《菜花DNA的提取》.ppt

菜花中菜花中DNA的提取的提取1 1整理整理pptppt一一.实验原理实验原理1 1核酸分离提取的原则核酸分离提取的原则核酸分离提取的原则核酸分离提取的原则 1 1）应保证核酸一级结构的完整性）应保证核酸一级结构的完整性）应保证核酸一级结构的完整性）应保证核酸一级结构的完整性 2 2）排除其他分子的污染）排除其他分子的污染）排除其他分子的污染）排除其他分子的污染 A A 核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶 剂和过高浓度的金属离子剂和过高浓度的金属离子剂和过高浓度的金属离子剂和过高浓度的金属离子 B B其他生物大分子如：蛋白质，多糖和脂类分子其他生物大分子如：蛋白质，多糖和脂类分子其他生物大分子如：蛋白质，多糖和脂类分子其他生物大分子如：蛋白质，多糖和脂类分子 的污染应降低到最低程度的污染应降低到最低程度的污染应降低到最低程度的污染应降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染（如：提取排除其他核酸分子的污染（如：提取排除其他核酸分子的污染（如：提取排除其他核酸分子的污染（如：提取DNADNA分子分子分子分子 应除去应除去应除去应除去RNARNA；反之亦然）；反之亦然）；反之亦然）；反之亦然）2 2整理整理pptppt2.2.核酸提取的步骤核酸提取的步骤核酸提取的步骤核酸提取的步骤 1 1）破碎细胞（材料不同，方法不同）破碎细胞（材料不同，方法不同）破碎细胞（材料不同，方法不同）破碎细胞（材料不同，方法不同）匀浆器，捣碎器，溶菌酶消化，碱裂解等。匀浆器，捣碎器，溶菌酶消化，碱裂解等。匀浆器，捣碎器，溶菌酶消化，碱裂解等。匀浆器，捣碎器，溶菌酶消化，碱裂解等。2 2）除杂质，提除杂质，提除杂质，提除杂质，提DNADNA 杂质：蛋白，多糖，脂类，杂质：蛋白，多糖，脂类，杂质：蛋白，多糖，脂类，杂质：蛋白，多糖，脂类，RNA RNA，DNaseDNase A.A.DNaseDNase的抑制的抑制的抑制的抑制 DNaseDNase需需需需Mg2+,Ca2+Mg2+,Ca2+激活，所以提取时加激活，所以提取时加激活，所以提取时加激活，所以提取时加0.01M0.01M EDTA EDTA或或或或EDTAEDTA钠盐。（螯合金属离子）钠盐。（螯合金属离子）钠盐。（螯合金属离子）钠盐。（螯合金属离子）加去垢剂或变性剂（加去垢剂或变性剂（加去垢剂或变性剂（加去垢剂或变性剂（SDSSDS），可使），可使），可使），可使DNaseDNase变性失活变性失活变性失活变性失活 3 3整理整理pptpptB.B.除除除除RNARNA酶法酶法酶法酶法：加：加：加：加RNaseRNase调调节节pH：RNA能能在在室室温温条条件件下下被被稀稀碱碱水水解解成成核核甘甘酸酸而而DNA对对碱碱较较稳稳定定（核核酸酸的的理理化化性性质质），所所以以提提DNA一一般般要要在在偏偏碱碱的的环环境境中中提提取取，提提RNA要要在在偏偏酸的环境中稳定。酸的环境中稳定。调调节节盐盐浓浓度度(盐盐的的分分步步沉沉淀淀)：在在浓浓NaCl（12M）溶溶液液中中，DNA溶溶解解度度大大，RNA溶溶解解度度小小；在在稀稀NaCl（0.14M）中中，DNA溶溶解解度度小小，RNA溶溶解解度度大大，因因此此可可利利用用不不同同浓浓度度的的NaCl溶溶液液将将DNA和和RNA从样品中分开。从样品中分开。4 4整理整理pptppt C.除蛋白除蛋白加加去去垢垢剂剂或或变变性性剂剂（SDS，十十二二烷烷基基硫硫酸酸锂锂LDS，十十二二烷基肌酸钠，脱氧胆酸钠）使蛋白变性，与烷基肌酸钠，脱氧胆酸钠）使蛋白变性，与DNA分开；分开；用有机溶剂沉淀，除去蛋白用有机溶剂沉淀，除去蛋白常常用用的的有有机机溶溶剂剂：苯苯酚酚，氯氯仿仿，异异丙丙醇醇，醚醚，8羟羟喹喹咛，间甲酚等咛，间甲酚等本次实验所用：氯仿：异戊醇本次实验所用：氯仿：异戊醇24：1 氯氯仿仿：使使有有机机相相和和水水相相易易分分层层，增增加加核核酸酸得得率率，同同时时可除去脂类。可除去脂类。异戊醇：可减少泡沫，也能促使有机相，水相分离。异戊醇：可减少泡沫，也能促使有机相，水相分离。5 5整理整理pptppt D.除糖，脂类除糖，脂类 对于含糖量高，含脂高的样品需要做对于含糖量高，含脂高的样品需要做 加蛋白水解酶加蛋白水解酶：如提动物组织中的：如提动物组织中的DNA，常加蛋白酶，常加蛋白酶 K6 6整理整理pptppt二二.利用盐不同浓度提取利用盐不同浓度提取DNA1.实验试剂和器材实验试剂和器材1）材料）材料菜花菜花 2 2）实验试剂）实验试剂）实验试剂）实验试剂5mol/L NaCl溶液溶液;0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na溶液溶液;25%SDS 溶液；溶液；24:1 氯仿异戊醇混合液；乙醇；氯仿异戊醇混合液；乙醇；7 7整理整理pptppt3 3）实验器材实验器材实验器材实验器材研钵研钵研钵研钵离心管离心管离心管离心管:10ml:10ml指管指管指管指管移液管，移液管，移液管，移液管，高速离心机高速离心机高速离心机高速离心机水浴锅水浴锅水浴锅水浴锅8 8整理整理pptppt三三.实验步骤实验步骤 1.取菜花取菜花 4g，置研钵中，加少许石英沙仔细磨成糊，置研钵中，加少许石英沙仔细磨成糊状。状。2.分次加入分次加入10ml 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液，将糊状物转入溶液，将糊状物转入 两个两个10ml的离心管中。的离心管中。6000r/min离心离心10min，弃去上清。（注：做鸡，弃去上清。（注：做鸡肝的可再加肝的可再加7ml/管管 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液，将沉淀搅匀后溶液，将沉淀搅匀后6000r/min离心离心8min，弃去上清）。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。，弃去上清）。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。9 9整理整理pptppt3.向上述沉淀物加入向上述沉淀物加入0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液溶液2ml/管，管，25SDS溶液溶液0.25ml/管管,搅搅拌至混匀。置拌至混匀。置60水浴保温水浴保温10min，取出冷至室温。，取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分离。此步操作系使核酸与蛋白质分离。4.加入加入5mol/L NaCl 溶液溶液1ml/管，搅拌混匀，加管，搅拌混匀，加入约一倍体积的氯仿异戊醇混合物（约入约一倍体积的氯仿异戊醇混合物（约4ml/管），管），颠倒混匀颠倒混匀12min。6000r/min离心离心10min。5.吸出上清至洗净的研钵中，加入吸出上清至洗净的研钵中，加入2倍体积的预冷倍体积的预冷95%乙醇，放置乙醇，放置2-3分钟，分钟，DNA沉淀析出，用玻棒沉淀析出，用玻棒慢慢搅动，可将慢慢搅动，可将DNA丝状物缠在玻棒上。丝状物缠在玻棒上。6.将沉淀转入将沉淀转入eppendorf管中管中,用无水乙醇洗涤一次用无水乙醇洗涤一次,自然干燥自然干燥,4 保存备检测保存备检测.1010整理整理pptppt四四.实验结果分析讨论写写出出本本次次实实验验中中提提取取DNADNA时时每每一一步步操操作作中中所所用试剂的目的。用试剂的目的。查查阅阅相相关关资资料料，写写出出至至少少一一种种其其它它方方法法提提取取DNADNA的原理及步骤的原理及步骤1111整理整理pptppt五五.琼脂糖凝胶法检测琼脂糖凝胶法检测DNA核酸检测方法核酸检测方法紫外吸收法紫外吸收法有机试剂法有机试剂法琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法提取完好的提取完好的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱琼脂糖凝胶电泳图谱未除去未除去RNA的的DNA琼脂糖琼脂糖凝胶电泳图谱凝胶电泳图谱1212整理整理pptppt