坏死性凋亡对牙周炎免疫微环境的影响机制初探.pdf

口腔颌面外科杂志 2023 年 10 月 第 33 卷 第 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 298 坏死性凋亡对牙周炎免疫微环境的影响机制初探郑章龙，李家，姜吉蕊，单铮男，李生娇（同济大学口腔医学院，同济大学附属口腔医院口腔颌面外科，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，上海200072）摘要 目的：探索坏死性凋亡对牙周炎免疫微环境的影响及机制初探。方法：筛选出牙周炎中差异表达的坏死性凋亡相关基因，通过机器学习算法计算其中的核心基因并构建诊断模型。分别分析牙周炎与健康组中的免疫细胞相对丰度，并计算其与坏死性凋亡相关基因的相关性。收集人健康牙龈与炎症牙龈组织，并提取其 RNA，通过实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)验证坏死性凋亡核心基因的组间表达。结果：共有 10 个坏死性凋亡相关基因差异表达，其中核心基因共有 8 个，炎症组织相对于健康组织，浆细胞、B 细胞、中性粒细胞与 NK 细胞含量升高，而巨噬细胞、休眠树突状细胞含量下降。其中，混合系激酶域样伪激酶（mixed lineage kinase domain like pseudokinase，MLKL)、黑色素瘤缺乏因子 2(absent in melanoma 2，AIM2)与浆细胞表达量呈显著正相关。结论：坏死性凋亡对牙周炎免疫微环境存在影响。关键词坏死性凋亡；牙周炎；基因芯片；免疫微环境中图分类号 R782 文献标志码 ADOI：10.12439/kqhm.1005-4979.2023.05.004Mechanism and relevance of necroptosis to immune microenvironment of periodontitis:A pilot studyZHENG Zhanglong,LI Jia,JIANG Jirui,SHAN Zhengnan,LI Shengjiao(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatological Hospital and Dental School of Tongji University,Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration,Shanghai 200072,China)Abstract Objective:To explore the effect and mechanism of necroptosis on the immune microenvironment of periodontitis.Methods:We screened out the differentially expressed necroptosis-related genes in periodontitis,first calculated the hub genes through machine learning algorithms,and constructed a diagnostic model.Then the relative abundance of immune cells in the periodontitis and healthy groups was analyzed and its correlation with necroptosis-related genes was calculated.Collect healthy and inflammatory gingival tissues from individuals and extract RNA,then validate the inter-group expression level of necroptosis-related genes using real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR).Results:A total of 10 necroptosis-related genes were differentially expressed,including 8 hub genes.Compared with healthy tissues,the relative infiltration of plasma cells,B cells,neutrophils and NK cells in periodontal inflammatory tissues were increased.The relative infiltration of macrophages and resting dendritic cells decreased.Among them,absent in melanoma 2(AIM2),mixed lineage kinase domain like pseudokinase(MLKL)were significantly positively correlated with the expression of plasma cells.Conclusion:Necroptosis affects the immune microenvironment of periodontitis.Keywordsnecroptosis;periodontitis;gene microarray;immune microenvironment收稿日期：2023-02-01接受日期：2023-04-20基金项目：上海市自然科学基金项目（22ZR1467200）作者简介：郑章龙，硕士研究生.E-mail:通信作者：李生娇，副教授.E-mail:基础研究牙周炎是一类由牙菌斑生物膜为始动因素的牙周组织感染性疾病，会影响牙龈、牙周膜及牙槽骨，导致牙龈出血、牙槽骨吸收，严重情况下可以导致牙齿脱落1。牙周炎同时可以导致多种系统性疾病。其中，2 型糖尿病、阿尔茨海默病、风湿性关节炎、新生儿低体重及心血管疾病等均被证实与牙周炎密切相关，对人类健康造成很大威胁，给社会造成严重经济负担2。近年来研究25表明，牙周炎并非由单一病原体引起，而是由局部免疫平衡紊乱所导致的。尽管近年来对牙周炎的认识不断加深，但是人类对牙周炎的易感性和其导致的牙周支持组织破坏的分子机制仍知之甚少。口腔颌面外科杂志 2023 年 10 月 第 33 卷 第 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 299 程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）包括凋亡、焦亡、铁死亡及坏死性凋亡，在限制病原体引起的感染中发挥关键作用6。最近的研究7表明，坏死性凋亡是一种受调控的细胞死亡方式，主要依赖于受体交互丝氨酸-苏氨酸激酶 3（receptor-in-teracting serine/threonine-protein kinase 3，RIPK3）、受体交互丝氨酸-苏氨酸激酶 1（receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1，RIPK1）和 混 合 系激酶域样伪激酶（MLKL），起到维持免疫平衡作用。尽管已存在关于坏死性凋亡对牙周炎的影响的研究8-9，但其中大多数只关注单一通路或单一分子，使用大量样本系统性研究坏死性凋亡对牙周炎的影响还处于空白。坏死性凋亡影响牙周炎免疫微环境的潜在机制尚不清楚。为了更好地了解牙周炎免疫微环境中坏死的潜在机制，我们开展了这项系统研究。1材料和方法1.1数据收集与整理从 GEO 数据库下载 GSE16134 数据集、GSE10334数据集，其中分别包含 69 个健康样本和 241 个疾病样本，64 个健康样本和 183 个疾病样本。使用R 软件中的 AnnoProbe 软件包将探针 ID 转换为基因名。在本研究中，GSE16134 作为主要探索数据集，GSE10334 则作为外部验证数据集。坏死性凋亡相关基因从 GeneCards 数据库（https：/www.genecards.org/）中以“necroptosis”为关键词检索获取，检索结果中将相关性分数大于 1.64 的 35 个基因纳入本次研究。1.2筛选与坏死性凋亡相关的牙周炎核心基因并构建诊断模型使用 R 软件中的“limma”包10进行差异基因分析，其中校正后 P 值小于 0.01 者被定义为差异基因，使用 R 软件中的“glmnet”11软件包中的最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）模 型 筛 选 这 10 个差异基因中的核心基因。之后，根据这 8 个核心基因（CASP6、MLKL、PELI1、AIM2、CFLAR、CTSB、MAPK14、FAS）的表达量建立广义线性模型。并依据此模型计算每个样本的风险分数。使用 R 语言中的“glm”函数，基于核心基因的表达量构建诊断模型。使用“predict”函数，根据诊断模型对芯片样本进行打分，打分结果定义为罹患牙周炎的风险。1.3坏死性凋亡与牙周炎免疫微环境的关系使用 CIBERSORT 算法 12与内置 22 种免疫细胞数据重复迭代 1 000 次估算牙周炎患者组织中免疫细胞成分及浸润程度，保留 P0.05）；CASP6 的相对表达量下降（P0.05）；FAS、CFLAR 的相对表达量变化不显著。3讨论牙周炎是一类影响牙周软硬组织的慢性感染性疾病，是成年人失牙的首要原因。近年来，尽管在诊断与治疗牙周炎上取得了很大进步，但目前对于牙周炎发生、发展的潜在分子机制仍然未知。越来越多的证据1316表明，免疫失调在牙周炎发生过程中起到重要作用。作为一种程序性细胞死亡，坏A.免疫细胞在牙周炎组与健康组中的相对浸润程度，*表示 P0.05，*表示 P0.01，*表示 P0.001，与健康组比较；B.NRGs 中的核心基因表达量与免疫细胞浸润的相关性散点图，其中AIM2与MLKL表达量与浆细胞浸润程度呈显著正相关；C、D.AIM2与MLKL在牙周炎症中表达量升高。图 4牙周炎免疫微环境初探Figure 4An initial investigation into the immune microenvironment in periodontitis?口腔颌面外科杂志 2023 年 10 月 第 33 卷 第 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 303 死性细胞凋亡与免疫密切相关。就目前而言，坏死性凋亡对免疫的影响主要存在于肿瘤的研究中，大量的研究也已经证实了其在肿瘤免疫中发挥作用。因此我们认为，坏死性凋亡在牙周炎免疫中也可能发挥功能，为了初步判断坏死性凋亡对牙周炎免疫微环境的影响，我们进行了以下研究。基于生物信息学，我们使用了一系列算法对牙周炎患者转录组芯片数据进行了分析。首先，我们通过差异分析找到了在牙周炎症组中差异表达的坏死性凋亡相关基因。这些差异基因彼此关联、相互影响，构成了坏死性凋亡相关基因调控网络。之后，我们使用“LASSO”这一机器学习算法筛选差异基因中的核心基因。“LASSO”是一种惩罚回归方法，通过最大化对数似然函数（或残差平方和）来估计回归系数，对不必要的变量则进行正则化压缩，以删除变量减少过拟合。我们将 LASSO 算法筛选后得到的 8 个基因定义为牙周炎坏死性凋亡核心基因。随后我们对这 8 个基因的表达量进行多变量逻辑回归以构建诊断模型，经 AUC 分析后发现，此模型可以很好地区分炎症组织与健康组织。由于坏死性凋亡对免疫微环境具有较强的影响17-18，因此我们使用 CIBERSORT 算法估算了牙周组织芯片数据中免疫细胞丰度，结果表明，相较于健康组织，浆细胞、T 细胞、中性粒细胞、NK 细胞在炎症组织中，浸润程度明显提高，而巨噬细胞、休眠树突状细胞等浸润程度明显降低，与传统生物学背景相符。为了初步探究坏死性凋亡对牙周炎免疫微环境的影响，我们随后对核心基因与免疫细胞进行了相关性分析，结果显示，AIM2、MLKL、CTSB 表达量与浆细胞浸润程度呈高度正相关，与休眠树突状细胞浸润程度呈显著负相关，CASP6 与休眠肥大细胞呈显著正相关。CTSB 是溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族成员，可降解多种胶原蛋白和弹性蛋白19。在牙周炎组织中，由于炎症导致细胞溶酶体膜稳定性下降，组织蛋白酶 B 表达量升高，继而导致细胞坏死，加重炎症反应，形成正反馈。Cox 等20发现，在体外培养的慢性牙周炎患者的成纤维细胞中，组织蛋白酶 B高表达。McComb 等21发现组织蛋白酶 B 可通过剪切 Rip1 激酶抑制巨噬细胞坏死性凋亡，提示其可能在炎症中发挥双重作用。CASP6 是半胱氨酸蛋白酶家族成员，在调节细胞死亡、非特异性免疫与细胞稳态中发挥重要作用22。Zheng 等23研究发现，CASP6 表达量降低可以显著增加细胞被感染概率，是甲型流感病毒IAV 介导的坏死性凋亡中所不可或缺的。目前关于 CASP6 在牙周病学中的研究较少。在我们的生物信息学分析及之后的生物学验证中，CASP6 表达均显著降低，提示其可能是一个潜在的牙周炎治疗靶点。MAPK14 在髓系细胞中高表达24。在我们的分析中，MAPK14 与休眠树突状细胞呈现比较高的正相关。既往研究24表明，MAPK14 可以调控血管内皮细胞黏附分子 1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1）参与免疫细胞的增殖和分化，在受到外界应激、感染、炎症等刺激时，其表达量升高。在我们的分析中，MAPK14 表达量下降，但在后续验证中，MAPK14 表达量明显上升。这提示了我们生物信息学分析也是有局限性的，最终的结果还是要经过实验验证。MLKL 与 AIM2 均是研究较为充分的坏死性凋亡基因，在我们的研究中，其与浆细胞相对浸润程度呈显著正相关，提示其可能参与了牙周炎中浆细胞的坏死性凋亡。据我们所知，这是首次提出MLKL 与 AIM2 可能通过影响浆细胞坏死性凋亡继而对牙周炎发展产生影响的报道。综上所述，尽管 8 个坏死性凋亡核心基因通过A.FAS、MAPK14、MLKL、PELI1 的相对表达水平；B.AIM2、CASP6、CFLAR、CTSB 的相对表达水平。*表示 P0.05，与健康组比较。图 5RT-qPCR 验证核心基因在牙周炎症组中的表达变化Figure 5 Validation of differential expressions of hub genes in periodontitis samples by RT-qPCR?*?口腔颌面外科杂志 2023 年 10 月 第 33 卷 第 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 304 RT-qPCR 进行了验证，但是由于条件所限导致样本量较小，未来仍需要用更大的样本量进行实验验证。除此之外，这 8 个基因在牙周炎免疫微环境中的具体作用机制仍然需要通过进一步的机制实验进行确定。参考文献：1 Slots J.Periodontitis:Facts,fallacies and the futureJ.Periodontol 2000,2017,75(1):7-23.2 Cardoso EM,Reis C,Manzanares-Cspedes MC.Chronic periodontitis,inflammatory cytokines,and interrelationship with other chronic diseasesJ.Postgrad Med,2018,130(1):98-104.3 Hajishengallis G.Periodontitis:From microbial immune subversion to systemic inflammationJ.Nat Rev Immunol,2015,15(1):30-44.4 Schaefer AS.Genetics of periodontitis:Discovery,biology,and clinical impactJ.Periodontol 2000,2018,78(1):162-173.5 Zhou N,Zou FG,Cheng X,et al.Porphyromonas gingivalis induces periodontitis,causes immune imbalance,and promotes rheumatoid arthritisJ.J Leukoc Biol,2021,110(3):461-473.6 Nagata S,Tanaka M.Programmed cell death and the immune systemJ.Nat Rev Immunol,2017,17(5):333-340.7 Galluzzi L,Kepp O,Chan FK,et al.Necroptosis:Mecha-nisms and relevance to diseaseJ.Annu Rev Pathol,2017,12:103-130.8 Ke XJ,Lei L,Li H,et al.Manipulation of necroptosis by Porphyromonas gingivalis in periodontitis developmentJ.Mol Immunol,2016,77:8-13.9 Dai XZ,Ma RY,Jiang WY,et al.Enterococcus faecalis-in-duced macrophage necroptosis promotes refractory apical periodontitisJ.Microbiol Spectr,2022,10(4):e0104522.10 Ritchie ME,Phipson B,Wu D,et al.Limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studiesJ.Nucleic Acids Res,2015,43(7):e47.11 Engebretsen S,Bohlin J.Statistical predictions with glmnetJ.Clin Epigenetics,2019,11(1):123.12 Newman AM,Liu CL,Green MR,et al.Robust enumera-tion of cell subsets from tissue expression profilesJ.Nat Methods,2015,12(5):453-457.13 Tang H,Yuan S,Chen T,et al.Development of an immune-related lncRNA-miRNA-mRNA network based on competing endogenous RNA in periodontitisJ.J Clin Periodontol,2021,48(11):1470-1479.14 Li W,Zhang Z,Wang ZM.Differential immune cell infil-trations between healthy periodontal and chronic periodon-titis tissuesJ.BMC Oral Health,2020,20(1):293.15 He LF,Liu LJ,Li T,et al.Exploring the imbalance of periodontitis immune system from the cellular to molecular levelJ.Front Genet,2021,12:653209.16 Xiang JW,Huang WK,He YD,et al.Construction of artificial neural network diagnostic model and analysis of immune infiltration for periodontitisJ.Front Genet,2022,13:1041524.17 Gong YT,Fan ZY,Luo GP,et al.The role of necroptosis in cancer biology and therapyJ.Mol Cancer,2019,18(1):100.18 Lu J,Yu CB,Bao QL,et al.Identification and analysis of necroptosis-associated signatures for prognostic and immune microenvironment evaluation in hepatocellular carcinomaJ.Front Immunol,2022,13:973649.19 Mijanovi O,Brankovi A,Panin AN,et al.Cathepsin B:A sellsword of cancer progressionJ.Cancer Lett,2019,449:207-214.20 Cox SW,Eley BM,Kiili M,et al.Collagen degradation by interleukin-1beta-stimulated gingival fibroblasts is accompanied by release and activation of multiple matrix metalloproteinases and cysteine proteinasesJ.Oral Dis,2006,12(1):34-40.21 McComb S,Shutinoski B,Thurston S,et al.Cathepsins limit macrophage necroptosis through cleavage of Rip1 kinaseJ.J Immunol,2014,192(12):5671-5678.22 van Opdenbosch N,Lamkanfi M.Caspases in cell death,inflammation,and diseaseJ.Immunity,2019,50(6):1352-1364.23 Zheng M,Karki R,Vogel P,et al.Caspase-6 is a key regu-lator of innate immunity,inflammasome activation,and host defenseJ.Cell,2020,181(3):674-687.e13.24 Yang YY,Kim SC,Yu T,et al.Functional roles of p38 mitogen-activated protein kinase in macrophage-mediated inflammatory responsesJ.Mediators Inflamm,2014,2014:352371.