微生物基础实验培训.ppt

微生物学实验基础培训微生物学实验基础培训laboratory Exercises in laboratory Exercises in MicrobiologyMicrobiology1.内容纲要了解配制培养基的基本原理，掌握配制的一般方法与步骤学习掌握高压蒸汽灭菌的操作方法学习平板划线与接种等操作手法2.实验目的实验目的1.熟悉牛肉膏蛋白胨固体培养基的主要成分2.液体与固体培养基的配置与灭菌3.灭菌后固体培养基的分装4.熟悉器皿与液体灭菌技术5.熟悉高压灭菌锅的操作熟悉培养基制备与灭菌技术熟悉培养基制备与灭菌技术3.实验原理实验原理由人工配制适合微生物生长繁殖和积累代谢产物的混合养料称为培养基。含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等物质。按物理状态可分为液体、半固体和固体三类。加热密封锅体内的水，让水蒸气压力升高，提高锅内蒸汽温度而达到对物品灭菌的目的。熟悉培养基制备与灭菌技术熟悉培养基制备与灭菌技术4.实验材料实验材料1.实验材料高压灭菌锅；玻璃培养皿；玻璃试管，试管架；三角瓶；称重纸；电子天平；水浴锅；铝箔纸；磁力搅拌器；2.实验药品牛肉膏；蛋白胨；NaCl；琼脂（仅在配置固体培养基时添加）；去离子水熟悉培养基制备与灭菌技术熟悉培养基制备与灭菌技术5.实验步骤实验步骤1.培养基成分 1升培养基：5g 牛肉膏,10g 蛋白胨;5g NaCl 15g 琼脂(仅在配置固体培养基时添加);去离子水2.按培养基配方比例依次准确称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl加入烧杯中(固体培养基还需要加入琼脂)。注意：蛋白胨很容易吸潮，在称取时动作要迅速，另外称药品时严防药品混杂。熟悉培养基制备与灭菌技术熟悉培养基制备与灭菌技术6.3.在上述烧杯、三角瓶中加入少于所需要的室温去离子水，放置于磁力搅拌器上搅拌，代药品完全溶解后补充水分到所需的总体积。4.如果配置固体培养基，需要将琼脂先添加到已溶解的药品中，再加热溶化。熟悉培养基制备与灭菌技术熟悉培养基制备与灭菌技术7.5.通常，配置一升培养基需要添加200微升NaOH。对于有些要求pH值较精确的微生物，培养基的pH可用酸度计控制调节。熟悉培养基制备与灭菌技术熟悉培养基制备与灭菌技术8.6.分装1）涂平板的固体培养基可直接用大试剂瓶灭菌。2）根据实验要求，可将配置的完全溶解的培养基分装入试 管、三角瓶等容器进行灭菌。注意：固体培养基约为试管高度的1/5灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜。灭菌后垂直待凝。熟悉培养基制备与灭菌技术熟悉培养基制备与灭菌技术9.熟悉培养基制备与灭菌技术熟悉培养基制备与灭菌技术P1.平皿包扎平皿包扎P2.三角瓶三角瓶包扎包扎P3.试管试管包扎包扎10.注意：灭菌时，瓶盖不能拧紧以免灭菌结束形成负压后打不开熟悉培养基制备与灭菌技术熟悉培养基制备与灭菌技术P1.加水加水P2.装料装料P3.加盖加盖P4.排冷空气排冷空气 MPa010811512112613513800.050.10.150.20.25压力表P5.升压升压P6.保压保压P7.降压降压P8.开锅取料开锅取料11.倒平板的过程靠近酒精灯（10-15cm 范围），倒完后迅速将培养皿盖上，待冷却凝固后，将培养皿翻转放置于台上，待用；若暂时不需要使用，则用封口膜缠绕后翻转放置于4冰箱，待用。熟悉培养基制备与灭菌技术熟悉培养基制备与灭菌技术P1.摆斜面摆斜面将灭菌好的试管如图放置，凝固后即成斜面P2.倒平板倒平板另外一只手拿起三角瓶倒入量为15-20mL，2-3mm高15-20mL，2-3mm高12.实验目的实验目的1.正确使用接种环2.熟悉在无菌环境下转移与重新培养3.熟悉划平板技术4.熟悉细菌数量计数的方法5.了解细菌长期保存技术平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数13.实验原理实验原理1.平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。2.菌落形成单位菌落形成单位(CFU，Colony-Forming Units)指单位体积中的活菌个数。在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数14.平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数（1）标记 在培养皿底面，用记号笔注明接种的菌名、接种者姓名、日期等。15.（2）灭菌接种环 点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环，并放置火焰中烧灼灭菌，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延至金属端，再直接烧灼金属环直至烧红，然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随后再反方向通过火焰，如此23次。然后将接种环移开火焰，待其冷却。平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数16.平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数17.（3）取菌种 左手持装有菌液的试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试管塞，将试管管口迅速通过火焰23次进行灭菌。将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取一接种环的菌液，然后退出菌种管，将菌种管管口再次通过火焰23次灭菌，塞好试管塞，放至原来的位置。平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数18.（4）分离划线接种细菌 左手持琼脂平板培养基，尽量使之直立以免空气中的细菌落入其中，并靠近火焰。右手持接种环在琼脂平板上端来回划线，涂成一细菌薄膜（约占平板的1/10），视为一区。划线时使接种环与接种平板面呈3040度角，以腕力在平板表面行轻而快地来回滑动动作。旋转琼脂平板90度，烧灼接种环，以杀灭环上的残留细菌，将接种环触及培养基表面以使其冷却。灭菌接种环通过薄膜处作连续平行划线（约占平板1/5），此视为二区。平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数19.旋转琼脂平板90度，灼烧接种环灭菌并使之冷却。将灭菌接种环接二区连续平行划线（约占平板1/4），此为三区。旋转琼脂平板90度，接种环不必再灭菌，接三区连续平行划线，划满平板其余部分，此视为四区。各区接种线间尽量互不交接，以达到细菌逐渐稀释的目的。平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数20.平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数21.单菌落再培养液体培养基 在超净工作台上，酒精灯火焰10-15cm范围内，手持灭菌后试管装有液体培养基，试管口与桌面成45oC角。将灼烧过的接种环冷却后，挑取单个菌落，在液体培养基里搅拌数次。将接种后的培养基至于恒温摇床内培养。平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数22.细菌数量计算 在超净工作台上，酒精灯火焰10-15cm范围，取液体菌液1mL并稀释四次，每次稀释10倍（如图）。取每个稀释后的液体菌液1mL或100微升滴于平板上，涂匀后过夜培养。根据可见菌落数量计算原菌液细菌数量。平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数23.平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数24.超低温保存 在超净工作台上，酒精灯火焰10-15cm范围，取过夜培养菌液500微升与60%灭菌后的甘油混合后转移到灭菌后的2毫升冷冻保存管中，立即转移到负80oC冰柜保存。平板划线与细菌数量计数平板划线与细菌数量计数25.谢谢谢谢26.