均大于 当 值升高至.时木聚糖酶的剩余酶活性仅为.因此木聚糖酶最适反应 值为.在 值.的条件下较稳定 葡聚糖酶在.的相对酶活性为.在 值.时相对酶活性均在 以上在.时相对酶活性仅为.将其在各 值下保持 在.时剩余酶活性为.在 值.时酶活性均大于 当 值升高至.时剩余酶活性仅为.因此葡聚糖酶最适反应 值为.在 值.的条件下较稳定.的底物特异性 从图 可知:木聚糖酶对 甲基葡萄糖醛酸木聚糖()的水解作用最好并以此为 对高黏度阿拉伯木聚糖()和桦木木聚糖()的水解作用也较好分别为.和.对燕麦木聚糖()的水解作用为.对对硝基苯酚木糖苷()的水解作用较弱为.葡聚糖酶对大麦低黏度葡聚糖()水解作用最好以此 第 期王蕾等:黄色瘤胃球菌双功能酶 基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征为 对大麦高黏度葡聚糖酶()具有较好的水解作用为.对地衣多糖()的水解作用较弱为.几乎不降解羧甲基纤维素()图 酶活性的最适 值及 值稳定性 图 的底物特异性 :燕麦木聚糖 :阿拉伯木聚糖(高黏度)():桦木木聚糖 :甲基葡萄糖醛酸木聚糖:对硝基苯酚木糖苷:地衣多糖:大麦葡聚糖(高黏度)():大麦葡聚糖(低黏度)():羧甲基纤维素 .图 金属离子、螯合剂及表面活性剂对 的影响 、分别表示与对照组相比差异显著(.)和差异极显著(.)(.)(.)为空白对照 、和 为螯合剂、为表面活性剂 .金属离子、螯合剂和表面活性剂对 酶活性的影响图 显示:在、和 作用下的木聚糖酶相对酶活性极显著低于对照组(.)、和 作用下木聚糖酶相对酶活性极显著高于对照组(.)和 作用下木聚糖酶相对酶活性显著低于对照组(.)、和 作用下葡聚糖酶相对酶活性极显南 京 农 业 大 学 学 报第 卷著低于对照组(.)、和 作用下葡聚糖酶相对酶活性极显著高于对照组(.)和 作用下葡聚糖酶相对酶活性显著低于对照组(.)作用下葡聚糖酶相对酶活性显著高于对照组(.)其中、和 对木聚糖酶与葡聚糖酶的相对酶活性均具有激活作用而、和 对木聚糖酶与葡聚糖酶的相对酶活性则均具有抑制作用.的动力学参数 如图 所示 以高黏度阿拉伯木聚糖为底物时酶促反应的米氏方程:/.(/).米氏常数 为.最大反应速度 为 如图 所示以大麦 葡聚糖为底物时米氏方程:/.(/).米氏常数 为.最大反应速度 为.图 以木聚糖()和 葡聚糖()为底物时酶解反应的/与/关系图 /()()讨论对基因进行密码子优化是提高异源蛋白表达水平的主要途径之一 等基于 密码子使用偏爱性对芽胞杆菌木聚糖酶基因 进行优化 含量从.提高至.酶活力提高.基因优化主要针对密码子的特性、含量及 二级结构进行 杨玉霞等将产琥珀酸丝状杆菌的 聚糖酶基因 进行密码子优化后在毕赤酵母中表达表达的重组酶活性达到 而经大肠杆菌()表达的酶活性仅为.本试验为提高黄色瘤胃球菌 基因在毕赤酵母中的表达水平(由于目前对催化模块间的连接区域功能尚不知晓因此将催化模块间的连接区域去除)经过密码子优化后 的 含量从.降低至.密码子适应指数()从.升高到.使 结构更加稳定更有利于 基因的表达在本试验中 由 个氨基酸残基组成理论分子质量.图 中所示有 条略高于理论分子质量的条带可能是由于 表达后发生了磷酸化、糖基化等翻译后修饰导致条带迁移率下降还有 条低于理论分子质量的条带可能是由于随着发酵时间的延长毕赤酵母本身产生的蛋白酶降解 所致也可能由于蛋白前体在进行加工时 蛋白酶将蛋白前体剪切导致酶蛋白分子质量降低本试验中的双功能酶由于其对木聚糖和葡聚糖均具有较高的催化效率而受到关注 李晓丽等从嗜热子囊菌()中表达了木聚糖酶和纤维素酶 双功能酶基因其中木聚糖酶和纤维素酶比活性分别为 .和.等研究的 个嵌合基因表达产物 和 具有木聚糖酶和葡聚糖酶的活性 的比活性分别为.和.的比活性分别为.和.谢晨等从黑酵母()中得到的糖苷水解酶 基因在毕赤酵母中表达以榉木木聚糖、甘蔗木聚糖和玉米芯木聚糖为底物测得比活性分别是 、和 对 的 木聚糖酶活性有一定的抑制作用而 和 的促进效果更明显 等从 菌株中表达木聚糖酶基因 并在大肠杆菌()和毕赤酵母()中表达 和 表达的木聚糖酶的比活性分别为 .和.等从氧化节杆菌 中纯化葡聚糖酶经过阴离子交换层析葡聚糖酶成功纯化了.倍比活性为.葡聚糖酶活性被、和 等金属离子显著抑制 本试验中 基因在毕赤酵母中表达后表现出木聚糖酶和葡聚糖酶的双酶活性且比活性分别达到.和 .比已报道的 第 期王蕾等:黄色瘤胃球菌双功能酶 基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征双功能酶的活性高相较于单功能酶其能达到 种酶的效果且酶活性也相对较高酶分子中的活性中心是由必需基团所组成的特定空间结构酶蛋白结构会随着环境(如 值、温度和化学试剂等)改变导致双功能酶蛋白结构变化会使其生物活性显著变化甚至完全被抑制 固态发酵时分泌的双功能木聚糖酶/内切葡聚糖酶活性在 、.和 、.条件下均表现出 种酶最佳活性且均在 值.时具有 酶活性木聚糖酶活性在 保持稳定葡聚糖酶在 下保持 酶活性 等从黄色瘤胃球菌中得到的纤维素酶 基因经大肠杆菌 表达的 在 值.和温度 下均表现出稳定的酶活性在.和 达到最适和最大酶活性 对大麦 葡聚糖显示最大酶活性()其次是地衣多糖()但对其他供试多糖均未表现出明显活性表明其具有特异性 内切葡聚糖酶活性 等从黄色瘤胃球菌得到的纤维素酶 其 端结构域具有内切葡聚糖酶活性的糖苷水解酶 家族基因 端结构域是内切甘露聚糖酶基因()将()在大肠杆菌()中表达并纯化表达产物 对刺槐豆半乳甘露聚糖酶的活性最高(.)其次是对魔芋葡甘露聚糖酶(.)和胡萝卜半乳甘露聚糖酶(.)的最适 值为.最适温度为 在 值.具有较好的稳定性在 时热稳定性较好 使其酶活提高了 王小松等将贵州木霉 几丁质酶基因 表达至大肠杆菌表达产物 在 具有较好的热稳定性但高于 时基本失去活性 本研究分别以高黏度阿拉伯木聚糖和大麦葡聚糖为底物得到双功能酶的木聚糖酶最适反应温度 、最适 值为.在温度 、值.下具有较好的稳定性葡聚糖酶最适反应温度 、最适 值为.在温度 、值.下保持良好的稳定性:证明 的适宜活性 值呈弱酸性至中性 不同菌种产生的双功能酶不同每种酶的结构存在差异因此最适条件和稳定性不同与黄色瘤胃球菌中的其他酶相比 值和温度稳定性具有一定的相似性由于基因所在位置、催化结构域以及不同的酶类型最适条件和稳定性也会存在差异 该试验中的 双功能酶在最适条件下对高黏度阿拉伯木聚糖和大麦葡聚糖的降解作用均最强其次是低黏度阿拉伯木聚糖对对硝基苯酚底物的降解活性较弱另外葡聚糖酶对羧甲基纤维素和地衣多糖无降解作用或较弱金属离子导致双功能酶活性有不同的变化、和 对 .的葡聚糖酶活性有激活作用 和 对其有抑制作用 李凌波等筛选表达了纤维素酶 基因、对内切纤维素酶活性有激活作用对外切纤维素酶活性有显著激活作用、具有抑制作用 的、三种木聚糖酶活性被 和 激活而被、和 抑制 本试验中 双功能酶活性可被、和 激活可能是离子促进了酶蛋白与底物的结合、和 抑制双功能酶活性有可能是金属离子、和 破坏了酶的空间结构使酶活性下降或者失去综上优化后的黄色瘤胃球菌双功能酶基因 在毕赤酵母中得到表达在发酵罐中表达的 的木聚糖酶与葡聚糖酶在 和 时酶活性和比活性均达到最大值分别为.、.和.、.的木聚糖酶最适反应温度和 值分别为 和.其葡聚糖酶最适反应温度和 值分别为 和.、和 对双功能酶有激活作用和 使其活性明显被抑制参考文献:.:.冯仰廉.反刍动物营养学.北京:科学出版社.:().:.():.():.().():.:.南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 ():.():.胡玮.内切()葡聚糖酶基因和 木糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达.乌鲁木齐:新疆农业大学.().:().():.郑刚王奇肖金星等.一株产胶原蛋白酶海洋菌株的筛选及鉴定.生物化工():.():().:.杨玉霞张慧玲汪艳等.产琥珀酸丝状杆菌 葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达.南京农业大学学报():.:./.():().():.李晓丽涂涛姚斌等.嗜热子囊菌 来源的双功能木聚糖/纤维素酶.生物工程学报():./.():().():.谢晨游帅张温馨等.黑酵母 家族耐热木聚糖酶的异源表达及其降解桑皮特性.蚕业科学():.():().():.:./.():.(.).():.().():.王小松马磊刘志颖等.贵州木霉 几丁质酶基因 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