环磷酸腺苷高产菌落研究-生物工程毕业论文定稿.doc

——学院
2014届本科毕业论文

论文题目：环磷酸腺苷高产菌落研究

学生姓名：——

所在院（系）：生物工程系

所学专业：生物工程专业

导师姓名：——

完成时间：2014年3月15日

环磷酸腺苷高产菌落研究
——
（——学院生物工程系104班）
摘 要
微生物发酵法合成环磷酸腺苷（cAMP）高产菌种是关键，本文采用高效液相色谱法测定不同菌落发酵液中环磷酸腺苷的含量筛选出cAMP高产菌落。通过活化不同节杆菌，挑选单菌落，分别编号1至6后移种进行发酵，发酵结束后用高效液相色谱法测定发酵液中cAMP含量,结果6号菌落发酵液中cAMP含量最高为2.8957mg/ml，其次为4号菌落，环磷酸腺苷含量为2.5057 mg/ml。本实验初步筛选出环磷酸腺苷高产菌落为6号菌落；同时也发现在实验中无菌操作是否规范、能否避免染菌是我们实验成败的关键。

关键字：环磷酸腺苷，节杆菌，发酵，高效液相

THE EFFECT OF：Using high performance liquid Cyclic adenosine phosphate high-yield strains screened
——
(—— School, Department of Biological Engineering，Class 104)
ABSTRACT
Microorganism fermentation was synthesized adenosine monophosphate (cAMP) high yield strain is the key, this paper adopts high performance liquid chromatography (HPLC) method for determining the content of central adenosine phosphate of different colonies fermented liquid screened cAMP high-yield colony. Through activation of different section, select single colony, number 1 to 6 back kind of ferment, respectively after fermentation cAMP content in the fermented liquid by high performance liquid chromatography (HPLC) method, the results 6 colonies cAMP content in the fermented liquid up to 2.8957 mg/ml, followed by colony, 4 cyclic adenosine phosphate content is 2.5057 mg/ml. This experiment preliminary screening cyclic adenosine phosphate high-yield colony for 6 colonies; Also found in the experiment of sterile operation whether standard, whether to avoid dye bacterium is key of success or failure in our experiment.
Key words: Cyclic adenosine monophosphate, Arthrobacterium ,Biological Fermentation，HPLC

目 录

1引言： 1
1.1环腺苷酸的物理化学性质和生物学功能 1
1.2环磷酸腺苷生产机制 2
2.材料与方法 3
2.1实验材料 3
2.2实验仪器 3
2.3实验方法 3
2.3.1培养基 3
2.3.2移种与接种 3
2.4高效液相检测环磷酸腺苷含量 4
2.4.1色谱测定条件 4
2.4.2样品处理 4
2.4.3标样的配制 4
2.4.4标样的线性关系 5
2.4.5标准曲线绘制 5
3.实验结果与分析 5
3.1实验结果 5
3.1.1摇瓶发酵各参数测定 5
3.1.2高效液相测定发酵液中环磷酸腺苷的含量 6
3.2结果分析及讨论 12
4结论 13
参考文献 14
致谢: 15

17

环磷酸腺苷高产菌落研究
李成喜
（新科学院生物工程系104班）
1引言：
环磷酸腺苷是核苷酸类药物, 在临床上,主要用于治疗心功能不全、心绞痛和心肌梗死, 尤其适用于对洋地黄类强心药中毒或不敏感的患者[1]。同时cAMP 是机体代谢的重要调节因子，其广泛参与酶活性调节、基因表达以及细胞增殖与分化等，因而备受关注。上个世纪五、六十年代起, 国外就陆续有文献报道环磷酸腺苷的合成。但传统的cAMP以化学合成为主，生产成本高，而且含有致癌致畸的化学残留物，不适于临床应用[2]。现在也有从大枣中提取，原料质量要求高，处理过程繁杂且cAMP回收率较低。本研究利用节杆菌通过微生物发酵生成cAMP，具有很大发展前景[3]。
环腺苷酸( Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)是由 E. W. Sutherland 于 1957最早从哺乳动物组织中发现的，并于1958年分离出环腺苷酸。Sutherland也因发现 cAMP 于 1971 年获得生理和医学诺贝尔奖[4]。之后，人们相继从植物和微生物中发现了环腺苷酸，并证明二者是生物界普遍存在的两种生物活性物质。世界各国的研究人员通过对 cAMP 大量的研究, 结果表明cAMP 在很多领域中起着重要的作用。所以 cAMP的生产和检测是十分重要而且必要的。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography ,HPLC）分析cAMP 含量不仅简便快速, 而且选择性好、准确度高。
1.1环腺苷酸的物理化学性质和生物学功能
环磷腺苷，即： 腺嘌呤核苷 - 3′，5′- 环磷酸酯, 简称cAMP，是由单核苷酸 AMP 分子中的磷酸与核糖形成 3'，5'－环式结构（见图 1）其分子式为:Cl0H12N5O6P，水合物为类白色或淡黄色结晶，微溶于水，不溶于乙醇或乙醚熔点为219 ～220 ℃(分解)，比旋度为－51.3°(C = 0.67)；它对酸、碱、热都相当稳定，是当前分子生物学研究的热点之一[3,4]。cAMP 是人体中的一种重要生物活性物质，它在细胞内外快速双向流动，细胞内产生的 cAMP 可透过细胞膜进入体液中，胞外的 cAMP可被细胞摄取。同时环磷酸腺苷酸也是细胞内传递激素和递质的中介因子，并作为第二信使参与多种生理生化过程的调节，在蛋白质的合成过程中, 基因的转录和翻译都受到 cAMP 的影响。环磷酸腺苷也可作为药物中间体制备二丁酰环磷腺苷和环磷腺苷葡甲胺，提高脂溶性，从而发挥更有效的生理及药理作用。环磷酸腺苷还可用于畜禽食品添加剂，在离体条件下模拟生长激素的作用，促进畜禽生长，增加优质禽产品产量。因此,研究工作和医学临床试验均需大量的 cAMP。

图1 环腺苷酸结构式
1.2环磷酸腺苷生产机制
环磷酸腺苷的合成主体上可分为两大类，一是通过化学法合成；二是通过生物体合成。从上个世纪五、六十年代起，一系列的化学方法被用于合成环磷酸腺苷，如：碱性水解法、活性酯类法、DCC 脱水法和三氯氧磷法[6]等。生物体合成是利用生物细胞的新陈代谢生成环磷酸腺苷。利用微生物合成cAMP，可分为发酵法，酶法。发酵法又分分段合成法和全合成法；酶法又分腺苷酸环化酶法和RNA分解法。本研究主要是利用微生物发酵法中的分段合成法，通过在含有碳源氮源的基本培养基上添加前体物质，通过培养微生物细胞获得大量的环磷酸腺苷。
微生物cAMP的生物合成途径[7]如图 2所 示。

图 2 细菌的cAMP生物合成途径与反馈调节（）
（Acase为腺苷酸环化酶；PDase为磷酸二酯酶）

cAMP的积累机制：
(1)底物的摄取；
(2)cAMP合成酶的开始；
(3)生成的cAMP 向细胞外分泌漏出。
2.材料与方法
2.1实验材料
实验室存放活化后的节杆菌斜面。
2.2实验仪器
超净工作台、恒温培养箱、回转式摇床、离心机、立式灭菌锅、还原糖自动测定仪、高效液相色谱仪、平板式加热器、双筒显微镜、培养皿、pH试纸、试管、移液管、酒精灯、吸耳球、烧杯、量筒、玻璃棒
2.3实验方法
2.3.1培养基
种子培养基 ：葡萄糖2%，蛋白陈1%，酵母膏5% ，pH 7.0 [7,8]；
种子培养基的配制：称取4.0g葡萄糖，2.0g蛋白胨，10.0g酵母膏，溶于200ml蒸馏水中，调ph至7.0后分装于6个250ml的三角瓶中，再用8层纱布和双层报纸包扎瓶口灭菌备用。
发酵培养基：葡萄糖5%， KH2PO41%， K2HPO41%， ZnSO4·7H2O 0.01%，蛋白胨1%， 酵母膏0.5%， 次黄嘌呤0.3%[7,8,9]；
发酵培养基的配制：称取30g葡萄糖，6g KH2PO4，6gK2HPO4，0.06g ZnSO4·7H2O，6g蛋白胨，3g酵母膏，1.8g次黄嘌呤，溶于600ml蒸馏水中，为了加快磷酸盐的溶解可适当加热，完全溶解后调ph至7.5后分装于18个250ml的三角瓶中，每瓶30ml，用8层纱布和双层报纸包扎瓶口，并包6支5ml移液管与发酵培养基一起灭菌备用。
2.3.2移种与接种
将活化后的斜面种子移种至种子培养基8层纱布包扎三角瓶口28℃恒温摇瓶震荡培养18小时以上，再接种至发酵培养基，接种量10% (V/V)[7]， 8层纱布包扎三角瓶口30℃恒温摇瓶震荡培养72以上小时。
移种：超净工作台紫外照射30分钟至1小时，关紫外灯开照明灯，开鼓风机。挑选6个长势较好的不同菌落分别进行移种,每个菌落移种一个发酵瓶.具体操作如下:左手持活化试管，并将三角瓶封口解开，放置酒精灯火焰附近。右手取接种环在火焰上灼烧灭菌、伸入斜面试管内部冷却。用接种环轻轻划取斜面上的菌苔，再伸入三角瓶种子培养液轻轻搅动使菌体溶到培养液中；重复 2到3次。移种完成后将三角瓶瓶口外层的2层报纸弃去，直接用8层纱布包扎，但不要污染瓶口处纱布。从超净工作台中取出种子培养瓶后28℃恒温摇瓶震荡培养18小时以上，待生长到对数生长后期时移种至发酵培养液中。
接种：超净工作台准备如移种方法。在超净工作台中解开封口，每瓶种子液接种3瓶发酵样瓶，分别编号11至13，21至23，31至33，41至43，51至53，61至63 并用记号笔做好标记。用移液管吸取3ml种子液分别接种到已编号的发酵样瓶，同样弃去封瓶口的上层的2层报纸，在不污染瓶口纱布的情况下包扎瓶口后30℃恒温摇瓶震荡培养72小时以上。
2.4高效液相检测环磷酸腺苷含量
2.4.1色谱测定条件
柱温为室温；柱压：19.11 MPa；流速：1 mL/min；波长：254 nm；进样量：20μL；色谱柱：SinoChrom ODS- BP 5 μm；柱长：150×4.6 mm。[4,5]
流动相为V(甲醇) : V(磷酸溶液) =25:75；磷酸溶液浓度为0.6%。流动相中只包含甲醇和磷酸溶液。将配置好的流动相加热至70度左右，根据需要选择0.45μm的滤膜，然后对流动相进行抽滤。抽滤后对流动相进行超声脱气10至20分钟，备用[10,11]。
2.4.2样品处理
发酵结束后得到的发酵液用5ml移液管移取3ml于3ml离心管中，每次移取发酵液时要用待移发酵液润洗2至3次。离心管在5000转每分钟下离心15分钟。离心结束后取上层清液，再经0.45μm针式虑头过滤后待测。
2.4.3标样的配制
精密称取cAMP标准品 1000mg，用去离子水溶解并定容至100ml容量瓶中，即得到环腺苷酸标准品溶液，浓度为10mg/ml。精密称量次黄嘌呤标准品54mg，用去离子水溶解定容与100ml容量瓶中，得到次黄嘌呤标准溶液,浓度为0.54mg/ml。[3,11]
2.4.4标样的线性关系
精密吸取cAMP标准液1ml、2ml、4ml、8ml、16ml、32ml分别定溶于50ml容量瓶中配制成0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4mg/ml六份标准液，在上述色谱条件下进样20μl[4,5]，记录色谱峰面积。环磷酸腺苷和次黄嘌呤的高效液相扫描图谱如3.1.2中图4，图5所示。在0.2mg/ml至6.4mg/ml浓度范围内，色谱峰面积与样品中环磷酸腺苷含量线性关系良好，线性关系图如2.4.3中图3所示。
2.4.5标准曲线绘制
照2.3.1色谱条件，将处理好的样品溶液与标准品溶液放入自动进样器分别进行扫描测定其峰面积。以峰面积为横坐标，浓度（mg/mL）纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，y = 22948.598x - 1475339.6，R² = 0.9979。标准曲线见图3，样品扫描结果见3.1.2。

图3 环腺苷酸标准曲线

3.实验结果与分析
3.1实验结果
3.1.1摇瓶发酵各参数测定
发酵结束后，按编号排好发酵瓶进行参数测定。
第一步：用50ml量筒量取各个发酵瓶中发酵液体积，做好记录。
第二步：用玻璃棒蘸去适量发酵液，滴在5.0至9.0量程的ph试纸上30秒内与标准比色卡对比测定ph，做好记录。
第三步：用5ml移液管移取3ml发酵液于3ml离心管中5000转每分钟，离心15分钟。用移液管移取发酵液前，先用待移发酵液润洗2到3次。
第四步：取上层清液适量按上述色谱测定条件进样做高效液相测定。
第五步：取上层清液适量于还原糖自动测定仪中测定发酵液中剩余还原糖的残糖量，做好记录。结果如表1。

表1 摇瓶发酵体积、pH、残糖结果
编号
发酵液体积（ml）
Ph
残糖量
11
27
6.7
2.678
12
26
5.5
0
13
26.5
6.7
2.645
21
27
6.7
2.828
22
29
6.7
2.947
23
28
6.7
2.863
31
27
7.0
2.968
32
24
6.7
3.028
33
27
5.5
0
41
27
6.7
2.600
42
26.5
6.7
2.540
43
28
6.7
2.642
51
29
6.7
2.701
52
29
6.7
2.722
53
27
6.7
2.712
61
29
6.7
1.571
62
28
6.7
2.247
63
25
6.7
2.216
3.1.2高效液相测定发酵液中环磷酸腺苷的含量
环磷酸腺苷标准品高效液相图如图 4 ，次黄嘌呤标准品的高效液相图如图 5

图4 环腺苷酸标准品的高效液相图
图5 次黄嘌呤标准品的高效液相图
不同菌落发酵液样品高效液相图谱如图6至图23所示。

图6 菌落11高效液相图

图7 菌落12高效液相图

图8 菌落13高效液相图

图9 菌落21高效液相图

图10 菌落22高效液相图

图11 菌落23高效液相图

图12 菌落31高效液相图

图13 菌落32高效液相图
图14 菌落33高效液相图

图15 菌落41高效液相图

图16 菌落42高效液相图

图17 菌落43高效液相图

图18 菌落51高效液相图

图19 菌落52高效液相图

图20菌落53高效液相图

图21 菌落61高效液相图

图22 菌落62高效液相图

图23 菌落63高效液相图
由高效液相图分析得到各编号发酵液中环腺苷酸的含量如表2

表2 发酵液中cAMP含量
编号
cAMP含量（mg/ml)
11
2.249
12
0.406
13
2.344
21
1.640
22
1.338
23
1.418
31
0.591
32
0.557
33
0.547
41
2.530
42
2.583
43
2.404
51
1.995
52
1.765
53
1.980
61
3.018
62
2.729
63
2.940
菌落1至6发酵液环磷酸腺苷的平均含量如表3所示
表3 环磷酸腺苷平均含量
菌落编号
环磷酸腺苷平均含量(mg/ml)
菌落1
2.2965
菌落2
1.4653
菌落3
0.574
菌落4
2.5057
菌落5
1.9133
菌落6
2.8957
3.2结果分析及讨论
由3.1.2中不同菌落发酵液样品高效液相图6至图23分别与图4环磷酸腺苷、图5次黄嘌呤的标样图进行对比可以看出, 发酵液中产生的两个吸收峰与标样图的吸收峰几乎在同一位置，说明发酵液中由微生物合成了一定量的环磷酸腺苷，同时也说明了发酵液中有一定量的次黄嘌呤残余。在发酵培养基的配制中添加了0.3%的次黄嘌呤，由于微生物是将次黄嘌呤作为中间物进行代谢利用，而不是作为碳源、氮源，所以需求量少。因此在发酵液中有一定量的次黄嘌呤残余是正常情况。将各发酵液的高效液相图中cAMP的波峰面积算出，再利用2.2.4中的标准曲线求得发酵样品中环磷酸腺苷的含量。最后得到的各发酵样品中cAMP含量如3.2.1中表1所示。
由表1 测定结果可以看出编号12和编号33的发酵瓶有些异常，ph和还原糖的残糖量都异于其他编号。这两瓶发酵液中还原糖的残余量为零，涂片后显微镜观察发现有其他非棒状杆菌和少量棒状杆菌，由此断定染菌，认定这两瓶发酵失败。在计算菌落环磷酸腺苷的平均值时，编号12和编号23的cAMP含量值不计算在内。其他各瓶发酵液ph基本一致，均含有少量还原糖，发酵状况认为正常。由表2 所得各瓶发酵液中环腺苷酸的含量对比发现还原糖的残糖量越低，则发酵液中环腺苷酸cAMP的含量越高。
根据表3不同菌落发酵液中cAMP平均含量的计算结果，发现编号为6的菌落的发酵液中cAMP的平均含量最高为2.8957mg/ml，其次为菌落4环磷酸腺苷的平均含量为2.5057 mg/ml，平均含量最低的是菌落3含量为0.574mg/ml。不同的菌落生产环磷酸腺苷的能力差别较大，同一菌落的不同发酵样瓶中环磷酸腺苷的含量也不尽相同。初步分析主要原因有两个，一是用于实验的菌落可能只达到菌落纯，未达到菌株纯；二是可能由于实验过程中偶然的外界因素对单个发酵瓶产生了影响。若对菌落6进一步进行纯种分离纯化实验，规范实验操作定能筛选出环磷酸腺苷高产菌株。
染菌分析：由于各发酵培养基是一起进行高压真气灭菌，只有两瓶发酵失败，推断培养基灭菌是彻底的，染菌可能是在进行发酵接种时污染杂菌。在今后的无菌操作时，要特别加以小心注意。
微生物发酵染菌是发酵过程中比较重要的问题，如何避免染菌是发酵成败的关键。可从以下几方面给于避免：一、确定种子不带杂菌，从而可从源头上避免杂菌污染；二、培养基灭菌要彻底，一般采用高压蒸汽121℃，15分钟到20分钟；三、在种子液进行移种和接种时的无菌操作要规范，通常在超净工作台中进行，发酵瓶瓶口要靠近酒精灯火焰；四、接种过程瓶口不要对着风屏，尽可能是与风向平行，超净工作台中鼓风机的采风口要保持清洁卫生，避免鼓入空气带菌。
4结论
国内外目前生产cAMP多数是用腺苷和 5′- 腺苷酸作为起始原料合成环磷腺苷。以化学合成为主，操作复杂，溶剂损耗量大，收率低成本高，产量小，而且含有致癌致畸的化学残留物，不适于临床应用。现也有人研究从大枣中提取环腺苷酸，但限于原料质量要求高，处理过程繁杂且cAMP回收率较低不易推广。通过本次试验，初步说明环腺苷酸的生产除了通过化学合成和从生物细胞中提取外，还可以利用微生物发酵进行生产。通过初筛获得高产菌落6和菌落4，若能进一步对菌落进行分离纯化定能筛选出高产稳定的纯菌株。将环腺苷酸的生产与生物技术相结合，从而可以使环腺苷酸的生产周期短，分离提纯容易，产品具有无化学残留污染的优点，具有广阔的发展前景。

参考文献
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[11] 王 荔，亓树艳，莫晓燕.大枣环磷酸腺苷提取纯化工艺的初步研究.食品科技.提取物与应用.2012, 西安交通大学生命科学与技术学院

致谢:
经过近两个月的实验和整理论文，毕业设计即将结束，同时也标志着我的大学生活即将接近尾声。
大学四年来在老师和同学们的帮助下，我努力学习掌握各种专业知识以及培养自己各方面的能力，尽自己的能力完成了我的学业。这次的毕业设计是一次交流和学习的机会，整个实验和论文整理过程是一个不断学习、不断提高自己、积累自己经验的过程，我从中学到了很多新知识，更培养了自己的信心和毅力。在今后的工作和学习中，我会继续发扬这段时间各项好的习惯和作风，努力做好以后的每一项工作。
本文是在——师的悉心指导下完成的，在跟随常老师做实验期间从她身上我学到的不仅仅是知识和实验技能的操作,更多的是做人为事的道理。常老师治学严谨,要求严格，为人和蔼,对我今后的学习工作都有很大帮助，同时在完成本实验时也得到了康老师和实验室其他老师在实验试剂、实验药品、实验仪器和实验操作等方面提供的帮助和指导，及试验组全体同学的协助，在此一并表示衷心的感谢！

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56. 基于单片机的多通道数据采集系统
57. 基于uPSD3234单片机的氚表面污染测量仪的研制
58. 基于单片机的红外测油仪的研究
59. 96系列单片机仿真器研究与设计
60. 基于单片机的单晶金刚石刀具刃磨设备的数控改造
61. 基于单片机的温度智能控制系统的设计与实现
62. 基于MSP430单片机的电梯门机控制器的研制
63. 基于单片机的气体测漏仪的研究
64. 基于三菱M16C/6N系列单片机的CAN/USB协议转换器
65. 基于单片机和DSP的变压器油色谱在线监测技术研究
66. 基于单片机的膛壁温度报警系统设计
67. 基于AVR单片机的低压无功补偿控制器的设计
68. 基于单片机船舶电力推进电机监测系统
69. 基于单片机网络的振动信号的采集系统
70. 基于单片机的大容量数据存储技术的应用研究
71. 基于单片机的叠图机研究与教学方法实践
72. 基于单片机嵌入式Web服务器技术的研究及实现
73. 基于AT89S52单片机的通用数据采集系统
74. 基于单片机的多道脉冲幅度分析仪研究
75. 机器人旋转电弧传感角焊缝跟踪单片机控制系统
76. 基于单片机的控制系统在PLC虚拟教学实验中的应用研究
77. 基于单片机系统的网络通信研究与应用
78. 基于PIC16F877单片机的莫尔斯码自动译码系统设计与研究
79. 基于单片机的模糊控制器在工业电阻炉上的应用研究
80. 基于双单片机冲床数控系统的研究与开发
81. 基于Cygnal单片机的μC/OS-Ⅱ的研究
82. 基于单片机的一体化智能差示扫描量热仪系统研究
83. 基于TCP/IP协议的单片机与Internet互联的研究与实现
84. 变频调速液压电梯单片机控制器的研究
85. 基于单片机γ-免疫计数器自动换样功能的研究与实现
86. 基于单片机的倒立摆控制系统设计与实现
87. 单片机嵌入式以太网防盗报警系统
88. 基于51单片机的嵌入式Internet系统的设计与实现
89. 单片机监测系统在挤压机上的应用
90. MSP430单片机在智能水表系统上的研究与应用
91. 基于单片机的嵌入式系统中TCP/IP协议栈的实现与应用
92. 单片机在高楼恒压供水系统中的应用
93. 基于ATmega16单片机的流量控制器的开发
94. 基于MSP430单片机的远程抄表系统及智能网络水表的设计
95. 基于MSP430单片机具有数据存储与回放功能的嵌入式电子血压计的设计
96. 基于单片机的氨分解率检测系统的研究与开发
97. 锅炉的单片机控制系统
98. 基于单片机控制的电磁振动式播种控制系统的设计
99. 基于单片机技术的WDR-01型聚氨酯导热系数测试仪的研制
100. 一种RISC结构8位单片机的设计与实现
101. 基于单片机的公寓用电智能管理系统设计
102. 基于单片机的温度测控系统在温室大棚中的设计与实现
103. 基于MSP430单片机的数字化超声电源的研制
104. 基于ADμC841单片机的防爆软起动综合控制器的研究
105. 基于单片机控制的井下低爆综合保护系统的设计
106. 基于单片机的空调器故障诊断系统的设计研究
107. 单片机实现的寻呼机编码器
108. 单片机实现的鲁棒MRACS及其在液压系统中的应用研究
109. 自适应控制的单片机实现方法及基上隅角瓦斯积聚处理中的应用研究
110. 基于单片机的锅炉智能控制器的设计与研究
111. 超精密机床床身隔振的单片机主动控制
112. PIC单片机在空调中的应用
113. 单片机控制力矩加载控制系统的研究
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