活血消异方改善子宫内膜异位症大鼠卵泡发育的机制探讨.pdf

生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期:1699.DO1:10.3969/j.issn.1004-3845.2023.11.014实验研究活血消异方改善子宫内膜异位症大鼠卵泡发育的机制探讨时光，刘永，孙伟伟，董晓英”，韩倩”，张永嘉1，杨新春，赵瑞华1*（1.中国中医科学院广安门医院，北京10 0 0 53；2.首都医科大学中医药学院，北京10 0 0 6 9；3.首都医科大学附属北京妇产医院，北京10 0 0 2 6）【摘要】目的从卵巢颗粒细胞凋亡与自噬相互作用的角度,探讨活血消异方对子宫内膜异位症大鼠卵泡发育的影响及作用机制。方法将动情周期正常的48 只SD大鼠分为空白组、假手术组各10 只，剩余的分为供体组（n=5）和受体组(n=23)用于造模，造模成功后的2 0 只大鼠又分为模型组、活血消异方组各10 只。活血消异方组予活血消异方汤剂2 ml灌胃，空白组、假手术组、模型组均予蒸馏水2 ml灌胃，各组连续灌胃15d后，检测大鼠血清活性氧（ROS）、总超氧化物歧化酶（T-SO D）、过氧化氢酶（CAT)水平。取各组大鼠的卵巢组织行HE染色，光镜下观察各级卵泡形态并计数；免疫组化染色定位颗粒细胞，并比较调亡相关因子Bax、Bc l-2、Ca s p a s e-3的表达；TUNEL染色观察颗粒细胞调亡情况并计算调亡率；蛋白免疫印迹法（Westernblot)检测卵巢组织中调亡及自噬相关蛋白p-JNK、Ba x、Bc l-2、Ca s p a s e-3、Be c l i n-1、LC3I I 的表达；电镜观察各组大鼠卵巢颗粒细胞自噬体形态,并计算自噬体胞质面积比。结果（1)与空白组、假手术组比较，模型组血清ROS含量显著升高，T-SODCAT水平显著降低(P0.05)；与模型组比较，活血消异方组血清ROS含量显著降低，T-SOD、C A T 水平显著升高（P0.05）。（2)与空白组、假手术组比较，模型组次级卵泡数目显著下降（P0.05)，卵巢颗粒细胞调亡率显著升高（P 0.0 0 1)；与模型组比较,活血消异方组次级卵泡数目显著升高（P0.05），调亡率显著降低（P0.001）。（3）与空白组、假手术组比较，模型组卵巢颗粒细胞中Bax,Caspase-3蛋白表达显著升高（P0.01）,Bc l-2 蛋白表达显著降低（P0.001）；与模型组比较，活血消异方组卵巢颗粒细胞中Bax、C a s p a s e-3蛋白表达显著降低（P0.01）,Bc l-2 蛋白表达显著升高（P0.001)。（4)与空白组、假手术组比较，模型组卵巢组织中p-JNK、Ba x、Ca s p a s e-3蛋白表达水平显著升高（P0.05）,Bc l-2、Beclin-1、LC3II蛋白表达水平显著降低（P0.05)；与模型组比较，活血消异方组卵巢组织中p-JNK、Ba x、Ca s p a s e-3蛋白表达水平显著降低（P0.05）,Bc l-2、Be c lin-1、LC 3I 蛋白表达水平显著升高（P0.05）。结论活血消异方可能通过ROS-JNK信号通路，改善子宫内膜异位症大鼠氧化应激状态，减少卵巢颗粒细胞调亡，启动颗粒细胞保护性自噬，改善子宫内膜异位症大鼠卵泡发育。【关键词】活血消异方；子宫内膜异位症；卵泡发育；调亡；自噬【中图分类号】R271.9Effects of Huoxue Xiaoyi Decoction on follicular development in endometriosis ratsSHIGuang,LIU Yong,SUN Wei-wei,DONG Xiao-ying,HAN Qian,ZHANG Yong-jia,YANG Xin-chun,ZHAORui-hual1*1.Guanganmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 1000532.School of Traditional Chinese Medicine,Capital Medical University,Beijing 1000693.Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital,Capital Medical University,Beijing 100026Objective:To explore the effect and the possible mechanism of Huoxue Xiaoyi Decoction on follicular developmentin endometriosis model rats based on the interaction between ovarian granulosa cell apoptosis and autophagy.Methods:Forty-eight SD rats with normal estrous cycles were divided into the blank group and the【收稿日期】2023-04-26；【修回日期】2 0 2 3-0 6-13【基金项目】北京市自然科学基金面上项目（7 18 2 141）；中国中医科学院科技创新工程重大攻关项目（CI2021A02403）【作者简介】时光，女，黑龙江人，博士，中医妇科专业，（*通讯作者，Email:）【文献标识码】A【A b s t r a c t 1700，sham operation group,with 10 rats in each group.The remaining rats were divided into the donor group(n=5)and the recipient group(n=23)for modeling.After successful modeling,20 rats were furtherdivided into the model group and the Huoxue Xiaoyi Decoction group,with 10 rats in each group.The ratsin Huoxue Xiaoyi Decoction group were given 2 ml of Huoxue Xiaoyi Decoction by gavage,while the blankgroup,sham operation group and model group were all given 2 ml of distilled water by gavage.Aftercontinuous gastric lavage for 15 days,the levels of serum reactive oxygen species(ROS),total superoxidedismutase(T-SOD),and catalase(CAT)were measured.The ovarian tissues were taken from each groupof rats for HE staining to observe the morphology of follicles at all stage under light microscopy,and countthem.Immunohistochemical staining was used to locate granulosa cells and compare the expression ofapoptosis related factors Bax,Bcl-2,and Caspase-3.TUNEL staining was used to observe the apoptosis ofgranulosa cells and calculate the apoptosis rate.The apoptosis and expression of autophagy related proteinsincluding p-JNK,Bax,Bcl-2,Caspase-3,Beclin-1 and LC3 II in ovarian tissue were detected by Westernblot.The morphology of autophagosomes in ovarian granulosa cells of rats in each group was observedunder electron microscopy,and the cytoplasmic area ratio of autophagosomes was calculated.Results:(1)Compared with the blank group and the sham operation group,the serum ROS content inthe model group was significantly increased,while T-SOD and CAT levels were significantly decreased(P0.05).Compared with the model group,the serum ROS content in the Huoxue Xiaoyi Decoctiongroup was significantly decreased,while T-SOD and CAT significantly increased(P0.05).(2)Comparedwith the blank group and the sham operation group,the number of secondary follicles in the model groupwas significantly decreased(P0.05),while the apoptosis rate of ovarian granulosa cells in the modelgroup was significantly increased(Po.001).Compared with the model group,the apoptosis rate in theHuoxue Xiaoyi Decoction group was significantly decreased(P0.001),while the number of secondaryfollicles was significantly increased(P 0.05).(3)Compared with the blank group and the shamoperation group,protein expressions of Bax and Caspase-3 in ovarian granulosa cells of the model groupwere significantly increased(P0.01),while protein expression of Bcl-2 was significantly decreased(PO.o01).Compared with the model group,protein expressions of Bax and Caspase-3 in ovarian granulosacells of the Huoxue Xiaoyi Decoction group were significantly decreased,while protein expression of Bcl-2were significantly increased(P0.001).(4)Compared with the blank group and the sham operationgroup,the protein expressions of p-JNK,Bax,Caspase-3 protein in ovarian tissue of the model group weresignificantly increased,while the protein expression of Bcl-2,Beclin-1,LC3 II protein were significantlydecreased(P0.05).Compared with the model group,the expression of p-JNK,Bax,Caspase-3 protein inovarian tissue of the Huoxue Xiaoyi Decoction group were significantly decreased,while the expression ofBcl-2,Beclin-1,LC3 II protein were significantly increased(P0.05).Conclusions:Huoxue Xiaoyi Decoction may improve the oxidative stress state,decrease apoptosis ofovarian granulosa cells,initiate granulosa cell protective autophagy and improve follicles development inendometriosis model rats through ROS-JNK signaling pathway.Key words:Huoxue Xiaoyi Decoction;Endometriosis;Follicle development;Apoptosis;Autophagy(J Reprod Med 2023,32(11):1699-1709)子宫内膜异位症（Endometriosis,EMs）为育龄EMs影响卵泡发育是导致不孕的重要原因，约50%期女性常见病、多发病，发病率 10%15%1。的EMs患者合并不孕2 。健康妇女月生育率为生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期15%2 0%,而EMs不孕妇女月生育率仅为2%10%3-4。接受健康赠卵的 EMs与非EMs患者妊娠率相似，而接受EMs患者赠卵的妊娠率明显下降，从而表明EMs不孕与卵泡质量密切相关。卵巢颗粒细胞的形态与数量是卵泡发育与妊娠结局的重要指标。卵泡发育过程中 99%的卵泡在排卵前发生闭锁,仅有健康且质量高的卵泡才能够排卵5。以往文献研究认为，卵巢颗粒细胞调亡是卵泡闭锁的重要原因；近年来卵巢颗粒细胞自噬与卵泡闭锁的关系日益受到重视。凋亡与自噬作为细胞程序性死亡的两种方式，共同调控卵泡闭锁，影响卵泡发育。Nakahara等6 1第1次报道荧光显微镜下EMs患者较男性因素不孕患者颗粒细胞存在更多的调亡小体;EMs囊肿侧较健侧卵巢颗粒细胞中存在更多的调亡小体，从而证明卵巢子宫内膜异位囊肿可导致颗粒细胞调亡，引起卵泡闭锁，影响卵泡发育。自噬发生于中等大小的卵泡颗粒细胞，而凋亡主要发生于大卵泡颗粒细胞。氧化应激作为外界刺激导致过量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生,ROS 作为 c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路的上游，可激活JNK信号通路，活化的JNK介导抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)/B淋巴细胞瘤-XL(Bcl-XL)磷酸化，改变线粒体膜电位8 I或调控自噬微管相关蛋白 1轻链 3（Microtubule-associatedprotein 1 light chain 3,LC3)表达，诱导自噬9-10 ROS-JNK信号通路既介导细胞调亡又介导细胞自噬1-13。本团队前期研究已证明，活血消异方可改善EMs模型大鼠体外受精-胚胎移植(IVF-ET)促排卵数、受精数,提高EMs模型大鼠IVF-ET妊娠率与活产率14-15。活血消异方具有抗氧化应激的作用，且较补肾助孕方、序贯治疗组更有利于减少卵巢颗粒细胞的凋亡16 。故本研究旨在以氧化应激为切点，基于颗粒细胞调亡与自噬调控卵泡发育为基础，探讨活血消异方改善EMs模型大鼠卵泡发育的作用机制。材料与方法一、动物与材料1.实验动物：8 周龄SPF级雌性SD大鼠50只，体重（2 0 0 士2 0）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2 0 16-0 0 0 6。常规饲养于中国中医科学院广安门医院SPF级动物实验中心，环境温度（2 2 土1)，相对湿度50%:170160%，12 h/12 h 光照/黑暗循环。本研究通过中国中医科学院广安门医院伦理委员会批准（伦理号：IACUC-6AMH-2018-005)。2.实验药物：活血消异方药材由中国中医科学院广安门医院中药房提供。实验处方：柴胡10 g、术10 g、丹参2 0 g、皂角刺10 g、鸡内金30 g、生薏苡仁30 g、香附10 g、赤芍10 g。中药生药量130 g，参照等效剂量煎煮，药液放置4冰箱保存备用。戊酸雌二醇片（拜耳，德国，国药准字J20130009），注射用青霉素钠（石家庄华北制药，国药准字H13020655)。3.实验试剂:Rat ROS ELISA(批号:DZE30711;R&D，美国），TUNEL（116 8 48 17 910；Ro c h e，瑞士），2.5%戊二醛固定液（#P1126，北京索莱宝），RabbitAnti-FSHR多抗(bs-20658R,北京博奥森），Goat anti-rabbit IgG(H+L)(111-035-003;Jackson,美国），Rabbit Anti-Bcl-2（BA 0 412）、Ra b b it A n t i-Ba x(BM3964)、Ra b b it A n ti-c a s p a s e-3(BM 39 57)一抗均购自武汉博士德生物工程公司，phosphor-SAPK/JNK Rabbit mAb（46 6 8)、LC 3B(D 11)XP Ra b b itmAb(3868)、Be c lin-1 Ra b b it m A b(3 49 5)、G A PD HRabbit mAb(5174)均购自美国CST公司,Anti-Baxantibody（a b 32 50 3）、A n t i-Bc l-2 a n t ib o d y（a b 59348）、Anti-caspase-3 antibody(ab13847)均购自英国 abcam公司,BCA protein AssayKit(02912E)BCAproteinAssayKit(02912E)均购自北京康为世纪生物公司，CAT(A007-1)、T-SO D(A 0 0 1-1)均购自南京建成科技公司。4.实验设备：普通光学显微镜IX70（O l y mp u s，日本），脱水机ASP200S（LEC I C A，德国），全自动多功能酶标仪 MULTISKAN MK3(Thermo Scientific,美国），电泳系统（ThermoScientific，美国），转膜仪(Bio-Rad，美国），Tanon成像系统（上海天能），透射电子显微镜(JEM-1400 Plus Electron Microscope,日本）。二、实验方法1.动物模型的建立：筛选动情周期正常的大鼠，应用同种异体子宫内膜移植的方法建立EMs大鼠模型。造模前予戊酸雌二醇片1 mg/kg灌胃2 d，使其处于统一动情周期。麻醉后，无菌条件下切除供体大鼠（供体组）的子宫，剪至3mmX4mm大小的子宫碎片，缝于受体大鼠（受体组）两侧腹壁及卵巢周围肠系膜血管丰富处，左右各1块，内膜面朝向.1702：腹腔（供体：受体=1：5）。假手术组于两侧腹壁及卵巢周围肠系膜血管丰富处各缝合1个线结。2 组术后均予青霉素钠注射液 8 U/0.2 ml 腹腔注射,逐层关腹。造模术后连续应用戊酸雌二醇片1mg/kg灌胃5d,促进异位病灶生长；术后3d连续腹腔注射青霉素8 U/0.2ml预防感染；造模后1周，随机选取2 只受体大鼠检验模型是否成功。若移植组织体积增大，异位病灶内液体积聚，见透明小囊泡，并与周围组织不同程度的粘连；HE染色显微镜下见明显的内膜或间质细胞、腺体，视为造模成功。2.分组与药物干预：50 只SD大鼠适应性喂养1周后，将动情周期正常的48 只大鼠分为空白组、假手术组各10 只，供体组5只，受体组2 3只。造模后第3天受体组死亡1只，解剖见肠增粗、肠胀气明显、远端梗阻。造模7 d后，处死2 只受体组检验模型是否合格，剩余2 0 只受体组分为模型组、活血消异方组各10 只。活血消异方组应用活血消异方汤剂 2 ml灌胃 15 d,假手术组、模型组、空白组均予蒸馏水 2 ml灌胃15 d。3.取材：灌胃15d后，留取双侧卵巢组织。部分卵巢组织置人4%多聚甲醛溶液中，石蜡包埋后行HE染色、免疫组化染色、TUNEL染色；部分卵巢组织置人液氮中以备蛋白免疫印迹法（Westernblot)检测。分别于卵巢组织3点、6 点、9 点、12 点处取发育的卵泡组织,切成 1 mm大小的组织块置于预冷的2.5%戊二醛固定液。腹主动脉取血,分离血清后检测ROS、总超氧化物歧化酶（Total superoxidedismutase,T-SOD)、过氧化氢酶（Catalase,CAT)水平。4.氧化应激相关因子测定：取冻存血清，按照ROS、T-SO D、C A T 试剂盒步骤说明，分别在 450 nm波长下通过ELISA测定血清ROS水平，在550 nm波长下通过羟胺测定T-SOD水平,在40 5nm波长下通过分光光度法检测CAT水平。5.HE染色检测卵泡发育：卵巢组织沿最大切面石蜡包埋,卵泡面朝向外侧。粗切至卵巢最大切面后，连续切片6 张，每张厚4m，第1张行HE染色，应用VENTANA软件测量判断各级卵泡数目。始基卵泡由初级卵母细胞和周围包绕的单层扁平颗粒细胞组成；初级卵泡由初级卵母细胞和周围包绕的单层立方颗粒细胞组成；次级卵泡由周边透明带包绕的成熟卵母细胞和58 层的颗粒细胞组成，开始出现基底膜及血管丰富的卵泡膜内层与外层结构;成熟卵泡形成了卵泡腔,卵泡直径大于50 0 m;生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期黄体为卵泡膜结缔组织、毛细血管深入颗粒细胞而形成17 。6免疫组化染色检测凋亡相关因子：使用石蜡包埋的卵巢组织第 36 张切片对FSHR、Ba x、Bc l-2、Caspase-3进行免疫组化染色（其中FSHR用于定位卵巢颗粒细胞）。具体步骤参照试剂盒，稀释一抗(FSHR 1:400、Ba x 1:2 0、Bc l-2 1:50、C a s p a s e-31：2 0）。每张切片随机选择5个视野，在高倍视野（X40 0 倍）下拍摄照片。结果由两名研究者结合染色强度和面积做半定量评估。7.TUNEL染色检测凋亡卵泡数目:第 2 张石蜡包埋的卵巢切片用于TUNEL染色检测凋亡卵泡数目，具体步骤参照TUNEL试剂盒说明书。调亡形态学结果判定：调亡细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现调亡小体，细胞核呈深棕色染色。确定各组调亡卵泡数目,计算卵泡调亡率(凋亡卵泡数/总卵泡数10 0%）。8.Westernblot检测卵巢组织调亡与自噬相关因子的蛋白表达：提取卵巢组织的蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度，湿转膜法进行转膜，一抗工作液(p-JNK,Bax、Bc l-2、C a s p a s e-3、Be c lin-1、LC 3 I I、GAPDH一抗稀释度均为1：10 0 0)4水平摇床孵育过夜。洗膜3次后加入山羊抗兔IgG(H十L)二抗(1：10 0 0 0 稀释）,ECL滴加到膜的蛋白面显影。应用 Tanon Image 软件 Gel Image System（v e r.4.00)计算不同组别灰度值，比较各组各蛋白的相对表达量。9.电镜下自噬体的观察：1%钱酸固定液4固定电镜样本2 h，梯度脱水后树脂包埋，固化，制备600um半薄切片，光镜下观察定位卵巢颗粒细胞，采用超薄切片机切片（切片厚度8 5nm），3%醋酸铀-柠檬酸铅双染色后透射电镜下观察。每组随机选取8 个视野观察自噬体，计算自噬体胞质面积比（自噬体面积/细胞质面积10 0%），并进行组间比较。三、统计学分析采用SPSS23.0软件包进行数据分析。符合正态分布的计量资料用均值土标准差（士s)表示，非正态分布的计量资料用中位数（四分位间距)M(QR)表示；符合正态分布与方差齐性检验的数据，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），多重比较应用LSD法；不符合正态分布的数据，组间比较采用非参数检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期检验。P0.05为差异有统计学意义。一、活血消异方对氧化应激指标的影响与空白组、假手术组比较，模型组血清ROS显著升高T-SOD、CA T 显著降低（P0.05）；与模型组比较,活血消异方组血清ROS显著降低,T-SOD、CAT显著升高(P0.05)(图1)。二、活血消异方对卵泡发育的影响空白组、假手术组、模型组、活血消异方组均存在各级卵泡发育。与空白组、假手术组比较，模型组次级卵泡数目显著下降(P0.05)；与模型组比较，活血消异方组次级卵泡数目显著升高（P0.05)（表1）。结果三、活血消异方对卵巢颗粒细胞中Bax、Bc l-2、Caspase-3蛋白表达的影响应用兔抗FSHR多克隆抗体对卵巢颗粒细胞定位染色，卵母细胞周围结构棕色深染为阳性，即卵巢颗粒细胞；并可见颗粒细胞胞质内分别深染棕色颗粒的Bax、Bc l-2、Ca s p a s e-3阳性细胞。与空白组、假手术组比较，模型组Bax、C a s p a s e-3表达显著升高(P0.01),Bcl-2表达显著降低（P0.001);与模型组比较，活血消异方组Bax、Ca s p a s e-3表达显著降低（P0.01),Bcl-2表达显著升高（P0.001)(表 2,图 2 4)。B*180160(Iu/m)/AOS-14012010080C*20*模型组假手术组*18(Iu/n)/IV0影16141210F8*T品模型组假手术组活血消异方组与模型组比较，P0.05*P0.01,*P0.001。图1各组大鼠血清ROS、T-SO D CA T 水平比较表1各组大鼠卵泡发育情况比较(元士s)组别空白组假手术组模型组活血消异方组注：与模型组比较，P0.05,P0.01。组别空白组假手术组模型组活血消异方组注：与模型组比较，*P0.01,#P0.001。例数6666表2 各组大鼠卵巢颗粒细胞中Bax、Bc l-2、Ca s p a s e-3蛋白表达情况(士s)例数6666始基卵泡数5.003.525.672.582.501.525.673.831.930.47#2.270.96#4.670.992.701.00*初级卵泡数15.508.029.17 2.327.004.8211.174.88Bax次级卵泡数16.173.19*16.003.95*8.174.2216.001.67*Bcl-23.770.88#4.100.68#1.900.454.130.76#成熟卵泡数1.500.841.672.251.500.841.501.22Caspase-30.500.35#0.930.52*2.100.670.970.48*黄体数14.331.6313.333.7811.174.4912.673.611704：生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期50Lim50LmA：空白组；B:假手术组；C:模型组;D:活血消异方组。标尺=50 m。图2 各组大鼠卵巢颗粒细胞中Bax表达情况（X400)LL150mA：空白组；B:假手术组；C:模型组；D：活血消异方组。标尺=50 m。图3各组大鼠卵巢颗粒细胞中Bcl-2表达情况（X400）50Lm生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期170550um50unA：空白组；B：假手术组；C:模型组；D：活血消异方组。标尺=50 m。图4各组大鼠卵巢颗粒细胞中Caspase-3表达情况（X400)四、活血消异方对卵巢颗粒细胞调亡的影响TUNEL染色凋亡的卵泡可见颗粒细胞核呈棕色深染。4组比较发现，空白组凋亡率最低，其次为假手术组、活血消异方组，模型组凋亡率最高。与空白组、假手术组比较，模型组凋亡率显著升高（P0.001);与模型组比较,活血消异方组凋亡率显著降低(P0.001)(表3,图5)。A50um表3各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况(士s)组别例数空白组6假手术组6模型组6活血消异方组6注：与模型组比较，#P0.001。BC调亡率(%)11.532.63#12.67 2.77#22.923.7914.183.36#DIcm1 cmcm1 cmH50mA：空白组;B：假手术组;C:模型组;D:活血消异方组（标尺=1cm)。EH 凋亡卵泡（标尺=50 m）。图5各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况（AD,T U NEL染色，X10;EH,T U NEL染色，X100)50.：17 0 6五、活血消异方对卵巢组织调亡与自噬相关因子表达的影响与空白组、假手术组比较，模型组卵巢组织中p-JNK、Ba x、Ca s p a s e-3蛋白的表达水平显著升高(P0.05),Bcl-2、Be c li n-1、LC 3I 蛋白表达水平显著降低(P0.05)；与模型组比较,活血消异方组p-JNK、Ba x、C a s p a s e-3蛋白表达水平显著降低（P组别例数空白组60.250.14#假手术组6模型组6活血消异方组6注：与模型组比较，P0.05，*P 0.0 1，#P 0.0 0 1。假手空白组术组模型组异方组p-JNKBaxBcl-2Caspase-3Beclin-1LC3IIGAPDH图6 Westernblot法检测各组大鼠卵巢组织中调亡与自噬相关因子的表达讨论EMs是子宫内膜组织出现在子宫腔以外的部位所引起的疾病，其发病机制不详。192 7 年Sampson提出的经血逆流学说为目前较公认的发病机制。异位内膜的周期性出血引起炎症反应、免疫细胞浸润、促炎因子生成，铁离子超载、血细胞代谢增加，促进氧化应激，导致ROS升高,抗氧化水平下降,诱发氧生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期0.05）,Bc l-2、Be c lin-1、LC 3I 蛋白表达显著升高（P0.05)（表5)。表4各组大鼠卵巢组织中凋亡与自噬相关因子表达水平比较（元土s)P-JNKBax0.310.10#0.280.12*0.290.12#0.560.090.630.120.380.14*0.400.12*活血消+54kD21 kD+26kD+34 kD+60 kD+16kD+14 kD37kDBcl-20.540.24*0.600.21*0.32 0.160.540.02*化应激状态18 。EMs存在氧化与抗氧化间不平衡的氧化应激状态，氧化应激可能是原因，也可能是EMs病理生理学的结果19。与非EMs患者比较，EMs患者血清ROS水平更高，血浆 SOD活性下降2 0-2 1。EMs患者腹腔液中氧化与抗氧化的平衡失调可能导致卵泡异常发育，造成卵母细胞DNA、细胞骨架、细胞膜损伤，卵泡质量下降，出现不孕2 1-2 2 。改善氧化应激状态可作为EMs治疗的目标,既可以缓解临床症状，又可以改善生育19。本研究中EMs 模型大鼠存在氧化与抗氧化之间的平衡失调，通过活血消异方治疗后氧化应激反应明显减轻，从而证明活血消异方具有抗氧化应激的作用。活血消异方为赵瑞华教授在传承首都国医名师李光荣教授的EMs三型辨证的基础上，创制的治疗EMs气滞血瘀证的临床有效方剂。活血消异方由柴胡、制香附、丹参、术、皂角刺、鸡内金、生薏苡仁等组成。丹参的主要成分水溶性丹酚酸，其水提物具有明显的抗氧化能力，可清除超氧阴离子和羟基自由基，抑制脂质过氧化，提高氧化应激小鼠肝组织的SOD活力与谷胱甘肽（Glutathione，G SH)含量，降低丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量2 3-2 4。柴胡皂苷作为柴胡的有效成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的功能2 5-2 6 ，可降低肝组织中MDA含量，增强SOD活性，抑制氧化应激导致的肝损伤2 7 。香附黄酮类化合物为香附的有效成分，体内外实验均Caspase-30.320.10#0.420.12*0.590.050.440.14*Beclin-10.520.05#0.470.06*0.300.070.44 0.11*:LC3 II0.510.08*0.490.08*0.410.030.500.06*生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期:1707.自噬体自噬体线粒体线粒体线粒体髓样体线粒体内质网自噬体A：空白组；B:假手术组；C:模型组D:活血消异方组。标尺=1m。图7 透射电镜下观察各组大鼠卵巢颗粒细胞中自噬体形态图（AD，2 0 0 0 0;B、C，X30 0 0 0）表5各组大鼠卵巢颗粒细胞中自噬体胞质面积比分析（元土s）组别例数空白组6假手术组6模型组6活血消异方组6证明其具有较强的抗氧化活性，可通过提高体内SOD、G SH 清除自由基活性，减少过氧化产物MDA与蛋白质羰基的生成，减轻组织与细胞的氧化损伤2 8 。术多糖和鸡内金多糖均具有抗氧化作用。因此，活血消异方全方具有较强的抗氧化效应。卵巢颗粒细胞在调控卵泡生长、发育、成熟的过程具有重要作用。实验表明,EMs模型大鼠体内的过量ROS可以激活ROS-JNK信号通路，介导细胞自噬体胞质面积比（%）调亡与细胞自噬。ROS-JNK信号通路激活后，既1.700.44能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，促进促凋亡蛋白Bax表达，向胞质内释放细胞色素C,激活Caspase蛋白1.540.18酶，同时还抑制了自噬适应机制，诱导细胞调亡率升1.550.78高。细胞调亡过程中活化大量Caspase蛋白酶，消1.550.50化自噬相关蛋白，导致自噬水平降低，减少了细胞保护功能，加剧了卵巢颗粒细胞超微结构的破坏，加速细胞死亡，影响卵泡发育。活血消异方通过降低ROS,阻断ROS-JNK信号通路，促进Bcl-2表达，抑制Bax、Ca s p a s e-3 的表达,使颗粒细胞凋亡降低;同时ROS水平降低，启动保护性自噬，有利于维持颗粒细胞稳态与卵巢颗粒细胞超微结构，改善卵泡发育。.1708，本研究中4组间自噬体胞质面积比未见显著差异，其原因可能是应用电镜评估自噬时，吞噬泡、自噬体、自噬溶酶体均评估为自噬，无法动态评估自噬发生的变化。但本研究中模型大鼠卵巢颗粒细胞自噬相关蛋白表达降低，而应用活血消异方后自噬相关蛋白表达升高，表明EMs模型大鼠自噬受到抑制，而应用活血消异方后自噬程序被激活。与以往研究中ROS-JNK信号通路激活后，促进自噬的产生存在不一致。考虑可能因为EMs 患者体内存在长期、大量的ROS刺激，达到细胞极限时，细胞自噬的适应机制受到抑制，促进细胞凋亡程序激活；同时细胞凋亡过程中存在大量活化的Caspase蛋白酶，消化自噬相关蛋白，导致自噬水平下降2 9，终止细胞保护功能，加速细胞死亡，影响卵泡发育。自噬作为双刃剑,具有促进细胞存活、诱导细胞死亡的作用30 。适度应激条件下，自噬可作为保护机制，维持细胞蛋白与细胞器的完整；而过量自噬导致细胞程序性死亡,即型细胞程序性死亡，出现胞浆蛋白与细胞器过度降解，诱导细胞功能