基于NF-κB信号通路探讨芍药苷对黏蛋白5AC分泌的调控作用.pdf

张艳等 基于NF-B信号通路探讨芍药苷对黏蛋白5AC分泌的调控作用 第 8 期基于NF-B信号通路探讨芍药苷对黏蛋白5AC分泌的调控作用张艳 桑亚洲 彭梦薇 陈玉龙 刘燕 张文娴 吴耀松（河南中医药大学，河南省中医方证信号传导重点实验室，河南省中西医结合防治脑认知疾病工程技术研究中心，郑州市中西医结合防治脑认知疾病重点实验室，郑州 450046）中图分类号 R392 文献标志码 A 文章编号 1000-484X（2023）08-1653-07摘要 目的：基于NF-B信号通路探讨芍药苷调控气道黏蛋白5AC（MUC5AC）合成与分泌的影响及作用机制。方法：体内通过烟熏和慢性感染相结合的方法复制慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性加重期大鼠模型，体外通过IL-1诱导人气道上皮H292细胞建立炎症模型，设置空白组、模型对照组、NF-B通路抑制剂组（PDTC组）、芍药苷组。采用动物肺功能测量仪检测大鼠肺功能；ELISA检测大鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）、血清以及细胞上清中MUC5AC以及炎症因子IL-8、TNF-表达水平；免疫印迹试验检测细胞P65、核因子B抑制蛋白（IB）蛋白表达水平；反转录实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）检测各组细胞MUC5AC mRNA、囊性纤维化跨膜转导调节因子（CFTR）mRNA表达水平。结果：与空白组比较，模型对照组大鼠呼吸频率（f）、呼气峰流值（PEF）、潮气量（VT）、呼吸阻力（Rin）均显示有明显差异有统计学意义（P0.05）；与模型对照组比较，PDTC组、芍药苷组大鼠PEF、VT、Rin有明显改善（P0.05），PDTC组呼吸频率（f）明显降低（P0.05）；与空白组比较，模型对照组大鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）、血清以及细胞上清中MUC5AC、IL-8、TNF-含量均明显增加（P0.05），体外模型组细胞中P65蛋白和MUC5AC mRNA表达升高（P0.05），IB蛋白降低（P0.05）；与模型组比较，PDTC组、芍药苷组大鼠中BALF、血清及细胞上清中MUC5AC、IL-8、TNF-含量均明显降低（P0.05），且PDTC组、芍药苷高低剂量组的细胞中IB蛋白和MUC5AC mRNA表达升高（P0.05），P65蛋白和CFTR mRNA表达降低（P0.05）。结论：芍药苷可改善COPD急性加重期大鼠模型的肺功能，减轻气道炎症反应，其机制与抑制NF-B信号通路活性，降低气道细胞炎症因子分泌量以及调控MUC5AC mRNA、CTFR mRNA和相关蛋白的表达有关。关键词 芍药苷；MUC5AC；炎症因子；人气道上皮H292细胞；NF-BRegulatory effect of paeoniflorin on mucin 5AC secretion based on NF-B signaling pathwayZHANG Yan，SANG Yazhou，PENG Mengwei，CHEN Yulong，LIU Yan，ZHANG Wenxian，WU Yaosong.Henan University of Chinese Medicine，Henan Key Laboratory of TCM Prescription and Syndrome Signaling，Henan Pro-vince Engineering Technology Research Center for Chinese and Western Integrative Prevention and Treatment of Brain Cognitive Disease，Zhengzhou Key Laboratory for Chinese&Western Integrative Prevention and Treatment of Brain Cognitive Disease，Zhengzhou 450046，ChinaAbstract Objective：To explore the regulatory effect of paeoniflorin on mucin 5AC（MUC5AC）secretion based on NF-B signaling pathway.Methods：In vivo experiments used a combination of smoke stimulation and chronic infection to replicate the acute exacerbation of COPD rat model，and in vitro experiments used IL-1 to induce human airway epithelial H292 cells to establish an inflammatory hypersecretion model.The experiments included control group，model group，NF-B pathway inhibitor（PDTC）group，and paeoniflorin group.The pulmonary function of rats in each group was detected by an animal lung function measuring instrument；the expression level of MUC5AC，TNF-and the inflammatory factor IL-8 in the bronchoalveolar lavage fluid（BALF），serum and cell supernatant of each group were detected by ELISA.The expression levels of P65 and inhibitor of nuclear factor B（IB）in each group were detected by Western blot test；the expression of MUC5AC mRNA and cystic fibrosis transmembrane transduction regulator（CFTR）mRNA were detected by reverse transcription real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）.Results：Compared with control group，there were significant differences in respiratory frequency（f），peak expiratory flow（PEF），tidal volume doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.08.016本文为国家自然科学基金项目（81503490，81873285）；河南省科技攻关项目（192102310160，182102310296）。作者简介：张 艳，女，在读硕士，主要从事中西医结合基础研究，E-mail：T。通信作者及指导教师：吴耀松，女，硕士，教授，硕士生导师，主要从事中西医结合基础与中医肿瘤方证研究，E-mail：。1653中国免疫学杂志2023 年第 39 卷（VT）and respiratory resistance（Rin）in model group（P0.05）.Compared with model group，the PEF，VT and Rin of rats in the PDTC group and paeoniflorin group were significantly improved（P0.05），and at the same time the f in PDTC group was significantly reduced（P0.05）.Compared with control group，the contents of MUC5AC，IL-8 and TNF-in the bronchoalveolar lavage fluid（BALF），serum and cell supernatant of model group increased significantly（P0.05），and the expression of P65 protein and MUC5AC mRNA increased significantly（P0.05）.However，the IB protein decreased significantly（P0.05）.Compared with model group，the contents of MUC5AC，IL-8 and TNF-in BALF，serum and cell supernatant of rats in paeoniflorin group and PDTC group were reduced significantly（P0.05），and the expression of IB protein and CFTR mRNA in PDTC group，high and low dose groups of paeoniflorin increased significantly（P0.05），and the expression of P65 protein，MUC5AC mRNA decreased significantly（P0.05）.Conclusion：Paeoniflorin can improve pulmonary function and reduce airway inflammation of rats in acute exacerbation of COPD，and the mechanism may be related to inhibiting the activity of NF-B signaling pathway，reducing the secretion of inflammatory factors in airway cells，and regulating the expressions of MUC5AC mRNA，CTFR mRNA and related proteins.Key words Paeoniflorin；MUC5AC；Inflammatory factors；Human airway epithelial H292 cells；NF-B目前研究认为，气道上皮细胞通过胞吐作用将黏蛋白释放到气道内腔中，与气道中水和离子等相互作用形成黏液，因此黏液中包含了不同种类的分泌物，但其主要成分包括水、电解质及黏蛋白等有机成分1，目前已有21种黏蛋白在人类基因组中被识别，黏蛋白 5AC（mucin 5AC，MUC5AC）作为气道黏蛋白中最为重要的一种，受到了广泛关注。在病理情况下，黏液分泌过多或清除能力受损，多种病原体以及气道炎症反应可引起黏液高分泌、组分和理化性质改变，导致气道痰多难以清除，引发气道阻塞和感染，进一步导致常见肺部疾病的发生，包括慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、哮喘、特发性肺纤维化、囊性纤维化、支气管扩张等2-4。这些疾病的病理生理改变都与MUC5AC密切相关，因此有针对性地靶向清除黏液分泌成为治疗呼吸系统疾病的重点，而现代临床多采用减少黏蛋白分泌量、促进黏液清除、治疗气道感染等方法来改善这种病理状态5-6。中医学认为气道黏液高分泌主要病机是痰饮伏肺，中药芍药具有柔肝活血、缓急利水之功效，是中医治疗痰多、咳喘常用药物之一7。芍药苷是其主要有效成分，研究表明芍药苷可通过抑制NF-B信号通路来发挥抗炎作用8-9。在哮喘模型小鼠中，芍药苷可抑制气道炎症趋化因子表达，有效干预小鼠血清中IL-6、TNF-水平10。另外，在COPD大鼠模型中，芍药苷抑制炎症因子表达，可有效减轻COPD大鼠氧化应激状态，其作用机制也与 NF-B信号通路有关11-12。可见，芍药苷在多项研究中具有改善呼吸系统疾病症状的作用，可有效治疗痰多、咳嗽等症状、降低炎症因子水平。但涉及与炎症相关的黏液分泌报道较少，芍药苷是否可有效降低炎症环境下气道上皮细胞黏蛋白的分泌进而发挥治疗肺系疾病的作用有待进一步研究。因此，本研究基于NF-B信号通路，一方面从体内途径探讨芍药苷对COPD急性加重期大鼠模型肺功能和黏液分泌的治疗作用，一方面从体外途径探讨芍药苷对人气道上皮H292细胞炎症反应和MUC5AC分泌的影响，为临床使用化痰药物治疗黏液分泌过多导致的呼吸疾病提供依据。1 材料与方法 1.1材料1.1.1实验动物及饲养100 只 SD 健康大鼠（No.37009200012342），SPF 级，雌雄各半，34 月龄，体质量200220 g，由山东省实验动物中心提供，合格证：SCXK（鲁）20140007。动物房温度25，湿度50%，氨浓度20 ppm，气流速度为15 cm/s，换气频率10次/h。1.1.2细胞人气道上皮H292细胞（ATCCCRL-1848TM）购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。1.1.3试剂及耗材肺炎克雷伯杆菌（菌株号：46116），由中国食品药品检定研究院中国医学细菌保藏管理中心提供。用前将细菌浓度调整为 6108 CFU/ml。香烟（红旗渠，由河南安阳卷烟厂提供，焦油量：14 mg，烟气烟碱量：12 mg，烟气一氧化碳量：15 mg）；芍药苷（四川曼思特，批号：MUST-18032901）；IL-1（PEPROTECH 公 司，批 号：0103b95R1）；胎牛血清（GEMINI，批号：A25F00H）；1640 培养基、胰蛋白酶消化液、RIPA 高效裂解液（Solarbio公司，批号：20161229、20160914、20170407）；MUC5AC ELISA 试剂盒（Cloud-clone Corp 公司，批号：L170113570）；IL-8 ELISA试剂盒、TNF-ELISA试剂盒（博士德生物，13410811028、EK0525）；IB抗体、P65抗体（Abcam公司，ab32518、ab32536）；超纯RNA 提取试剂盒（索博莱公司，批号：40267142）；1654张艳等 基于NF-B信号通路探讨芍药苷对黏蛋白5AC分泌的调控作用 第 8 期cDNA 第一链合成试剂盒（Tiangen 公司，批号：P5024）；MUC5AC、CFTR、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物（南京金瑞斯公司，批号：F08913）；Trizol总RNA抽提试剂（美国Invitrogen公司，批号：D14218-02）。1.1.4仪器设备二氧化碳培养箱（德国 Eppendorf 公司，CO170R-230-1000）；荧光倒置显微镜（Nikon公司，Ts2）；低速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司，L530）；电泳仪（Tanon，VE-186）；全能型凝胶成像系统（Bio-Rad，Universal Hood）；实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司，Step One Plus TM Real-Time PCR System）；无束缚小动物肺功能测量仪（Buxco，美国）。1.2方法1.2.1动物模型复制以烟熏和慢性感染相结合的 方 法13，经 鼻 注 入 肺 炎 克 雷 伯 杆 菌 菌 液 6 108 CFU/ml，0.1 ml，1次/5 d，持续12周；第12周熏烟量 8支/次，2次/d，每次 30 min；第 312周 15支/次，烟雾经导管进入300 L烟熏箱内，3次/d，30 min/次；第13周的第4天经鼻滴入181016 CFU/ml肺炎克雷伯杆菌菌液，2次/d，0.3 ml/次，连续4 d，复制COPD急性加重期大鼠痰湿证模型。1.2.2实验动物分组及用药大鼠分为正常组（腹腔注射生理盐水）、模型组，模型组又分为模型对照组（腹腔注射生理盐水）、抑制剂组 腹腔注射PDTC，剂量为：100 mg/（kg d）、芍药苷组 腹腔注射芍药苷，剂量为：25 mg/（kg d），1次/d，注射体积为 2 ml），第 14 周开始用药，用药1周后取材。1.2.3肺功能测定所有组别动物用药1周后，测量大鼠无创肺功能，检指标包括：呼吸频率（f）、每分通气量（MV）、呼气峰流值（PEF）、潮气量（VT）、呼吸阻力（Rin）。1.2.4采用 ELISA 检测 BALF 和血清中 MUC5AC以及炎症因子表达将大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（剂量40 mg/kg），麻醉后，腹主动脉取血，离心收集上清，另外以0.9%生理盐水3 ml灌洗左肺，收集支气管灌洗液，ELISA法检测血清和支气管灌洗液中MUC5AC、IL-1、TNF-的含量。1.2.5H292 细胞培养与建立 IL-1 诱导的 H292 细胞炎症模型将人气道上皮肺癌细胞H292放在含 10%胎牛血清的 1640 培养基中，置于湿度为95%，温度为37、5%CO2培养箱中培养，模型筛选参考文献 14。1.2.6ELISA法检测芍药苷对IL-1诱导H292细胞分泌MUC5AC、IL-8、TNF-的影响取对数生长期 H292 细胞接种于 6 孔培养板，每孔接种细胞 5105个，待细胞完全贴壁后抽去培养基，设正常组、模型组（IL-1）、NF-B抑制剂组（100 mol/L）、芍药苷高中低剂量组（50、25、12.25 g/ml），每组设置 4个重复样本，各组在加入含药培养基干预4 h后加入IL-1（5 ng/ml）作用24 h，然后收集细胞和细胞上清，并将细胞用超声波破碎离心后，取上清。ELISA法检测各溶液中黏蛋白MUC5AC、IL-8、TNF-的含量，计算MUC5AC胞外分泌量占胞外与胞内分泌总量百分比。1.2.7Western blot 法检测芍药苷对 IL-1 诱导H292细胞P65、IB蛋白表达的影响细胞前期处理同上。使用 RIPA 高效裂解液处理细胞提取蛋白，BCA法进行蛋白浓度定量，分别制备10%分离胶和5%浓缩胶进行上样电泳，先采用80 V电压电泳30 min，使蛋白浓缩，然后再采用100 V电压电泳80 min，使蛋白分离，电泳完成后进行转膜，然后使用脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗（按1 500稀释），孵育过夜（4 条件下），加入二抗（1 2 000稀释）孵育1 h（常温条件下），显影后用凝胶成像系统拍照并进行条带的分析和处理。1.2.8PCR 法检测 IL-1 对 H292 细胞 MUC5ACmRNA、CFTR mRNA表达的影响细胞前期的处理方法同上，应用Trizol法提取组织RNA，测量RNA浓度和纯度，逆转录后进行qPCR扩增，PCR扩增引物及内参序列见表1，目的基因的相对表达倍数改变采用2Ct计算。1.3统计学分析采用SPSS21.0软件对相关数据进行统计分析。首先对数据进行正态分布检验，符合正态分布者组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布者进行转化后比较，结果以x s进行描述。P0.05表示差异有统计学意义。表1PCR扩增引物及内参序列Tab.1PCR amplification primer and internal reference sequenceGenesGAPDHMUC5ACCFTRPrimer sequence（5-3）F：AGAAGGCTGGGGCTCATTTGR：AGGGGCCATCCATCCACAGTCTTCF：ACCTGTGACAGCAGGATGTGR：ACTCGCAGTCTCCGTTGAAGF：GAGAAAAAGGGTTGAGCGGCR：5TCTTTCCGAAGCTCGGTTGG1655中国免疫学杂志2023 年第 39 卷2 结果 2.1芍药苷对大鼠肺功能的影响如表2所示，与空白组比较，COPD模型对照组大鼠f、PEF、VT、Rin差异均有统计学意义（P0.05）；与模型对照组比较，抑制剂组、芍药苷组大鼠PEF、VT、Rin有明显改善（P0.05），抑制剂组f明显降低（P0.05）。2.2芍药苷对大鼠 BALF 和血清中 MUC5AC、IL-1、TNF-的影响如表3所示，与空白组比较，模型对照组大鼠 BALF 和血清中 MUC5AC、IL-1、TNF-含量均明显增加（P0.05），与模型对照组比较，抑 制 剂 组、芍 药 苷 组 大 鼠 BALF 和 血 清 中MUC5AC、IL-1、TNF-含量均明显降低（P0.05）。2.3芍药苷对 H292 细胞模型黏蛋白 MUC5AC 及炎症因子IL-8、TNF-分泌的影响与空白组比较，模型组上清和胞内的MUC5AC分泌量均明显增多（P0.05）；与模型组比较，各用药组上清和胞内分泌的MUC5AC均明显降低（P0.05）；与芍药苷高剂量组比较，低剂量组胞内的MUC5AC分泌量差异有统计学意义（P0.05）；各组上清中MUC5AC的分泌量占总分泌量的百分率均超过50%，见表4。与空白组比较，模型组中IL-8与TNF-均有明显升高（P0.05）；与模型组比较，用药各组的 IL-8与TNF-的分泌量均降低，差异有统计学意义（P0.05）；与抑制剂组比较，芍药苷高剂量组两者均明显降低（P0.05）；与芍药苷高剂量比较，低剂量组中IL-8的分泌量明显降低（P0.05），中浓度组差异无统计学意义。结果见表5。从以上组间比较结果中，选择芍药苷高低两个浓度进行后续实验。2.4芍药苷对IL-1干预下H292细胞P65、IB蛋白表达的影响与空白组比较，模型组IB蛋白表达降低、P65 蛋白表达升高（P0.05）；与模型组比较，各用药组 IB 表达升高、P65 表达降低（P0.05）；与抑制剂组比较，芍药苷高剂量组P65降低（P0.05）；与芍药苷高剂量组比较，低剂量组中P65表3芍药苷对大鼠BALF和血清中MUC5AC和炎症因子的影响（x s，n=8，pg/ml）Tab.3Effects of paeoniflorin on MUC5AC and inflammatory factors in BALF and serum of rats（x s，n=8，pg/ml）GroupsControl Model PDTC PaeoniflorinBALFMUC5AC5.120.466.690.601）1.900.742）2.660.302）IL-136.023.6151.945.701）11.482.092）23.842.912）TNF-16.061.5018.091.891）15.111.462）16.081.532）SerumMUC5AC22.482.9934.573.651）21.792.322）21.992.322）IL-1555.1458.32603.7057.001）117.2017.612）355.8136.472）TNF-106.2410.11207.2620.021）116.2811.032）168.2417.082）Note：Compared with control group，1）P0.05；compared with model group，2）P0.05.表2用药后大鼠无创肺功能结果（x s，n=8）Tab.2Results of non-invasive pulmonary function in rats（x s，n=8）GroupsControl Model PDTC Paeoniflorinf300.6528.27369.9433.561）304.2429.892）368.3633.24MV/ml697.3666.36634.5760.85679.9561.25670.2663.85PEF/（ml s1）37.573.6725.342.051）31.852.922）30.562.952）VT/ml4.110.321.890.111）3.430.292）2.560.192）Rin/mmHg37.283.2265.985.891）38.123.452）56.675.212）Note：Compared with control group，1）P0.05；compared with model group，2）P0.05.表4芍药苷对 H292 细胞上清和胞内 MUC5AC 分泌的 影响（x s，n=4，pg/ml）Tab.4Effect of paeoniflorin on supernatant and intracellular MUC5AC secretion of H292 cells（x s，n=4，pg/ml）GroupsControl Model PDTC High dose paeoniflorinMedium dose paeoniflorinLow dose paeoniflorinMUC5ACSupernatant 1 332.74113.252 531.9487.771）1 413.8655.012）1 218.63123.162）1 367.98107.562）1 487.95108.462）Intracellular 929.7847.031 217.5780.771）902.3768.902）984.9664.532）1 008.33100.512）1 055.7525.952）3）Percentage/%58.9167.5361.0455.3057.5758.50Note：Compared with control group，1）P0.05；compared with model group，2）P0.05；compared with high dose paeoniflorin group，3）P0.05.1656张艳等 基于NF-B信号通路探讨芍药苷对黏蛋白5AC分泌的调控作用 第 8 期表达明显升高（P0.05），IB表达有下降趋势，但差异无统计学意义，见表6、图1。2.5芍药苷对 H292 细胞模型 MUC5AC mRNA、CFTR mRNA表达的影响如表7所示，与空白组比较，模型组的MUC5AC mRNA表达明显升高，CFTR mRNA表达降低，但差异无统计学意义；与模型组比较，抑制剂组、芍药苷高低剂量组的MUC5AC mRNA表达明显降低（P0.05），CFTR mRNA 表达明显升高（P0.05）。3 讨论 中药芍药是治疗呼吸系统疾病组方的常用药物，如百合固金汤、小青龙汤、桂枝加半夏厚朴汤等15。芍药苷为一种单萜类糖苷化合物，主要存在于毛茛科植物如芍药的根部，具有抗炎、调节免疫、抗肿瘤的功效16-17。研究表明，芍药苷可有效抑制IL-1诱导的NF-B激活，同时可通过抑制中枢神经系统中的小胶质细胞激活和蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）-NF-B信号传导来减轻炎症性疼痛，另外，芍药苷可通过抑制NF-B信号通路的激活来调控细胞功能从而发挥抗炎和免疫调节的作用18-21。同时，多种炎症因子可通过激活NF-B促进 MUC5AC转录，增加黏液分泌，调节 MUC5AC蛋白表达22-24；以上研究表明中药芍药治疗呼吸系统疾病疗效确切，芍药苷可通过抑制NF-B信号通路发挥抗炎作用，且NF-B可以调控MUC5AC黏液蛋白分泌，但针对芍药苷直接调控进而抑制黏液分泌过多的机制尚不明确，也未见相关报道。芍药苷通过抑制炎症因子分泌以及调控 NF-B信号通路进而有效降低黏蛋白分泌的具体作用途径有待进一步研究，因此本文从炎症介导的黏液分泌角度进行了体内外相关的药物干预信号通路的研究，为芍药苷的开发和临床用药提供理论依据。病理性黏液的清除和相关的临床治疗一方面可以改善患者痰多、呼吸障碍等症状，同时还可以降低患者发病频率和延缓病程25。黏液的重要成分MUC5AC高表达、高分泌及调节黏液水化的氯离子通道-囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）功能障碍严重影响了黏液的黏弹性，影响了黏液（痰液）的清除26-27。NF-B可调节MUC5AC和CFTR表达，同时也被CFTR调节28。在COPD患者中MUC5AC在黏膜和黏膜下腺表达增高，而CFTR功能降低，表表5芍药苷对H292细胞分泌IL-8和TNF-的影响（x s，n=4，pg/ml）Tab.5Effect of paeoniflorin on secretion of IL-8 and TNF-in H292 cells（x s，n=4，pg/ml）GroupsControl Model PDTC High dose paeoniflorinMedium dose paeoniflorinLow dose paeoniflorinIL-8545.6634.94832.0173.481）428.7639.712）283.9427.042）3）326.5346.112）393.7150.382）4）TNF-99.286.04151.958.211）122.1510.742）100.998.792）3）110.8910.652）119.5410.442）Note：Compared with control group，1）P0.05；compared with model group，2）P0.05；compared with PDTC group，3）P0.05；compared with high dose paeoniflorin group，4）P0.05.表6芍药苷对 H292细胞 IB、P65蛋白表达的影响（x s，n=4）Tab.6Effect of paeoniflorin on expression of IB and P65 protein in H292 cells（x s，n=4）GroupsControl Model PDTC High dose paeoniflorinLow dose paeoniflorinIB0.918 20.117 20.524 60.064 11）0.735 20.083 32）0.808 80.065 42）0.782 90.100 52）P650.978 70.160 51.203 10.037 91）0.863 60.059 22）0.683 10.073 32）3）0.856 20.084 72）4）Note：Compared with control group，1）P0.05；compared with model group，2）P0.05；compared with PDTC group，3）P0.05；compared with high dose paeoniflorin group，4）P0.05.Note：1.Control group；2.Model group；3.PDTC group；4.High dose paeoniflorin group；5.Low dose paeoniflorin group.图1芍药苷对H292细胞P65、IB蛋白相对表达的影响Fig.1Effect of paeoniflorin on relative expression of P65 and IB protein in H292 cells表7芍药苷对H292细胞MUC5AC mRNA、CFTR mRNA表达的影响（x s，n=4）Tab.7Effect of paeoniflorin on expression of MUC5ACmRNA and CFTR mRNA in H292 cells（x s，n=4）GroupsControl Model PDTC High dose paeoniflorinLow dose paeoniflorinMUC5AC mRNA0.7010.0551.0000.0001）0.6020.0512）0.8110.0552）0.9240.0842）CFTR mRNA1.0060.1031.0000.0001.6140.0912）1.7200.1682）1.6010.0532）Note：Compared with control group，1）P0.05；compared with model group，2）P0.05.1657中国免疫学杂志2023 年第 39 卷达减少29-30。热痰黏稠不易咳出，与患者气管中MUC5AC和CFTR表达及功能密切相关。COPD是一种以持续存在并呈进行性发展的气流受限为特征的慢性疾病，肺功能能够准确反映气流受限程度及病情的严重程度。本课题组复制COPD急性加重期大鼠痰湿模型，采用非束缚小动物全身体积描记系统对大鼠肺功能进行评估，观察了大鼠VT和反映气流受限的指标PEF等，以探讨芍药 苷 对 COPD 急 性 加 重 期 大 鼠 模 型 肺 功 能 和MUC5AC分泌的影响，结果显示，芍药苷可有效改善大鼠无创肺的 VT、PEF、Rin，提高肺功能，降低BALF和血清中 MUC5AC及炎症因子水平，说明芍药苷能改善模型大鼠气道黏液的合成与分泌，具有抗炎化痰的功效。为了进一步探讨芍药苷化痰抗炎的分子机制，本实验利用人气道上皮H292细胞复制了黏液高分泌模型，且该模型多用于观察药物对细胞黏液分泌和炎症反应的影响31-33。分组中设立NF-B抑制剂组，并观察该信号通路相关分子变化，发现 NF-B抑制剂可以减少 IL-1 诱导 H292 细胞的 MUC5AC分泌量和降低IL-8、TNF-表达，升高CFTR和降低MUC5AC mRNA表达，表明NF-B信号通路参与病理性黏液分泌过程。NF-B是多效调节免疫的关键转录因子，可被炎症细胞因子、有丝分裂原、氧化应激、感染和微生物产物所激活34。其中P65蛋白和IB蛋白在该信号通路的调节中发挥重要作用，是导致NF-B核转移、激活靶基因转录的关键蛋白35-37。经芍药苷干预后，细胞胞外和胞内的MUC5AC总生成量以及细胞分泌到胞外的MUC5AC占细胞总产生量（胞内+胞外）的百分比均有降低，这与芍药苷升高了IB蛋白和CFTR mRNA、降低P65蛋白和MUC5AC mRNA表达相一致；同时芍药苷还降低了IL-8和TNF-的分泌量，表明芍药苷能够有效减少炎症反应，降低炎症环境下MUC5AC的合成和分泌，这与抑制NF-B信号通路有关。以上结果显示，动物药效试验表明芍药苷可通过抑制NF-B信号通路，有效改善COPD急性加重期大鼠肺功能，抑制MUC5AC合成和分泌；同时可有效改善 H292细胞炎症环境下 MUC5AC的分泌。其作用机制可能是通过抑制NF-B信号通路，减少气道细胞炎症因子分泌量，调节 MUC5AC mRNA、CFTR mRNA 和相关蛋白的表达，这为芍药苷在化痰及抗炎方面的临床应用提供了实验依据。参考文献：1 JARAMILLO A M，AZZEGAGH Z.Airway mucin secretion J.Ann Am Thorac Soc，2018，15（Suppl 3）：S164-S170.DOI：10.1513/AnnalsATS.201806-371AW.2 FAHY J V，DICKEY B F.Airway mucus function and dysfunctionJ.N Engl J Med，2010，363（23）：2233-2247.DOI：10.1056/NEJMra0910061.3 WHITSETT J A.Airway epithelial differentiation and mucociliary clearanceJ.Ann Am Thorac Soc，2018，15（Suppl3）：S143-S