基于Nrf2_HO-1通路探讨七叶皂苷钠对脑缺血再灌注继发肺损伤的保护作用.pdf

32中国合理用药探索CHINESE JOURNAL OF RATIONAL DRUG USE药 物新发现基于 Nrf2/HO-1 通路探讨七叶皂苷钠对脑缺血再灌注继发肺损伤的保护作用Protective Effect of Sodium Aescinate on Lung Injury Secondary to Cerebral Ischemia-Reperfusion Based on Nrf2/HO-1 Pathway许江飞，周海燕，王宽红作者简介许江飞，男，主治医师，专业方向：神经内科相关疾病的诊治。E-mail：。新乡市中心医院（新乡医学院第四临床学院）神经内科，新乡 453000XU Jiang-fei,ZHOU Hai-yan,WANG Kuan-hongDepartment of Neurology,Xinxiang Central Hospital(the Fourth Clinical College of Xinxiang Medical College),Xinxiang 453000,China摘要目的：探讨七叶皂苷钠对脑缺血再灌注（CIR）继发肺损伤的保护及其可能的作用机制。方法：采用改良 Zea-Longa 线栓法制备 CIR 模型，将大鼠分为假手术组（Sham 组，生理盐水）、CIR 模型组（Model 组，生理盐水）、七叶皂苷钠组（SA 组，10mg/kg）、核因子 E2 相关因子 2（Nrf2）抑制剂组（ML385 组，30mg/kg）、七叶皂苷钠联合 Nrf2 抑制剂组（SA+ML385组，10mg/kg SA+30mg/kg ML385），每组 12 只大鼠，连续给药 4 周。采用 HE 染色观察肺组织病理形态学变化；测定肺组织的湿/干重比（W/D）；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-（TNF-）水平；分别采用二氢乙锭、硫代巴比妥酸法、氮蓝四唑光还原法测定肺组织中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；采用免疫印迹（WB）法、免疫组化法分别检测 Nrf2、抗氧化响应元件（ARE）、血红素加氧酶 1（HO-1）蛋白表达。结果：与 Sham 组比较，Model 组肺损伤评分、肺组织的 W/D 值、BALF 中TNF-、IL-1、总细胞数量、多形核白细胞数量、ROS、MDA 水平均升高，SOD 水平、Nrf2、ARE、HO-1 蛋白表达降低（P0.05）。ML385 组肺损伤评分、肺组织的 W/D 值、BALF 中 IL-1、TNF-、总细胞数量、多形核白细胞数量、ROS、MDA 水平高于 Model 组，SOD 水平和 Nrf2、ARE、HO-1 蛋白表达低于 Model 组；SA 组和 SA+ML385 组肺损伤评分、肺组织的 W/D 值、BALF 中 IL-1、TNF-、总细胞数量、多形核白细胞数量、ROS、MDA 水平低于 Model 组，SOD 水平、Nrf2、ARE、HO-1 蛋白表达高于 Model 组（P0.05）。SA+ML385 组肺损伤评分、肺组织的 W/D 值、BALF 中 IL-1、TNF-、总细胞数量、多形核白细胞数量、ROS、MDA水平高于 SA 组、低于 ML385 组，SOD 水平、Nrf2、ARE、HO-1 蛋白表达低于 SA 组、高于 ML385 组（P0.05）。结论：七叶皂苷钠能够减轻 CIR继发肺损伤，其机制可能与激活 Nrf2/HO-1 通路，缓解炎症反应与氧化应激水平有关。关键词七叶皂苷钠；脑缺血再灌注；肺损伤；核因子 E2 相关因子 2；血红素氧合酶 1中图分类号 R743.3 文献标志码A 文章编号 2096-3327（2023）10-032-09DOI10.3969/j.issn.2096-3327.2023.10.005Abstract Objective:To investigate the potential protective effect of sodium aescinate on lung injury secondary to cerebral ischemia-reperfusion(CIR)and to explore the possible mechanism initially.Methods:CIR model was prepared by modified Zea-Longa method,and the rats were divided into the following groups:sham operation group(Sham group,saline),CIR model group(Model group,saline),sodium aescinate group(SA group,10mg/kg),nuclear factor E2-related factor 2(Nrf2)inhibitor group(ML385 group,30mg/kg),sodium aescinate combined with ML385 group(SA+ML385 group,10mg/kg SA+30mg/kg ML385),with 12 in each group.All rats were administered the respective treatment continuously for 4 weeks.The lung tissue was examined for pathological changes using HE staining.The wet/dry weight ratio(W/D)of the lung tissue was measured.The levels of interleukin-1(IL-1)and tumor necrosis factor-(TNF-)in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were determined using ELISA method.The levels of reactive oxygen species(ROS),malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)in the lung tissue were measured by 中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 322023/11/6 15:39:2333第 20 卷2023 年第 10 期药 物 新 发 现dihydroethidium,thiobarbituric acid method and nitrogen blue tetrazole photoreduction method,respectively.The expressions of Nrf2,ARE and HO-1 proteins were detected using immunohistochemistry and Western Blotting(WB).Results:Compared to the Sham group,the Model group showed significant increases in lung injury score,W/D value,TNF-,IL-1,total cell count,polymorphonuclear leukocyte number,ROS,and MDA levels in BALF(P0.05).Conversely,the SOD level and the expressions of Nrf2,ARE and HO-1 proteins were significantly decreased in the Model group(P0.05).In the ML385 group,the lung injury score,W/D value,IL-1,TNF-,total cell count,polymorphonuclear leukocyte count,ROS and MDA levels were significantly higher than those in the Model group.Conversely,the SOD level and the expression of Nrf2,ARE and HO-1 proteins were significantly lower than those in the Model group.In the SA group and the SA+ML385 group,the lung injury score,W/D value,IL-1,TNF-,total cell count,polymorphonuclear leukocyte count,ROS and MDA levels were significantly lower than those in the Model group.Conversely,the SOD level and expression of Nrf2,ARE and HO-1 proteins were significantly higher than in the model group(P0.05).In the SA+ML385 group,the lung injury score,W/D value,IL-1,TNF-,total cell count,polymorphonuclear leukocyte count,ROS and MDA levels were significantly higher than those in the SA group,lower than those in the ML385 group.Conversely,the SOD level and expression of Nrf2,ARE and HO-1 proteins in the SA group were significantly lower,but higher than that in the ML385 group(P0.05).Conclusion:Sodium aescinate has the potential to alleviate CIR-induced lung injury.This effect may be attributed to the activation of the Nrf2/HO-1 pathway,which subsequently reduces inflammatory response and oxidative stress level.Key words sodium aescinate;cerebral ischemia-reperfusion;lung injury;nuclear factor E2-related factor 2;heme oxygenase 1脑缺血为临床常见脑血管疾病之一，70%患者会发生脑缺血再灌注（cerebral ischemia-reper-fusion，CIR）损伤，CIR 损伤的死亡率达 10%，致残率高于 50%，再灌注不仅可造成脑组织缺血损伤，还会诱发远隔重要脏器（例如肺脏）损伤，这是造成患者死亡的重要原因之一1。核因子 E2 相关因子 2/血红素加氧酶 1（nuclear factor E2-related factor 2/heme oxygenase-1，Nrf2/HO-1）属于内源性抗氧化通路，既往研究显示激活 Nrf2/HO-1 通路对脑出血、脑梗死等多种脑损伤均具有重要的保护作用2-3，也有基础研究证实激活 Nrf2/HO-1 通路可减轻内毒素诱发的急性肺损伤4。降低再灌注继发性脏器损伤为治疗 CIR 的重要环节，但目前尚缺乏明确疗效的靶向药物。七叶皂苷钠（sodium aescinate）是从七叶树科植物天师栗中提取的多酯键三萜皂苷钠盐，临床研究显示其能够缓解脑出血患者的脑水肿，降低出血量5，然而对 CIR 引发的肺损伤是否有保护作用目前尚不清楚。本研究采用七叶皂苷钠对 CIR 大鼠进行干预，探究其对 CIR 引发肺损伤的改善作用，初步探讨作用机制，以期为药物应用提供一定依据。1 材料与方法1.1 实验动物SPF 级 雄 性 SD 大 鼠 74 只，810 周 龄，体重 200220g，由北京科宇动物养殖中心提供，许可证号：SYXK（京）2018-0036。所有大鼠均在23、50%湿度环境中统一饲养，大鼠自由饮食饮水。本研究符合实验动物管理条例，且经动物伦理委员会批准（伦理批号：20201028）。1.2 药品、试剂与仪器1.2.1 药品与试剂注射用七叶皂苷钠（武汉普生制药有限公司，国药准字 H20057826，规格 5mg，批号：180215）；Nrf2 特异性抑制剂（ML385）（美国 Selleck Che-micals 公司，规格 5mg，货号：846557-71-9）；水合氯醛、多聚甲醛购自德国 Sigma-Aldrich 公司，货号分别为 C8383、P6148；生理盐水（江西江蓝纯生物试剂有限公司，货号：JLC-E1400）；HE 染色试剂盒、RIPA 裂解液均购自碧云天生物技术研究所，货号分别为 C0105、P0013E；白介素-1（interleukin-1，IL-1）、肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒均购自北京百奥莱博科技有限公司，货号分别为 ZN2877-MBG、KFS230-AVD；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 332023/11/6 15:39:2334中国合理用药探索CHINESE JOURNAL OF RATIONAL DRUG USE药 物新发现盒、免疫组化试剂盒购自南京建成生物工程研究所，货号分别为 E004-1-1、A003-1-2、A001-3-2、I001-1；Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甲 醇 购 自 北 京 索 莱 宝生物科技有限公司，货号分别为 T1160、T8190、S8010、M9330；过氧化氢溶液（北京万佳首化生物科技有限公司，货号：SH-00546）；柠檬酸钠（德国默克公司，货号：PHR1416）；兔抗鼠 Nrf2、HO-1、抗氧化响应元件（antioxidant response element，ARE）抗体、核内参 LaminB 购自英国Abcam 公司，货号分别为 ab62352、ab137749、ab99975、ab16048；山羊抗兔 HRP 标记二抗、山羊抗鼠 HRP 标记二抗购自美国 CST 公司，货号分别为 14708、96714；鼠抗鼠-actin 抗体（美国RcD 公司，货号：MAB8929）。1.2.2 仪器Vi-Cell XR 细胞计数仪（美国贝克曼公司）；FA3004 电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；DHG-9023A 烤箱（上海精宏实验设备有限公司）；Centrifuge 5702 RH 离心机（德国 Eppendorf 公司）；JJ-2B 匀浆器（上海达洛科学仪器有限公司）；XDS-200C 倒置显微镜（蔡康光学仪器有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra1658033 垂直电泳仪、Mini-Trans Blot1703930 转膜仪购于美国 Bio-Rad 公司；CUT4062 石蜡切片机（德国 SLEE 公司）；Gel-Doc IT TS2 凝 胶 成 像 仪（美 国 UVP公司）。1.3 CIR 大鼠模型建立参照改良 Zea-Longa 线栓法构建 CIR 模型6。随机选取 62 只大鼠，经腹腔注射 10%水合氯醛麻醉后，在颈部正中部位做一切口，将左颈总动脉、左颈外动脉及左颈内动脉依次分离，于左颈外动脉远端用棉线环向缠绕 1cm 结扎。将栓线插入左颈总动脉，沿着左颈总动脉及左颈内动脉推送入大脑中动脉起始处，推入深度距离分叉部位 2cm，阻断大脑中动脉血流，2h 后将栓线从左颈总动脉缓慢抽出，使中动脉血流恢复（即缺血再灌注），24h 后缝合颈部切口。大鼠清醒 2h 后，依据 Zea Longa 标准进行评分7，评分为 13 分者即认为造模成功，纳入研究。本研究的模型制备过程中共 14 只大鼠死亡，造模成功率为 77.42%。1.4 大鼠分组方法与给药处理选取造模成功的 48 只大鼠，依据随机数字表法分为 CIR 模型（Model）组、七叶皂苷钠（SA）组、Nrf2 抑制剂（ML385）组、七叶皂苷钠联合 Nrf2抑制剂（SA+ML385）组，每组 12 只。另选取 12只大鼠作为假手术（Sham）组，即不植入栓线，其他操作与 Model 组相同。造模结束后，SA 组给予注射用七叶皂苷钠，尾静脉注射，剂量为 10mg/kg8；ML385 组给予Nrf2 特异性抑制剂（ML385），尾静脉注射，剂量为30mg/kg9；SA+ML385 组尾静脉注射 10mg/kgSA，15min 后注射 30mg/kg ML385；Sham、Model组尾静脉注射等体积生理盐水。各组均连续给药4 周。1.5 观察指标与检测方法1.5.1 样本收集末次给药处理后，将大鼠麻醉处死，左肺用1.8 mm 气管插管行支气管肺泡灌洗，灌洗液用量为 2.5ml/次，回收率 80%，共灌洗 5 次，得到支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）；取右肺上叶组织，清洗后部分组织用 4%多聚甲醛固定，部分组织用于制备肺组织匀浆液；右肺中叶组织用于评估肺的湿/干重比（wet/dry，W/D）；右肺下叶组织置于-80保存。1.5.2 CIR 大鼠肺组织病理形态学变化及肺组织病理损伤程度取出 4%多聚甲醛固定的肺组织，经脱水、透明、石蜡包埋后用切片机制备 5m 肺组织石蜡切片，烘烤、脱蜡脱水后参照 HE 染色试剂盒说明书对肺组织切片进行染色，封片后置于倒置显微镜下观察并保存病理形态学图片。采用半定量法10评估肺中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 342023/11/6 15:39:2335第 20 卷2023 年第 10 期药 物 新 发 现组织病理损伤程度，评价项目包括肺泡充血、炎症细胞浸润、间质水肿、肺泡水肿及肺泡壁厚度，每个项目 04 分，共 20 分，评分越高代表损伤越严重。1.5.3 CIR 大鼠肺组织的干重、湿重采用电子天平称取右肺中叶组织的重量，记录湿重（wet，W）；将右肺中叶组织置于 80烤箱中，当两次测量重量差不超过 0.2mg 时即为恒重，记录干重（dry，D）；计算肺组织的 W/D 值。1.5.4 CIR 大鼠 BALF 中的炎症因子水平与炎症细胞计数将 BALF 在 4、3000r/min 的 条 件 下 离 心10min 后，保 留 上 清 液，采 用 ELISA 法 检 测BALF 上清液中 TNF-、IL-1水平（参照相关试剂盒说明书进行操作）；采用全自动细胞计数仪测定 BALF 原液中总细胞数、多形核白细胞数量。1.5.5 CIR 大鼠肺组织中的 SOD、MDA、ROS水平称取 1mg 肺组织，添加 9ml 生理盐水，研磨后置于匀浆器中制备匀浆液。采用硫代巴比妥酸法检测 MDA 水平；采用氮蓝四唑光还原法检测组织 SOD 水平；采用二氢乙锭（dihydroethidium，DHE）法11检测肺组织中 ROS 相对水平。1.5.6 免疫印迹（Western blotting，WB）法测定 CIR 大鼠肺组织 Nrf2、ARE、HO-1 蛋白表达水平实验开始前先进行配液：电泳缓冲液（5）配制：Tris 15.1g，甘氨酸 72.0g，SDS 5.0g，蒸馏水定容至 1L，pH 调至 8.3，制得电泳缓冲液（5），置于4保存。使用时将电泳缓冲液（5）稀释为电泳缓冲液（1），即：取 200ml 电泳缓冲液（5），蒸馏水定容至 1L，即得。转膜缓冲液配制：甘氨酸 2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，600ml 蒸馏水充分溶解，加200ml 甲醇后混匀，定容至 1L，现配现用。配液完成后，取-80保存的右肺下叶组织，加入 RIPA 裂解液裂解，冰浴匀浆后，4 12000r/min 离心 20min，上清液即为蛋白样本。测定蛋白含量后，取 20g 蛋白行 10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳，将凝胶转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用 山羊血清封闭膜，清洗后用 Nrf2、ARE、LaminB、HO-1、-actin 一抗（1300）孵育，4过夜。洗涤后于 37下用山羊抗兔 HRP 标记二抗或山羊抗鼠 HRP 标记二抗（13000）孵育 2h。经增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显色后，在凝胶成像仪中观察成像情况，以鼠抗鼠-actin 抗体为内参蛋白，采用 ImageJ 1.8.0 软件对蛋白相对表达情况进行分析。1.5.7 免 疫 组 化 法 检 测 CIR 大 鼠 肺 组 织 Nrf2、ARE、HO-1 阳性表达情况肺组织石蜡切片经脱蜡水化后加入过氧化氢溶液，浸泡 10min 以消除内源性过氧化酶，清洗后加入柠檬酸钠进行抗原热修复，滴加山羊血清后室温下封闭 20min，用兔抗鼠 Nrf2、ARE、HO-1 一抗及鼠抗鼠-actin 一抗（1300）于 4孵育，过夜，用山羊抗兔 HRP 标记二抗或山羊抗鼠 HRP 标记二抗（13000）室温下孵育 45min，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色后行苏木精复染、氨水反蓝，经脱水、透明、封片后进行镜检，利用 ImageJ 1.8.0 软件分析 Nrf2、ARE、HO-1 阳性表达率，蛋白阳性表达率=视野下阳性染色细胞数/细胞总数 100%。1.6 统计学方法采用 SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以xs 表示，多组间比较行单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P0.05 为有统计学差异。2 结果2.1 CIR 大鼠肺组织病理形态学变化及肺组织病理损伤程度Model 组、ML385 组肺组织中肺血管及肺泡中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 352023/11/6 15:39:2336中国合理用药探索CHINESE JOURNAL OF RATIONAL DRUG USE药 物新发现隔膜毛细血管扩张，肺泡壁变厚，肺泡腔变窄，肺泡隔变宽，伴有炎症细胞浸润，肺间质出现水肿、充血；与 Model 组比较，SA 组、SA+ML385 组均明显改善。各组大鼠肺组织 HE 染色结果见图 1。与 Sham 组 比 较，Model 组 肺 损 伤 评 分 升高（P0.05），证明 CIR 模型构建成功。ML385组 肺 损 伤 评 分 高 于 Model 组（P0.05）。SA组、SA+ML385 组 肺 损 伤 评 分 低 于 Model 组，且 SA+ML385 组肺损伤评分高于 SA 组、低于ML385 组（P0.05）。各组大鼠肺损伤评分趋势见图 2。2.2 CIR 大鼠肺组织的 W/D与 Sham 组比较，Model 组肺组织的 W/D 值升 高（P0.05）。ML385 组 肺 组 织 的 W/D 值 高ShamModelSASA+ML385ML385HESham：假手术组；Model：CIR 模型组；SA：七叶皂苷钠组；SA+ML385：七叶皂苷钠联合 Nrf2 抑制剂组；ML385：Nrf2 抑制剂组。下文同图 1各组大鼠肺组织 HE 染色结果（100）于 Model 组（P0.05）。SA 组、SA+ML385 组肺组织的 W/D 值低于 Model 组，且 SA+ML385组肺组织的 W/D 值高于 SA 组、低于 ML385 组（P0.05）。各组大鼠肺组织的 W/D 趋势见图 3。2.3 CIR 大鼠 BALF 中的炎症因子水平与炎症细胞计数与 Sham 组 比 较，Model 组 BALF 中 IL-1 、TNF-、总细胞数量、多形核白细胞数量均升高（P0.05）。ML385 组 BALF 中各指标均高于 Model组（P0.05）。SA 组、SA+ML385 组 BALF 中各指标均低于 Model 组，且除 TNF-外，SA+ML385组 BALF 中 各 指 标 高 于 SA 组、低 于 ML385 组（P0.05）。各组 BALF 中的 IL-1 、TNF-、总细胞数量、多形核白细胞数量趋势见图 4。与 Sham 组比较，a：P0.05；与 Model 组比较，b：P0.05；与 SA 组比较，c：P0.05；与 ML385 组比较，d：P0.05。下文同图 2各组大鼠肺损伤评分结果（n=12）图 3各组肺组织的 W/D 值比较（n=12）051015ShamModelSASA+ML385肺组织的 W/D 值aababcdML385abc051015ShamModelSASA+ML385肺损伤评分（分）aababcdML385abc20中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 362023/11/6 15:39:2537第 20 卷2023 年第 10 期药 物 新 发 现图 4各组 IL-1、TNF-、总细胞数量、多形核白细胞数量比较（n=12）2.4 CIR 大 鼠 肺 组 织 中 的 SOD、MDA、ROS 水平与 Sham 组 比 较，Model 组 ROS、MDA 水平 均 升 高，SOD 水 平 降 低（P0.05）。ML385 组ROS、MDA 水平高于 Model 组，SOD 水平低于Model 组（P0.05）。SA 组和 SA+ML385 组 ROS、MDA 水平低于 Model 组，SOD 水平高于 Model 组；SA+ML385 组 ROS、MDA 水平高于 SA 组，SOD水平低于 SA 组、高于 ML385 组（P0.05）。各组ROS、MDA、SOD 水平趋势见图 5。2.5 CIR 大鼠肺组织 Nrf2、ARE、HO-1 蛋白表达与 Sham 组 比 较，Model 组 肺 组 织 Nrf2、0100200300表达水平（pg/ml）aababcdabcaababcdabcIL-1TNF-aababcdabcaababcdabc总细胞多形核白细胞细胞数量（105/ml）ShamModelSASA+ML385ML385图 5各组 ROS、MDA、SOD 水平比较（n=12）051020150100200300水平（U/ml）aababcdabcaababcdabcSODROS4000248ShamModelSASA+ML385MDA 水平（mmol/ml）aababcdML385abc6ShamModelSASA+ML385ML385ARE、HO-1 蛋 白 表 达 降 低（P0.05）。ML385组 Nrf2、ARE、HO-1 蛋 白 表 达 低 于 Model 组（P0.05）。SA 组 和 SA+ML385 组 Nrf2、ARE、HO-1 蛋 白 表 达 高 于 Model 组；SA+ML385 组Nrf2、ARE、HO-1 蛋白表达低于 SA 组、高于ML385 组（P0.05），各 组 Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达量趋势见图 6。2.6 CIR 大鼠肺组织 Nrf2、ARE、HO-1 阳性表达情况与 Sham 组 比 较，Model 组 肺 组 织 Nrf2、ARE、HO-1 阳 性 表 达 降 低（P0.05）。ML385组 Nrf2、ARE、HO-1 阳 性 表 达 低 于 Model 组（P0.05）。SA 组 和 SA+ML385 组 Nrf2、ARE、中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 372023/11/6 15:39:2538中国合理用药探索CHINESE JOURNAL OF RATIONAL DRUG USE药 物新发现HO-1 阳 性 表 达 高 于 Model 组；SA+ML385 组Nrf2、ARE、HO-1 阳性表达低于 SA 组、高于ShamModelSASA+ML385ML385-actinNrf2ARELaminBHO-1aababcdabcaababcdabcaababcdabc0.00.51.01.5蛋白表达Nrf2AREHO-1ShamModelSASA+ML385ML385图 6各组肺组织 Nrf2、ARE、HO-1 蛋白表达水平变化（n=12）ML385 组（P0.05）。各 组 Nrf2、ARE、HO-1蛋白阳性表达见图 7。Nrf2AREHO-1ShamModelSASA+ML385ML385aababcdabcaababcdabcaababcdabc0204060阳性表达率（%）Nrf2AREHO-180ShamModelSASA+ML385ML385图 7各组 Nrf2、ARE、HO-1 蛋白阳性表达比较（n=12）中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 382023/11/6 15:39:2939第 20 卷2023 年第 10 期药 物 新 发 现3 讨论本研究采用改良 Zea-Longa 线栓法6构建CIR 致肺损伤大鼠模型，结果发现 Model 组肺组织出现肺泡壁变厚，肺泡腔变窄，肺泡隔变宽，伴有炎症细胞浸润，且伴有肺间质水肿、充血，大鼠肺组织的 W/D 值升高，以上结果说明 Model 组大鼠肺组织发生严重炎症性损伤及病理改变，符合肺损伤大鼠模型特征，提示造模成功。七叶皂苷钠是从中药天师栗果实中提取的重要活性成份，药理学研究结果提示其具有修复毛细血管通透性、消肿、抗炎等功效12，有临床研究表明七叶皂苷钠在治疗脑出血、脑水肿方面疗效较佳13。七叶皂苷钠可通过调控缺氧诱导因子-1发挥对心肺复苏后大鼠脑组织的保护作用14，但其对 CIR致脑损伤的治疗作用尚不明确。本研究发现经七叶皂苷钠干预后，大鼠肺组织病理学得到明显改善，肺组织评分降低，肺组织的 W/D 值降低，提示七叶皂苷钠可以缓解 CIR 所致大鼠肺组织水肿，缓解肺组织的炎症反应。肺组织中的肺泡巨噬细胞能够释放大量的 IL-1 、TNF-等促炎性细胞因子，进一步扩大炎症反应。此外 IL-1、TNF-水平升高能够加速中性粒细胞浸润至肺组织损伤区，扩大组织炎症反应，造成恶性循环15。基础研究显示，抑制 IL-1分泌可缓解大鼠肺损伤16。本研究发现，Model 组肺组织 BALF 中 IL-1、TNF-、总细胞数量、多形核白细胞数量均升高，经七叶皂苷钠干预后各指标均降低，提示七叶皂苷钠可能通过抑制肺组织炎症因子释放而降低炎症反应，缓解肺组织损伤。Nrf2 为细胞核转录因子，一般与 Keap1 结合并存在于细胞质内，当受到氧化应激刺激后，Nrf2与 Keap1 解离，移位到细胞核中与 ARE 蛋白结合调控下游 HO-1 等抗氧化酶，发挥抗氧化作用17。Nrf2/HO-1 与脑组织氧化损伤有关，过往研究显示激活 Nrf2/HO-1 通路有利于降低脑组织的氧化应激反应，发挥脑损伤的神经保护作用18。Li等19发现淫羊藿苷可通过激活 Nrf2/HO-1 通路而减轻脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织氧化应激水平；Cattani 等20发现激活 Nrf2/HO-1 可减弱小鼠肺组织氧化应激、减弱 NF-B/TNF-途径而降低炎症反应。然而 Nrf2/HO-1 与 CIR 继发肺损伤的关系目前尚不明确。本研究中，Model 组大鼠肺组织中 Nrf2、ARE、HO-1 表达水平降低，提示CIR 继发肺损伤发生可能与 Nrf2/HO-1 信号通路的抑制有关。经七叶皂苷钠干预后，大鼠肺组织中Nrf2、ARE、HO-1 表达水平升高，推测七叶皂苷钠缓解 CIR 大鼠肺部炎症反应的作用可能与 Nrf2/HO-1 信号通路的激活有关。脑损伤或脑出血后，脑组织中会释放大量 ROS，造成氧自由基增多，并进一步导致 SOD 减少，MDA 等氧化物质增多，加重氧化应激损伤21。本研究中，Model 组 MDA、ROS 水平均升高，SOD 水平降低；经七叶皂苷钠干预后，MDA、ROS 水平均降低，SOD 水平升高，提示七叶皂苷钠可能通过激活 Nrf2/HO-1 信号通路降低 CIR 引发的氧自由基堆积，发挥抗氧化作用。为证实这一推测，本研究采用 Nrf2 特异性抑制剂处理 CIR 大鼠发现，经 Nrf2 特异性抑制剂干预后，CIR 大鼠肺组织损伤更为严重，BALF 中炎症因子表达水平及炎症细胞数量均高于 Model 组，肺组织中 Nrf2、ARE、HO-1 表达水平均低于 Model 组，提示抑制 Nrf2 表达后能够加重 CIR 后肺组织炎症反应及氧化应激水平，加重肺损伤；Nrf2 特异性抑制剂联合七叶皂苷钠干预后发现，大鼠肺部炎症反应、肺损伤得到一定缓解，进一步说明七叶皂苷钠能够通过激活 Nrf2/HO-1 信号通路，降低 CIR 后肺组织炎症反应及氧化应激水平，改善肺组织损伤。综上所述，七叶皂苷钠可在一定程度上改善CIR 继发肺损伤，其机制可能与激活 Nrf2/HO-1信号通路、降低 CIR 后肺组织炎症反应及氧化应激水平有关。本研究也存在一定的缺陷，例如 CIR 继发肺损伤发生机制较为复杂，七叶皂苷钠是否还可能通过参与其他信号通路对 CIR 继发肺损伤的保护中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 392023/11/6 15:39:2940中国合理用药探索CHINESE JOURNAL OF RATIONAL DRUG USE药 物新发现作用还有待后续深入探究。参 考 文 献1 LI WL，PAN R，QI ZF，et al.Current progress in searching for clinically useful biomarkers of blood-brain barrier damage following cerebral ischemiaJ.Brain Circ，2018，4（4）：145-152.2 WEI CC，KONG YY，LI GQ，et al.Nicotinamide mononucleotide attenuates brain injury after intracerebral hemorrhage by activating Nrf2/HO-1 signaling pathwayJ.Sci Rep，2017，7（1）：717.3 ZHANG JB，SHI X，CHEN Z，et al.Edaravone reduces iron-mediated Hydrocephalus and behavioral disorder in rat by activating the Nrf2/HO-1 pathwayJ.J Stroke Cerebrovasc Dis，2018，27（12）：3511-3520.4 巩红岩，郑芳，贾