SN∕T 5462-2022 金钗石斛鉴定方法[商检].pdf

I C S 6 7.0 2 0.0 1C C S B 1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 4 6 22 0 2 2 金钗石斛鉴定方法I d e n t i f i c a t i o n o f D e n d r o b i u m n o b i l e L i n d l.2 0 2 2-0 7-0 7发布2 0 2 3-0 2-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国海口海关、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国重庆海关、中华人民共和国福州海关。本文件主要起草人:潘英文、刘福秀、张卫东、谢添伟、李佳潼、孙涛、于文涛、王安石、陈施明、韩松、林明光。S N/T5 4 6 22 0 2 2金钗石斛鉴定方法1 范围 本文件规定了金钗石斛的形态学和D NA条形码鉴定方法。本文件适用于金钗石斛的鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1萼片 s e p a l 花的外轮花被片。注:包括1片中萼片(背萼片)和2片侧萼片。3.2萼囊 m e n t u m 蕊柱足和着生于其两侧的两片侧萼片基部以及着生于其顶端的唇瓣基部组成的囊状部分。3.3花瓣 p e t a l 内轮花被片中的左右两片。3.4唇瓣 l a b e l l u m 内轮花被片中央的1片变态而成,常有鲜艳的色泽和复杂的结构。3.5蕊柱 c o l u m n 雌雄蕊融合而成的柱状器官。4 基本信息 中文名:金钗石斛 学名:D e n d r o b i u m n o b i l e L i n d l.分类地位:被子植物A n g i o s p e r m s,单子叶植物分支M o n o c o t s,天门冬目A s p a r a g a l e s,兰科O r c h i-d a c e a e,石斛属D e n d r o b i u m1S N/T5 4 6 22 0 2 2 金钗石斛的其他资料见附录A和附录B。5 方法原理 金钗石斛的茎、叶、花等形态学特征作为其鉴定的主要依据,基于I T S序列特征的分子生物学鉴定作为形态学鉴定的辅助手段。6 鉴定方法6.1 形态学鉴定 茎直立,肉质状肥厚,稍扁的圆柱形,长1 0 c m6 0 c m,粗达1.3 c m,上部多少回折状弯曲,基部明显收狭,不分枝,具多节;节间多少呈倒圆锥形,长2 c m4 c m,干后金黄色。叶革质,长圆形,长6 c m1 1 c m,宽1 c m3 c m,先端钝并且不等侧2裂,基部具抱茎的鞘。总状花序从具叶或落了叶的老茎中部以上部分发出,长2 c m4 c m,具1朵4朵花;花序柄长5 mm1 5 mm,基部被数枚筒状鞘;花苞片膜质,卵状披针形,长6 mm1 3 mm,先端渐尖;花梗和子房淡紫色,长3 mm6 mm;花大,白色带淡紫红色先端,有时全体淡紫红色或除唇盘上具1个紫红色斑块外,其余均为白色;中萼片长圆形,长2.5 c m3.5 c m,宽1.0 c m1.4 c m,先端钝,具5条脉;侧萼片相似于中萼片,先端锐尖,基部歪斜,具5条脉;萼囊圆锥形,长6 mm;花瓣多少斜宽卵形,长2.5 c m3.5 c m,宽1.8 c m2.5 c m,先端钝,基部具短爪,全缘,具3条主脉和许多支脉;唇瓣宽卵形,长2.5 c m3.5 c m,宽2.2 c m3.2 c m,先端钝,基部两侧具紫红色条纹并且收狭为短爪,中部以下两侧围抱蕊柱,边缘具短的睫毛,两面密布短绒毛,唇盘中央具1个紫红色大斑块;蕊柱绿色,长5 mm,基部稍扩大,具绿色的蕊柱足;药帽紫红色,圆锥形,密布细乳突,前端边缘具不整齐的尖齿。6.2 分子生物学鉴定6.2.1 D N A制备与P C R检测 D NA制备与P C R检测按附录C执行。6.2.2 测序与序列分析 P C R扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,目的片段使用D NA产物纯化试剂盒纯化并测序。测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑,对比峰图,判断序列方向,去除测序引物序列。登录G e n B a n k数据库B L A S T鉴定系统(h t t p:/b l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/B l a s t.c g i),通过比对查询相似度最高的物种。6.2.3 金钗石斛I T S基因序列 金钗石斛I T S基因序列G e n B a n k登录号:MT 9 4 0 4 4 0.1。7 结果判定 样品茎、叶、花等形态学特征与6.1的描述相符,且样品I T S序列与G e n B a n k数据库比对结果给出最大近似种金钗石斛且相似度大于9 9%,则判定为金钗石斛。2S N/T5 4 6 22 0 2 28 标本与原始数据保存8.1 标本保存 样本应注明来源、时间、地点及鉴定者等信息,保存期为1年,以备复验,如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后,按后期用途长久保存或处理。8.2 原始数据保存 样品检测结束后,其原始记录单和检验报告应归档,妥善保管,以备复验、谈判和仲裁。3S N/T5 4 6 22 0 2 2附 录 A(资料性)金钗石斛及其近似种分种检索表1 a.萼片和花瓣淡黄色、奶黄色至金黄色,除唇瓣外决不带紫色或其他颜色。2 a.茎上部常分枝;叶狭长圆形,宽不及7 mm,先端2圆裂细叶石斛D.h a n c o c k i i R o l f e2 b.茎不分枝;叶宽1 c m以上,先端锐尖、不裂。3 a.花单生于叶腋,干后蜡质;唇瓣卵状菱形,无任何斑纹 罗河石斛D.l o h o h e n s e T.T a n g e t F.T.W a n g3 b.花通常2朵至多朵组成总状花序或伞形花序,极罕为单花,干后不为蜡质。4 a.伞形花序几乎无花序柄,每2朵 6朵花为一束;唇盘具2个紫红色斑块 束花石斛D.c h r y s a n t h u m L i n d l.4 b.总状花序。5 a.茎上下一致的圆柱形,节和节间不肿胀。6 a.花序出自落了叶的茎上。7 a.花序轴长不及5 c m黄花石斛D.d i x a n t h u m R c h b.f.7 b.花序轴长1 0 c m以上。8 a.唇瓣近圆形,凹陷成兜状,基部两侧各具1个淡紫褐色斑块杓唇石斛D.m o s c h a t u m(B u c h.-H a m.)S w.8 b.唇瓣近圆形,不凹陷成兜状。9 a.花序柄基部被覆着长5 mm2 0 mm、套叠的大鞘;花苞片大,舟状,长1.8 c m3.0 c m线叶石斛D.a u r a n t i a c u m R c h b.f.9 b.花序柄基部被覆着长3 mm1 0 mm、套叠的小鞘;花苞片小,卵形,长约5 mm。1 0 a.唇瓣圆形,具1个横生的半月形的深紫色斑块,边缘其复流苏流苏石斛D.f i m b r i a t u m H o o k.1 0 b.唇瓣近圆形,具2个栗色斑块,边缘稍啮蚀状曲轴石斛D.g i b s o n i i L i n d l.5 b.茎常在中部或中部以上的节间增粗,有时呈纺锤形或稍呈棒状。1 1 a.花奶黄色或淡黄色;唇瓣卵状披针形,边缘不具流苏尖刀唇石斛D.h e t e r o c a r p u m L i n d l.1 1 b.花金黄色。1 2 a.唇瓣近肾形,基部两侧具红色条纹,边缘无流苏短棒石斛D.c a p i l l i p e s R c h b.f.1 2 b.唇瓣边缘具流苏。1 3 a.花瓣边缘密生长流苏;唇瓣近圆形,边缘具复式短流苏苏瓣石斛D.h a r v e y a n u m R c h b.f.1 3 b.花瓣边缘全缘;唇瓣卵状三角形,在边缘,尤其前端边缘具很长的流苏长苏石斛D.b r y m e r i a n u m R c h b.f.6 b.花序出自带叶的茎中部或中部以上部分;花序柄与茎交成近垂直,花瓣全缘。1 4 a.花序具2 朵 7朵花;唇瓣金黄色,近肾状圆形,具2个紫色斑块金耳石斛D.h o o k e r i a n u m L i n d l.1 4 b.花序具1朵2朵花;唇瓣金黄色,圆形,无紫色斑块疏花石斛D.h e n r y i S c h l t r.1 b.萼片和花瓣紫红色、天蓝色、白色或淡黄绿色,有时后来渐转变为淡黄色或乳黄色,先端常染有紫红色。1 5 a.茎上的节或节间肿胀,至少在分枝上如此,有的呈串珠状。1 6 a.茎细长,多分枝,节和节间肿胀而呈串珠状;叶生于分枝上部,宽不及5 m m 串珠石斛D.f a l c o n e r i H o o k.1 6 b.茎通常粗壮,不分枝;叶宽5 mm以上。1 7 a.花序柄基部具长2 c m3 c m的鞘;花白色,先端紫红色;唇瓣先端微凹,唇盘黄色并且有2个暗紫色斑块大苞鞘石斛D.w a r d i a n u m W a r n e r1 7 b.花序柄基部具长3 mm6 mm的鞘。1 8 a.花苞片较小,卵形,长5 mm6 mm;总状花序出自具叶的茎上端;花白色带紫红色先端;唇盘中部4S N/T5 4 6 22 0 2 2以下金黄色,基部两侧具数条紫红色条纹;茎的节间肿胀呈倒圆锥形 棒节石斛D.f i n d l a y a n u m P a r.e t R c h b.f.1 8 b.花苞片大,宽卵形,长7 mm1 0 mm;总状花序出自落了叶的茎上;花白色带紫红色先端。1 9 a.茎节多少肿胀,但不为串珠状;唇盘中央横生1个中间不连接的淡黄色、半月形的斑块,基部两侧具数条紫红色条纹杯鞘石斛D.g r a t i o s i s s i m u m R c h b.f.1 9 b.茎节肿大呈串珠状;唇盘中部以下金黄色,基部无紫红色条纹肿节石斛D.p e n d u l u m R o x b.1 5 b.茎上的节和节间不肿胀。2 0 a.茎下部常狭窄,向上变宽呈压扁的圆柱形;叶先端不等侧2圆裂。2 1 a.唇瓣宽卵形,远比花瓣大金钗石斛D.n o b i l e L i n d l.2 1 b.唇瓣宽长圆形,与花瓣约等大或较小矩唇石斛D.l i n a w i a n u m R c h b.f.2 0 b.茎上下一致的圆柱形(但霍山石斛D.h u o s h a n e n s e常下部较粗,向上逐渐变细)。2 2 a.节间的鞘具绿白相间的条纹;花淡紫红色;唇瓣近圆形,中部以上淡紫红色,中部以下金黄色玫瑰石斛D.c r e p i d a t u m L i n d l.e t P a x t.2 2 b.节间的鞘无绿白相间的条纹。2 3 a.萼片和花瓣纯紫色或紫红色。2 4 a.花大,萼片长约3.5 c m;唇瓣宽卵形,周边为紫红色,唇盘中部以下具1个被白色环带围绕的深紫色斑块喇叭唇石斛D.l i t u i f l o r u m L i n d l.2 4 b.花较小,萼片长约2.7 c m;唇瓣菱状圆形,唇盘两侧各具1个深紫红色斑块 紫瓣石斛D.p a r i s h i i R c h b.f.2 3 b.萼片和花瓣白色、黄绿色或淡黄色,有时仅先端带紫红色。2 5 a.花单生于具叶的茎上;萼片和花瓣白色或白色带淡紫红色;茎柔弱而下垂;萼片长1.7 c m2.0 c m;花瓣全缘;唇瓣金黄色,周边淡紫红色美花石斛D.l o d d i g e s i i R o l f e2 5 b.总状花序具1朵3(6)朵花,生于落了叶的茎上。2 6 a.花瓣边缘具细齿;萼片和花瓣白色带紫红色先端;唇瓣肾状圆形,白色带紫红色先端,唇盘两侧各具1个黄色斑块齿瓣石斛D.d e v o n i a n u m P a x t.2 6 b.花瓣边缘全缘。2 7 a.花苞片大,长1.0 c m1.2 c m,纸质;萼片和花瓣白色带紫红色先端;药帽密布白色长晶体状的附属物;唇瓣桔黄色带紫红色先端晶帽石斛D.c r y s t a l l i n u m R c h b.f.2 7 b.花苞片小,长2 mm8 mm,膜质;药帽光滑或被细乳突。2 8 a.花大,萼片长2.5 c m4.5 c m。2 9 a.萼片和花瓣白色;萼片长2.5 c m4.0 c m;唇瓣白色,中央具黄绿色的斑块,卵状披针形,先端急尖广东石斛D.w i l s o n i i R o l f e 2 9 b.萼片和花瓣白色带淡紫红色先端;萼片长2.3 c m3.0 c m;唇瓣近圆形,基部两侧具紫红色条纹,先端淡紫红色,唇盘黄色。3 0 a.茎通常较细长;花序柄短,从茎节上发出,花瓣明显比萼片宽兜唇石斛D.a p h y l l u m(R o x b.)C.E.F i s c h e r3 0 b.茎较粗壮;花序柄不明显,从茎节的舟状凹槽中发出;花瓣与萼片近等宽报春石斛D.p r i m u l i n u m L i n d l.2 8 b.花小,萼片长不及2.5 c m。3 1 a.花苞片在基部或近中部具横生的赤褐色斑块,花白色或黄绿色。3 2 a.茎上下一致的圆柱形,通常长6 c m以上;唇瓣中裂片卵状披针形,先端急尖或锐尖 细茎石斛D.m o n i l i f o r m e(L.)S w.3 2 b.茎通常下半部较粗壮,长不及6 c m;唇瓣中裂片半圆形或近半圆状三角形,先端近钝尖 5S N/T5 4 6 22 0 2 2霍山石斛D.h u o s h a n e n s e C.Z.T a n g e t S.J.C h e n g3 1 b.花苞片无赤褐色的斑块。3 3 a.花序轴多少回折状弯曲;唇瓣上面在中部或中部以下具1个横向紫色或紫褐色斑块。3 4 a.萼片和花瓣黄绿色或白色;唇瓣长圆状披针形,不明显3裂,基部两侧具紫红色条纹;唇瓣密布短毛,中裂片白色并且具1个横生的深紫色斑块铁皮石斛D.o f f i c i n a l e K i m u r a e t M i g o3 4 b.萼片和花瓣黄绿色,后转变为乳黄色;唇瓣多少菱形,不裂;唇盘被稀疏短毛,中部上方具1个横生褐色斑块黄石斛D.t o s a e n s e M a k i n o3 3 b.花序轴或花序柄不回折状弯曲;唇瓣上面在前端具1个深紫色斑块。3 5 a.茎长6 c m1 1 c m,稍回折状弯曲;萼片和花瓣淡黄白色带淡粉红色的先端,唇瓣基部两侧边缘和先端紫色曲茎石斛D.f l e x i c a u l e Z.H.T s i,S.C.S u m e t L.G.X u3 5 b.茎长2 0 c m6 0 c m,劲直;萼片和花瓣乳白色,基部稍带淡黄绿色,唇瓣基部两侧边缘和先端乳白色滇桂石斛D.g u a n g x i e n s e S.J.C h e n g e t C.Z.T a n g6S N/T5 4 6 22 0 2 2附 录 B(资料性)金钗石斛形态特征图 金钗石斛形态特征图见图B.1,金钗石斛形态特征墨线图见图B.2。a)植株c)花b)叶片 d)萼片、唇瓣图B.1 金钗石斛形态特征图7S N/T5 4 6 22 0 2 2标引序号说明:1 金钗石斛D.n o b i l e L i n d l.:1.植株;23 单葶草石斛D.p o r p h y r o c h i l u m L i n d l.:2.植株;3 唇瓣;45 梳唇石斛D.s t r o n g y l a n t h u m R c h b.f.:4.植株;5 唇瓣。注:图片引自 中国植物志图B.5 金钗石斛形态特征墨线图8S N/T5 4 6 22 0 2 2附 录 C(规范性)D N A制备与P C R检测C.1 仪器用具和主要试剂C.1.1 仪器用具 体视显微镜、核酸蛋白分析仪、P C R扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、烘箱、高压灭菌锅、电子天平、球磨仪或研钵、水浴锅、纯水仪、涡旋振荡器、冰箱、可调量程移液器(0.1 L 2.5 L、0.5 L1 0 L、2 L2 0 L、1 0 L1 0 0 L、2 0 L2 0 0 L、1 0 0 L1 0 0 0 L)、2.0 m L离心管、1.5 m L离心管、0.2 m L P C R反应管。C.1.2 主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验室用水应符合G B/T 6 6 8 2要求。十六烷基三甲基溴化铵(C T A B)抽提液(2%C T A B,1.4 m o l/L N a C l,1 0 0 mm o l/L T r i s-HC l p H 8.0,2 0 mm o l/L E D T A p H 8.0)、T E缓冲 液(1 0 mm o l/L T r i s-HC l p H 8.0,1 mm o l/L E D T A p H 8.0)、三羟甲基氨基甲烷(T r i s)饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、R N a s e A、液氮、1 0 P C R缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸(d NT P s)、T a q D NA聚合酶、引物、D NA M a r k e r、琼脂糖。C.2 检测方法C.2.1 样品处理 除特殊标明外,样品使用 7 5%乙醇溶液擦洗表面后于超净工作台吹干。C.2.2 D N A制备 将样品用球磨仪或研钵液氮冷冻后磨碎,称取1 0 0 m g 1 5 0 m g于1.5 m L的灭菌离心管中,加入7 0 0 L C T A B抽提液,振荡混匀,置于6 5 温浴 4 0 m i n,期间不断混匀;冷却后加入1 0 m g/m L R NA酶溶液5 L,置3 7 温浴2 0 m i n;加入等体积的酚:三氯甲烷:异戊醇(2 52 41),振荡均匀,1 2 0 0 0 r/m i n离心1 5 m i n;取上清液,加入等体积的三氯甲烷:异戊醇(2 41),振荡混匀,1 2 0 0 0 r/m i n离心1 5 m i n;取上清液,再加入等体积的异丙醇,轻轻混匀,置-2 0 冰箱中放置4 0 m i n;1 2 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,弃上清液;7 0%乙醇溶液洗涤2次,晾干后,加入5 0 L1 0 0 L T E缓冲液溶解沉淀,保存于-2 0 冰箱冷冻备用。注:也可采用商品化的试剂盒进行D NA提取,具体方法按照试剂盒说明书操作。C.2.3 D N A 纯度与浓度测定 用核酸蛋白分析仪测定D NA的纯度与浓度,分别取得2 6 0 n m和2 8 0 n m处的吸收值,计算核酸的纯度和浓度,计算公式如下:D NA纯度=O D 2 6 0/O D 2 8 0 D NA浓度=5 0O D 2 6 0 g/m L P C R级D NA 溶液的O D 2 6 0/O D 2 8 0值应为1.72.0。9S N/T5 4 6 22 0 2 2C.2.4 P C R检测C.2.4.1 引物序列引物序列见表C.1。表C.1 引物序列目标基因引物方向引物序列扩增片段/b pI T S正向引物5 -A C GAA T T C A T G G T C C G G T G AA G T G T T C G-3 反向引物5 -TA GAA T T C C C C G G T T C G C T C G C C G T TA C-3 8 4 8C.2.4.2 P C R反应体系P C R反应体系见表C.2。表C.2 P C R 反应体系试剂名称储备液浓度5 0 L 反应体系加样体积/Ld N T P 混合物2.5 mm o l/L4.01 0P C R 缓冲液(含M g2+)5.0正向引物1 0 m o l/L2.0反向引物1 0 m o l/L2.0T a q D NA聚合酶5 U/L0.8D NA 模板0.3 g/L6.0 g/L2.0d d H2O3 4.2 同时要设置阳性对照、空白对照(以d d H2O 代替D NA样品),每个样品重复2次。可用商品化的P C R P r e m i x。C.2.4.3 P C R反应程序P C R反应体系见表C.3。表C.3 P C R 反应程序步骤反应温度/时间循环数预变性9 45 m i n变性9 43 0 s退火6 04 5 s延伸7 21 m i n3 0延伸7 21 0 m i n01S N/T5 4 6 22 0 2 2C.2.4.4 琼脂糖凝胶电泳 取P C R产物5 L,1.5%的琼脂糖凝胶电泳,核酸凝胶染料染色,在凝胶成像系统观察、拍照。11S N/T5 4 6 22 0 2 2