基于“肝藏血”理论运用网络药理学探究地五养肝胶囊抗肝硬化血小板减少的活性成分与生物学基础.pdf

中西医结合肝病杂志 年第 卷第 期循证医学:./.基金项目:国家自然科学基金项目(.)国家中医临床研究基地(湖北)重点病种研究项目(.)湖北省中医药管理局中医药科研项目青年人才项目(.)重症肝病多学科交叉创新团队项目(.)湖北省自然科学基金面上项目(.)名老中医传承工作室资助项目(鄂卫生计办通 号)通讯作者:.:.基于“肝藏血”理论运用网络药理学探究地五养肝胶囊抗肝硬化血小板减少的活性成分与生物学基础郑自健 郑吴殷晓 胡春玲 陈树和 尤朋涛 俞 灿 李瀚旻 周雅君.湖北中医药大学药学院(湖北 武汉).湖北中医药大学附属湖北省中医院药事部.湖北中医药大学附属湖北省中医院肝病科肝病研究所.武汉市中医院肝病科摘 要 目的:基于中医“肝藏血”理论运用网络药理学初步探究地五养肝胶囊抗肝硬化血小板减少的潜在活性成分与生物学基础 方法:利用、数据库查阅相关文献共同检索地五养肝胶囊胶囊活性成分及对应靶点通过、和 数据库及相关文献检索肝硬化血小板减少症相关作用的靶点利用 数据库构建地五养肝胶囊抗肝硬化血小板减少潜在的作用蛋白的相互作用网络 利用 语言的 软件包对地五养肝胶囊抗肝硬化血小板减少潜在靶点进行基因本体()富集分析和京都基因及基因组百科全书()富集通路分析并构建出药物与疾病映射靶基因及通路网络结果:筛选出地五养肝胶囊抗肝硬化血小板减少的活性成分 个包括槲皮素、异甘草苷、甘草次酸、绿原酸、五味子乙素、去甲氧基姜黄素等潜在作用蛋白 个包括、等 分析总共富集到 条生物过程()相关 项细胞组成相关和 项分子功能相关 富集通路分析共富集到 条信号通路 地五养肝胶囊“肝生血”抗肝硬化血小板减少主要涉及调控铁死亡相关信号通路、信号通路、信号通路、信号通路等信号通路 结论:地五养肝胶囊可能通过以槲皮素、异甘草苷、甘草次酸、绿原酸、五味子乙素等生物活性成分调控 信号通路的铁死亡抗肝硬化血小板减少关键词 地五养肝胶囊肝硬化血小板减少铁死亡网络药理学中图分类号.文献标志码 .().:().:.().()().:中西医结合肝病杂志 年第 卷第 期 .()()().:.:肝硬化是我国临床上常见的慢性进行性肝病可由多种慢性肝病发展而来“肝藏血”是人体肝脏的一个主要生理功能肝脏具有贮藏血液、调节血量、防止出血的功能故有肝主血海之称 温病条辩 卷六载“肝主血肝以血为自养血足则柔血虚则强”肝生血血足则肝体自充 疏泄与生血肝气与肝血相互为用动静有常 肝藏血功能失常亦常见于肝硬化患者血小板减少是肝硬化患者“肝藏血功能”异常表现的常见异常的微观指标之一 慢性肝病患者中血小板减少症的发生率约为而肝硬化患者中其发生率可达中医学认为肝肾同居下焦肝主藏血而肾主藏精精血互生“肝肾同源”基于“肝肾同治”“补肾生髓成肝”治疗法则的指导下研发的地五养肝胶囊地五养肝胶囊是湖北省中医院研发的一种新型复方中药制剂由茵陈、五味子、甘草、熟地、姜黄五味中药组成具有抗炎保肝、解毒通络、清热利湿、补肾养肝以及调控肝再生的功效其能够有效的改善患者的肝功能临床上主要用于治疗多种慢性肝病 地五养肝胶囊临床使用发现其对肝硬化有显著疗效亦可显著逆转肝硬化患者血小板减少但其抗肝硬化血小板减少的作用机制尚未阐明网络药理学是一门基于生物信息学和计算机应用技术的新兴学科其强调从整体的角度出发通过构建“成分靶点通路”网络分析药物和疾病之间的分子关联性 本文拟通过网路药理学的方法构建“中药成分靶点通路疾病”网络旨在系统完整地发掘出从肝论治地五养肝胶囊抗肝硬化合并血小板减少的活性成分探究其潜在的作用机制以期从分子水平探讨其从肝论治肝硬化合并血小板减少的药理学作用机制为进一步研究和临床推广应用提供参考 数据获取和处理.地五养肝胶囊中药成分活性成分的筛选及靶点库的构建 地五养肝胶囊中的五味药物分别为茵陈、姜黄、北五味子、熟地黄以及甘草在中药系统药理学数据库与分析平台(:/././)检索上述五味药物进行活性成分的筛选 筛选条件参照药动学吸收、分布、代谢和排泄()原则设定药物口服生物利用度()和类药性指数(.)此外结合文献检索补充地五养肝胶囊药材中的有效活性成分并结合文献将不满足筛选条件但公认的具有药效的化学成分进行进一步补充获得候选化合物 将纳入的化合物成分通过、数据库(:/./)进行靶点预测所有靶点经 数据库(:/./)校正去除非人类靶点.肝硬化血小板减少症相关性铁死亡疾病靶点库的构建以“”“”“”为关键词在 数据库(:/./)基因数据库(:/./)以及 数据库(:/./)进行人类基因检索合并检索结果并删除重复的基因靶点构建疾病靶点库.地五养肝胶囊的“活性成分抗肝硬化血小板减少症”潜在作用靶点库构建通过分析工具 .将地五养肝胶囊活性成分靶点库与疾病靶点库取交集获得地五养肝胶囊活性成分抗肝硬化和血小板减少症相关的潜在作用靶点库并将自噬、铁死亡等信号通路的药物相关靶点纳入.地五养肝胶囊“活性成分肝硬化血小板减少症”潜在靶点的蛋白质相互作用()网络构建将潜在作用靶点输入 数据库(:/./.)进行 网络的构建将生物种类设定为“”其他参数设置不变以获得 网络图将互作关系文件以.格式保存之后导入到 .软件中进行可视化分析设置参数使节点大小和颜色深浅反映度值的大小边的粗细、颜色深浅反映 的高低 构建 网 络 图 使 用 工具对得到的 网络进行拓扑分析参数包括节点介数中心性、节点紧密度和度值等通过度值排序将排名前 的靶点作为关键靶点使用 进行数据可视化.地五养肝胶囊“活性成分肝硬化血小板减少症”潜在作用靶点的京都基因与基因组百科全书()通路和基因本体()功能富集分析将地五养肝胶囊“活性成分肝硬化血小板减少症”潜在作用靶点导入 .软件安装并引用中西医结合肝病杂志 年第 卷第 期 包和物种注释包.进行 的生物过程()、分子功能()、细胞组分()富集分析和 富集通路分析并绘制柱状图和气泡图进行可视化.地五养肝胶囊的“中药成分靶点通路疾病”网络构建 以地五养肝胶囊中药组分、活性成分、“活性成分肝硬化血小板减少症”潜在作用靶点、富集得到的地五养肝胶囊抗肝硬化的主要信号通路以及各通路与靶蛋白的对应关系为基础构建“中药成分靶点通路疾病”网络文件导入至.软件中绘制“活性成分靶点通路”网络图利用 功能进行网络拓扑学分析通过参考拓扑学参数对比活性成分在网络中的重要性参数包括节点介数中心性、节点紧密度和度值等分析主要活性成分更直观地展示中药活性成分在治疗肝硬化过程中合并血小板减少的多成分多靶点的作用特点 结果.地五养肝胶囊活性成分的筛选及靶点库的构建经筛选茵陈获得 个化合物成分 个靶点姜黄获得 个化合物成分 个靶点熟地黄获得 个化合物成分 个靶点北五味子获得 个化合物成分 个靶点甘草获得 个化合物 个靶点 经研究者合并删重后共得到 个活性成分和 个作用靶点.肝硬化血小板减少症相关疾病靶点库的构建经检索肝硬化得到 个靶点血小板减少症得到 个靶点并加入筛选出的铁死亡和自噬相关通路得到 个靶点取交集得到 个肝硬化血小板减少症相关的靶点.地五养肝胶囊“活性成分肝硬化血小板减少症”潜在作用靶点库的构建 通过分析工具 .将地五养肝胶囊活性成分靶点库与肝硬化血小板减少症的疾病靶点库取交集获得地五养肝胶囊活性成分抗肝硬化合并血小板减少症相关的潜在作用靶点 个见图 纳入药物抗肝硬化合并血小板减少症相关活性成分 个图 地五养肝胶囊活性成分抗肝硬化合并血小板减少症相关的潜在作用靶点韦恩图.地五养肝胶囊“活性成分肝硬化血小板减少症相关性铁死亡”潜在靶点 网络的构建 使用 数据库将上述获得的 个地五养肝胶囊抗肝硬化潜在作用靶点构建 网络见图 导入 .软件中进行可视化分析节点颜色和大小根据度值调整节点越大颜色越红度值越大线的粗细从粗到细表示 从大到小见图 共获得 个节点 条边平均度值为.利用 功能进行网络拓扑学分析显示、和 等度值较大提示与其他蛋白作用力较强见表 排名前 的关键靶点信息导入 进行数据可视化见图.地五养肝胶囊“活性成分肝硬化合并血小板减少症”潜在靶点 功能与 通路富集分析 利用.软件的 软件包对地五养肝胶囊抗肝硬化合并血小板减少的潜在靶点进行 富集分析和 富集通路分析根据.富集分析总共富集到 条 主要涉及细胞对化学应激的反应()、上皮细胞增殖()、凋亡信号通路的调控()、凋亡信号通路的负调控()、氧化应激反应()、细胞对氧化应激的反应()、上皮细胞增殖的调节()、细胞对外界刺激的反应()等 项 相关主要涉及囊泡腔()、膜筏()、膜微区()、膜区()等 项 相关主要涉及 结合转录因子结合()、聚合酶 特异性 结合转录 因 子 结 合()、泛素蛋白连接酶结合()、泛素样蛋白连接酶结合()、蛋白酶结合()、活化转录因子结合()、抗氧化活性()、细胞因子受体结合()等取前 个最显著的条目进行、气泡图和柱状图的绘制见图、根据 .信号通路富集分析共富集到 条信号通路主要富集于乙型肝炎()、肝细胞癌()、人巨细胞病毒感染()、信号通路()、信号通路()、信号通路()、细胞衰老()、丙型肝炎()、人 细胞白血病病毒 感染()等信号通路 将富集得到的结果按照富集数目排序取前 条信号通路进行柱状图和气泡图的绘制见图、中西医结合肝病杂志 年第 卷第 期图 地五养肝方抗肝硬化合并血小板减少症相关的潜在作用靶点相互作用网络及核心靶点筛选图 功能与 通路富集分析中西医结合肝病杂志 年第 卷第 期表 地五养肝胶囊抗肝硬化合并血小板减少症相关的关键靶点信息 基因名称度中心性平均最短路径长度介数中心性紧密中心性.地五养肝胶囊的“中药成分靶点通路疾病”网络构建以地五养肝胶囊中药组分、活性成分、“活性成分肝硬化血小板减少症”潜在作用靶点、富集得到的地五养肝胶囊抗肝硬化合并血小板减少的主要信号通路以及各通路对应的相关靶点为基础构建“中药成分靶点通路疾病”网络文件将“中药成分靶点通路疾病”网络文件导入 .软件进行通路网络图的绘制墨绿色八边形代表地五养肝胶囊主要中药组分淡绿色圆形代表药物活性成分黄色正方形代表地五养肝胶囊抗肝硬化合并血小板减少的潜在作用靶点橙色六边形代表肝硬化疾病蓝色三角形代表主要的信号通路如图 所示更直观地展示中药活性成分在治疗肝硬化合并血小板减少症过程中的多成分多靶点多通路的协同作用利用 功能进行网络拓扑学分析通过参考拓扑学参数对比化合物在网络中的重要性分析主要活性成分其中槲皮素()、异甘草苷()、甘草次酸()、绿原酸()、五味子乙素()、去甲氧基姜黄素()、双去甲氧基姜黄素()、五味子酯乙()、五味子甲素()、芒柄花素()等药物成分与多个作用靶点存在密切联系地五养肝胶囊的核心活性成分见表 图 地五养肝方“中药成分靶点通路疾病”网络表 地五养肝胶囊抗肝硬化血小板减少症相关性铁死亡作用核心活性成分 节点名称度值英文名中文名槲皮素异甘草苷 甘草次酸 绿原酸 五味子乙素去甲氧基姜黄素双去甲氧基姜黄素 五味子酯乙 五味子甲素芒柄花素 讨论基于“肝藏象肝脏中心说”肝脏是肝藏的主体肝藏包含肝脏而不限于肝脏 肝藏血的藏象理论基本包括“有血可藏”(有关血液的生成、丢失或消耗)“调节血量”(有关气血的调节)和“藏循常道”(有关出血凝血机制)三大内容 液生成不足导致“藏血不足”或“无血可藏”除肝脏病证影响消化吸收导致血液生成不足外肝脏的造血功能更是与肝藏血功能认识高度吻合 以往研究认为肝藏血为肝生血提供物质基础肝以生血气的实质是指肝为合成补充和代谢交换血液营养物质的重要场所之一 现代医学已证实促进血小板生成的血小板生成素()主要由肝脏产生中医临床对于血小板减少的患者的治疗也以“调肝”为首 在肝纤维化到肝硬化疾病进程中血小板减少的程度与患者肝脏病变程度具有高度相关性因此本研究拟以肝为本源探究地五养肝胶囊通过抑制肝纤维化促肝再生的同时探讨逆转肝硬化血小板减少的活性成分和生物学基础网络药理学注重药物对疾病作用的整体性从活性成分、靶点、通路等方面对药物的治疗作用进行系统性的分析是目前探讨中药复方对疾病治疗药理作用机制的有力工具本研究分析了地五养肝胶囊对肝硬化合并血小板减少症的潜在抑制作用活性成分、调节作用靶点和关键信号通路 利用网络药理学相关工具筛选得到地五养肝胶囊抗肝硬化合并血小板减少症作用相关的活性核心成分包括槲皮素、异甘中西医结合肝病杂志 年第 卷第 期草苷、甘草次酸、绿原酸、五味子乙素等 本研究筛选得到地五养肝胶囊抗肝硬化血小板减少潜在关键靶点如、等均在慢性肝病的免疫调控、炎症反应、细胞迁移、细胞增殖和凋亡、铁死亡等生理过程中发挥重要作用以往对地五养肝胶囊的网络药理学研究分析地五养肝胶囊所含的活性成分其可能通过肝损伤修复、纤维降解途径等多种作用进而改善肝病患者肝损伤并未将铁死亡、自噬等信号通路纳入本研究结合网络药理学分析和文献调研发现其活性成分除作用肝硬化、肝损伤外均可一定程度上影响铁死亡信号通路如槲皮素可通过/途径抑制铁死亡、异甘草苷能够通过调控肝星状细胞中铁死亡相关蛋白 、和 表达抑制肝纤维化通过抑制 蛋白及 表达阻断 细胞的铁死亡进程、甘草次酸能抑制 信号通路激活并减少 产生进而抑制肝硬化病理过程、绿原酸能够可通过抑制/信号通路恢复铁稳态从而抑制铁死亡、五味子乙素可激活/信号通路抑制铁死亡途径 网络的构建也显示 可能为地五养肝胶囊逆转肝硬化血小板减少作用的潜在首要靶点 作为一种抑癌基因能够介导细胞信号转导调控细胞增殖、分化和凋亡等过程其亦可通过调节肝细胞脂 质 合 成 与 分 解、氧 化 磷 酸 化 和 水 平 参 与 铁死亡由于在肝脏疾病的不同发展阶段中均存在铁代谢紊乱、氨基酸抗氧化系统失衡和脂质过氧化物积累等铁死亡特征目前国内外研究认为铁死亡对于肝脏疾病的发生发展具有重要的调控作用 近期也有研究显示铁死亡与造血微环境密切相关且可显著抑制 合成 因此本研究团队推测地五养肝胶囊可能通过调控肝细胞铁死亡通路逆转肝硬化血小板减少作用铁死亡是一种铁依赖性细胞死亡途径在肝脏疾病以及血小板减少症的发生和发展中发挥重要作用 对铁死亡的不同调节作用可能与疾病微环境有关中医药干预 介导的铁死亡有双向调节及多通路多靶点的优势 诸多研究显示中药单体、单味中药、方剂、中成药以及艾灸等均对 介导的细胞铁死亡具有较好的改善作用 当前肝病研究领域对铁死亡的研究仍停留于理论层面其发生发展的完整机制尚不明确且中药调控从肝论治血小板减少症的研究尚浅均未深入研究阐明 本研究利用网络药理学将铁死亡途径相关靶点纳入肝硬化血小板减少症疾病靶点库的构建中构建地五养肝胶囊“中药成分靶点通路疾病”网络对该药多成分、多靶点、多通路间复杂的协同作用网络进行了阐述并对肝硬化血小板减少症相关性铁死亡关键靶点进行梳理 研究发现地五养肝胶囊调控肝硬化血小板减少与铁死亡途径的密切相关后期课题组拟通过体内外实验研究对其进行验证完善基于网络药理学对其作用机制的预测进一步探讨地五养肝胶囊逆转肝硬化血小板减少作用靶点和分子机制为丰富肝藏血理论、进一步探讨从肝论治血小板减少症提供科学的理论依据参考文献 赵丽红.肝炎肝硬化“肝藏血”功能异常表现与微观指标的相关性研究.北京中医药大学.():.():.李瑶周昕谢瑞芳.地五养肝胶囊治疗肝病的理论依据.河南中医():.肖锋万鸣高欢.地五养肝胶囊的定性研究.湖北中医杂志():.陈光亚金姝娜肖明中等.“补肾生髓成肝”治则下的地五养肝胶囊研究进展.中西医结合肝病杂志():.:.():.刘皎皎李瀚旻高翔等.“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究.中西医结合肝病杂志():.倪颖.基于“补肾生髓成肝”肝癌第三级预防方案的真实世界研究.湖北中医药大学.牛明张斯琴张博等.网络药理学评价方法指南解读.中草药():.:.李瑶周昕李瀚旻等.地五养肝胶囊 指纹图谱建立及 种成分测定.中成药():.李瀚旻.肝藏象肝脏中心说.世界中医药():.中西医结合肝病杂志 年第 卷第 期 杨芳艳陈钢柏琳娜等.黄帝内经“肝生血”机制探析.中华中医药杂志():.()():.李欲来.调肝论治血小板减少.中华中医药学会第二届岐黄论坛 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