诱导多能性干细胞-张严.ppt

诱导多能性干细胞2013.09.02.主要内容主要内容什么是诱导多能性干细胞？获取诱导多能性干细胞的基本原理诱导多能性干细胞的诱导培养与鉴定诱导多能性干细胞技术的研究进展诱导多能性干细胞的优缺点诱导多能性干细胞的发展历程与应用前景.干细胞干细胞具有无限制自我更新能力、同时也可分化成特定组织的细胞，在细胞发育过程中处于较原始阶段。包括：胚胎干细胞 成体干细胞：上皮干细胞 造血干细胞 神经干细胞 肌肉干细胞.人体胚胎干人体胚胎干(hES)细胞细胞优点：有潜力在体内发育成任何细胞类型缺点：(l)供体卵母细胞的来源困难,ES细胞建系效率低(2)免疫排斥反应(3)ES细胞具有成瘤性(4)体外保持ES细胞全能性的条件非常复杂(5)伦理学争论l胚胎干细胞（ES细胞）来源于哺乳动物胚胎发育早期的胚泡期的内细胞团，是最原始的干细胞.成体干细胞 成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。神经干细胞 造血干细胞 间充质干细胞 内皮干细胞.iPS通过基因转染技术(gene transfection)将某些转录因子导入动物或人的体细胞,使体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）细胞样的多潜能细胞。iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相似,而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。.获取获取IPS细胞的基本原理细胞的基本原理ES细胞和IPS细胞具有相同的基因。ES细胞中的与细胞多能性有关的基因能够表达，如：oct4，Sox2等。而已分化的体细胞中的这些基因不能表达。通过导入与多能性有关的外源基因来激活体细胞中的多能性基因，从而使体细胞从分化状态重编程为多能性干细胞。.iPS发展历程发展历程2006年日本京都大学山中伸弥Shinya Yamanaka领导的实验室在世界著名学术杂志细胞上率先报道了iPS的研究。他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这4种转录因子引入小鼠胚胎或皮肤纤维母细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等都与胚胎干细胞极为相似。.2007年年末，末，Thompson实验室和山中伸弥实验室几乎同时实验室和山中伸弥实验室几乎同时报道报道，利用，利用iPS技术同样可以诱导技术同样可以诱导人人皮肤纤维母细胞成为几皮肤纤维母细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞。乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞。所不同的是日本实验室依然采用了用所不同的是日本实验室依然采用了用逆转录病毒逆转录病毒引入引入Oct3/4、Sox2、c-Myc和和Klf4 4种因子组合，而种因子组合，而Thompson实验室则采用了以实验室则采用了以慢病毒载体慢病毒载体引入引入OCT4、SOX2加加NANOG和和LIN28这种因子组合。这种因子组合。这些研究成果被美国这些研究成果被美国科学科学杂志列为杂志列为2008年十大科技突年十大科技突破中的第破中的第1位。位。.2008年，哈佛大学年，哈佛大学George Daley实验室利用诱导细胞重实验室利用诱导细胞重新编程技术把采自新编程技术把采自10种种不同遗传病患者病人的皮肤细胞转不同遗传病患者病人的皮肤细胞转变为变为iPS，这些细胞将会在建立疾病模型、药物筛选等方面，这些细胞将会在建立疾病模型、药物筛选等方面发挥重要作用。发挥重要作用。美国科学家还发现，美国科学家还发现，iPS可在适当诱导条件下可在适当诱导条件下定向分化定向分化，如，如变成血细胞，再用于治疗疾病。变成血细胞，再用于治疗疾病。哈佛大学另一家实验室则发现利用病毒将哈佛大学另一家实验室则发现利用病毒将3种在细胞发育过种在细胞发育过程中起重要作用的转录因子引入小鼠胰腺外分泌细胞，可程中起重要作用的转录因子引入小鼠胰腺外分泌细胞，可以直接使其转变成与干细胞极为相似的细胞，并且可以分以直接使其转变成与干细胞极为相似的细胞，并且可以分泌胰岛素、有效降低血糖。这表明利用诱导重新编程技术泌胰岛素、有效降低血糖。这表明利用诱导重新编程技术可以直接获得某一特定组织细胞，而不必先经过诱导多能可以直接获得某一特定组织细胞，而不必先经过诱导多能干细胞这一步干细胞这一步。.2009年，中国科学家于年，中国科学家于2008年年11月利用月利用iPS细胞培育细胞培育出小鼠出小鼠“小小小小”中国科学院动物研究所周琪研究员和上海交通大学医中国科学院动物研究所周琪研究员和上海交通大学医学院曾凡一研究员领导的研究组合作完成的工作表明，学院曾凡一研究员领导的研究组合作完成的工作表明，利用利用iPS细胞能够得到成活的具有繁殖能力的小鼠，从细胞能够得到成活的具有繁殖能力的小鼠，从而在世界上第一次证明了而在世界上第一次证明了iPS细胞与胚胎干细胞具有相细胞与胚胎干细胞具有相似的多能性似的多能性。科学家表示，这一研究成果表明。科学家表示，这一研究成果表明iPS干细干细胞或许同胚胎干细胞一样可以作为治疗各种疾病的潜胞或许同胚胎干细胞一样可以作为治疗各种疾病的潜在来源。在来源。.国际学术权威杂志Science杂志刊登了北京大学生命科学学院邓宏魁教授和赵扬博士带领的研究团队在生命科学领域的一项革命性的研究成果用小分子化合物诱导体细胞重编程为多潜能干细胞。该成果开辟了一条全新的实现体细胞重编程的途径，给未来应用再生医学治疗重大疾病带来了新的可能。在这项研究中，邓宏魁团队仅使用四个小分子化合物的组合对体细胞进行处理就可以成功地逆转其“发育时钟”，实现体细胞的“重编程”。使用这项技术，他们成功地将已经特化的小鼠成体细胞诱导成为了可以重新分化发育为各种组织器官类型的“多潜能性”细胞，并将其命名为“化学诱导的多潜能干细胞（CiPS细胞）”。.人诱导性多能干细胞的建立-技术流程 流程图 Cell Stem Cell,2009.人诱导性多能干细胞的建立-克隆挑取 一次性玻璃巴氏吸管，需制备圆口（切割，剥离）和断口（吸取）两种 可挑克隆-有光滑边缘，胚胎干细胞样.人诱导性多能干细胞鉴定 形态鉴别与AP染色 Realtime PCR 检测多能性基因的表达水平。免疫荧光鉴定胚胎标志物的表达 多能性基因（Nanog,Oct4）启动子甲基化水平比较 基因芯片鉴定诱导性多能干细胞与胚胎干细胞在基因表达谱上的相似程度 核型鉴定 拟胚体实验验证分化潜能 畸胎瘤实验验证分化潜能.人诱导性多能干细胞鉴定-形态鉴别和AP染色 扁平，较高核质比 AP染色呈阳性 On feeder(100)AP staining(40)Matrigel(200).qPCR检测内源多能性基因与转基因表达水平.多能性标志物的检测.甲基化水平检测与核型鉴定.拟胚体畸胎瘤形成实验验证分化潜能.iPS优点优点与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不同，iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此没有伦理学的问题。利用iPS技术可以用病人自己的体细胞制备专用的干细胞，所以不会有免疫排斥的问题。iPS缺点缺点比如，添加4个“重新编程”基因或取代疾病细胞中有缺陷基因的方法都可能有导致癌症的副作用。.诱导性多能干细胞的安全性-成瘤风险 不同来源和方法来的iPSC 神经分化能力各不相同，都不如ESC的分化效率。不同组织来源的iPSC神经分化效率不同，移植的神经球成瘤效率iPSC 比ESC高。Yamanaka S.2009 NBT Zhang S.C.2010 PNAS.IPS细胞的应用前景用于器官移植建立疾病模型，了解发病机理治疗某些遗传病 如：患有镰刀型贫血症的小鼠皮肤成纤维细胞建立了IPSc，并将其移植到小鼠体内，小鼠的症状得以缓解。.实验方案1.培养小鼠骨髓间充质干细胞2.实验分组：对照 Fe3O4/Au RGD-Fe3O4/Au F3-Fe3O4/Au 每次用磁场处理30min，每隔4小时处理一次，共处理3天，在显微镜下实时观察细胞的形态变化。3.MTT 检测细胞数的变化。（酶标仪）4.流式细胞仪检测细胞周期。（流式细胞仪）5.收集细胞，用RT-PCR 检测基因的表达水平，包括:oct4,sox2,klf4,c-myc,nanog,utf1,rex1,fbxo15,dax1.（PCR仪）6.免疫荧光检测干细胞标志物：SSEA1，OCT4，NANOG，UTF1（荧光显微镜）7.NANOG，OCT4甲基化水平检测：送公司甲基化测序。.