基于circRNA调控网络探讨七氟烷致老年小鼠认知功能障碍的分子机制研究.pdf

论著（收稿日期：2 0 2 2-0 9-0 3）538脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第9 期epilepticus J.J Neurol,2022,269(7):3752-3760.17Li Z,Xin Z.Expression and significance of S-100,CysC and NF-k B in patients with acute cerebral infarction JJ.Exp Ther Med,2021,21(2):149.18Yuan Q,Yu L,Wang F.Efficacy of using thromboelastography todetect coagulation function and platelet function in patients withacute cerebral infarction J.Acta Neurol Belg,2021,121(6):1661-1667.19Nayak MK,Ghatge M,Flora GD,et al.The metabolic enzymepyruvate kinase M2 regulates platelet function and arterial thrombosisJ.Blood,2021,137(12):16581668.基于circRNA调控网络探讨七氟烷致老年小鼠认知功能障碍的分子机制研究郑育秀刘丽丽黄泽波王涛刘莉芳【摘要】目的基于circRNA调控网络探究circ_0014063在七氟烷致老年小鼠认知功能障碍中的作用及其相关机制。方法circRNA-seq检测七氟烷麻醉和未处理老年小鼠海马组织，根据关键差异circRNA绘制ceRNA调控网络，并对靶基因进行KEGG分析。将30 只老年C57/BL6小鼠随机分为：对照组、模型组和治疗组，每组10 只。模型组和治疗组使用七氟烷麻醉，治疗组尾静脉注射si-circ_0014063，对照组和模型组注射si-NC。水迷宫实验比较各组小鼠认知功能差异，qRT-PCR检测各组小鼠circ_0014063、miR-744-3p、A p o e 基因表达，westernblot检测各组小鼠Caspase3、Bc l-2 蛋白表达，ELISA检测各组小鼠淀粉样蛋白（A）、淀粉样物质前体蛋白（APP）、IL-1、T NF-含量，并通过spearman法分析circ_0014063与A、A PP、IL-1、T NF-的相关性。结果与未处理组比较，七氟烷麻醉组有2 38个circRNA表达降低，2 41个circRNA表达升高，其中circ_0014063和circ_0032434表达显著升高（P0.05）。circRNA调控网络预测circ_0014063靶向4个miRNA，18 个mRNA，c i r c RNA _0 0 32 434靶向4个miRNA，16个mRNA。K EG G 分析circ_0014063靶基因参与阿尔茨海默病（AD）、坏死性凋亡等通路。与对照组比较，模型组小鼠逃脱时间增加，穿台次数降低（P0.05），海马组织circ_0014063、A p o e、Ca s p a s e 3表达升高（P0.05），mi R-7 44-3p、Bc l-2 表达降低（P0.05），A、A PP、IL-1、T NF-含量升高（P0.05）。与模型组比较，治疗组小鼠逃脱时间减少，穿台次数升高（P0.05），海马组织circ_0014063、A p o e、Ca s p a s e 3表达降低（P0.05），mi R-7 44-3p、Bc l-2 表达升高（P0.05），A、APP、IL-1、T NF-含量降低（P0.05）。c i r c _0 0 140 6 3表达与A、A PP、IL-1、T NF-含量呈正相关。结论七氟烷可导致老年小鼠认知功能损伤，circRNA调控网络在其中发挥重要作用。七氟烷可能通过调控circ_0014063/miR-744-3p/Apoe信号轴介导海马组织调亡，最终诱发老年小鼠认知功能障碍。【关键词】王环状RNA调控网络；七氟烷；认知功能障碍；老年小鼠中图分类号：R741.02文献标识码：A文章编号：10 0 6-351X（2 0 2 3）0 9-0 538-0 7To explore the molecular mechanism of sevoflurane induced cognitive dysfunction in elderly mice based oncircRNAregulatorynetworkZheng Yuxiu,Liu Lili,Huang Zebo,Wang Tao,Liu LifangDepartment of Anesthesiology,the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College,Haikou 570311,ChinaCorresponding author:Zheng Yuxiu,Email:基金项目：海南省卫生健康行业科研项目（2 1A200267）作者单位：57 0 311海口，海南医学院第二附属医院麻醉科539脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第9 期Abstract Objective Based on the circRNA regulatory network,the role of circ_0014063 in sevofluraneinduced cognitive dysfunction in elderly mice and its related mechanisms were explored.Methods circRNA-seq wasused to detect hippocamal tissues of sevoflurane anesthetized and untreated aged mice.The ceRNA regulatory networkwas mapped according to the key differences of circRNA,and the target genes were analyzed by KEGG.Thirty agedC57/BL6 mice were randomly divided into control group,model group and treatment group,with 10 mice in each group.The model group and the treatment group were anesthetized with sevoflurane,si-circ_0014063 was injected into thetail vein of the treatment group,si-NC was injected into the control group and the model group.Water maze test wasperformed to compare the dfferences in cognitive function of mice in each group.The expressions of circ_0014063,mir-744-3p and Apoe genes were detected by qRT-PCR,and the expressions of Caspase3 and Bcl-2 proteins weredetected by Western blot.The contents of amyloid beta(A),amyloid precursor protein(APP),IL-1 and TNF-were detected by ELISA,and the correlation between circ_0014063 and A,APP,IL-1 and TNF-was analyzedby spearman method.Results Compared with the untreated group,238 circRNA expressions were decreased and 241circRNA expressions were increased in sevoflurane anesthesia group,among which circ_0014063 and circ_0032434expressions were significantly increased(P 0.05).The circRNA regulatory network predicted that circ_0014063would target 4 miRNAs and 18 mRNAs,and circRNA_0032434 would target 4 miRNAs and 16 mRNAs.KEGGanalysis of circ_0014063 target gene involved in Alzheimers disease(AD),necrotic apoptosis and other pathways.Compared with the control group,the escape time of model group was increased and the number of times of platformcrossing was decreased(P 0.05),the expressions of circ_0014063,Apoe and Caspase3 in hippocampus wereincreased(P 0.05),and the expressions of miR-744-3p and Bcl-2 were decreased(P 0.05).The contents of A ,APP,IL-1 and TNF-were increased(P 0.05).Compared with the model group,the escape time of mice in thetreatment group was reduced,the number of times of platform crossing was increased(P 0.05),the expressions of circ_0014063,Apoe and Caspase3 in the hippocampus were decreased(P 0.05),and the expressions of miR-744-3p andBcl-2 were increased(P0.05).The contents of A,APP,IL-1 and TNF-decreased(P 0.05).The expressionof circ_0014063 was positively correlated with A,APP,IL-1 and TNF-.Conclusion Sevoflurane can causecognitive impairment in elderly mice,while the circRNA regulatory network plays an important role in.Sevofluranemay mediate hippocampal apoptosis by regulating circ_0014063/miR-744-3p/Apoe signal axis,and ultimately inducecognitive dysfunction in elderly mice.Key wordscircRNA regulatory network;Sevoflurane;Cognitive dysfunction;Elderly mice非编码RNA(noncodingRNA,ncRNA)已成为几乎所有生物基因表达的关键调节因子，其中环状RNA（c i r c u l a r RNA，c i r c RNA)是由多个外显子反向剪接形成且没有5 和3 末端的ncRNA分子，在真核细胞中含量丰富-2 。越来越多的证据表明，circRNA在中枢神经系统疾病中发挥着重要作用，有望成为新的治疗靶点3。此外，circRNA可经过微泡或外泌体分泌到血液循环中，并且比线性RNA更稳定，因此可作为神经性疾病的潜在生物标志物。本实验基于内源竞争RNA(competing endogenousRNA，c e RNA）调控网络探讨老龄大鼠七氟烷麻醉致认知功能障碍的分子机制，观察七氟烷麻醉对老年小鼠神经认知功能的影响并观察海马组织的病理形态学变化，使用circRNA技术筛选差异表达的circRNA，构建ceRNA调控网络，并考察circRNA差异表达对七氟烷麻醉致老年小鼠认知功能障碍的影响，明确ceRNA网络在老龄小鼠七氟烷麻醉致认知功能障碍的分子机制，最终从新的角度阐明七氟烷麻醉致认知功能障碍的发病机制，以期为临床的防治研究提供一定的参考思路。材料与方法1.实验动物雄性SPF级C57BL/6J小鼠30 只（2 1月龄，体质量50 55g）,购自海南药物研究所有限责任公司，实验动物生产许可证号SCXK（琼）2 0 2 0-0 0 0 7。所有小鼠处于室温2 5，自然光暗周期的环境中饲养，实验期间自由饮食饮水。本研究动物方案经本院伦理委员会审核通过，所有动物操作均符合实验动物使用和保护条例。2.主要试剂与仪器七氟烷（150 412）购自江苏恒瑞医药股份有限公540脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第9 期司生产；阴性对照（small interfering-negative control,si-NC）、小干扰环状 RNA 0014063（s ma l l i n t e r f e r i n g-negative control,si-circ_0014063)、Li p o f e c t a mi n e T M2000购自美国Invitrogen公司；总RNA抽提试剂（t o t a l RNA e x t r a c t i o n r e a g e n t，T RIz o l）、逆转录试剂盒和SYBRGreen试剂购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；细胞凋亡相关半胱氨酸肽酶（apoptosis-relatedcysteine peptidase，Ca s p a s e 3）抗体购自美国cellsignaling technology公司;B淋巴细胞瘤-2 基因(B-celllymphoma-2，Bc l-2）抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体购自英国abcam公司；circ_0014063、m i R-7 44-3p和年龄及载脂蛋白基因E(age and apolipoprotein E,ApoE）的qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；Morris水迷宫（BD001）购自德国Grager公司；VarioskanLUX多功能酶标仪购自赛默飞世尔科技有限公司；AppliedBiosystems7500型荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。3.circRNA测序及差异表达基因筛选各组处死后，收集新鲜海马组织，用RNase-free配制的PBS缓冲液清洗。将样品分成体积0.5cm3的小块，用Trizol试剂提取总RNA，构建链cDNA文库。质量检测合格后，使用IlluminaNovaseqTM6000进行测序。根据circRNA的结构特征和剪接序列特征，使用CIRCExploter2和CIRI软件对circRNA进行预测，根据circRNA的起始位置和结束位置整合两个软件的结果。测序结束后，使用Tophat 2进行序列比对，使用cuffLinks对所有基因进行量化，包括编码RNA和非编码RNA。然后用EdgeR包进行差异基因分析。有生物学重复的同时满足Log2差值倍数绝对值1和P0.05为差异基因。4.生物信息学技术利用TargetScan数据库（https:/www.targetscan.org/vert_80/)和LncRNA2Target（h t t p:/w w w.lncrna2target.org/index.jsp）数据库预测circ_0014063的靶基因。使用KECG数据库（https:/www.kegg.jp/）对靶基因进行富集通路分析。最终结果通过Cytoscape软件进行作图。5.动物造模、分组与给药将30 只老年C57/BL6小鼠采用随机数字表法分为：对照组、模型组和治疗组，每组10 只。模型组和治疗组小鼠连续3d吸人3%七氟烷2 h，治疗组于每次吸七氟烷前1h治疗组小鼠尾静脉注射si-circ_0014063（5n m o l 溶于1mL生理盐水中），模型组小鼠尾静脉注射等体积si-NC。对照组不实施七氟烷麻醉，正常吸氧。吸人麻醉过程中应用多功能监护仪监测七氟烷浓度，通过红外线加热仪保持小鼠体温并于小鼠正反射恢复后放回鼠笼。使用TRIzol法提取各组细胞中的总RNA。使用酶标仪检测总RNA的纯度和含量。按照qRT-PCR试剂盒实验说明，依次进行逆转录和qRT-PCR实验。qRT-PCR反应条件：9 5（30 s）预变性后，变性95（7 s），退火55（30 s），7 2（15s），40 个循环周期。circ_0014063的引物序列：正向5-GGAAGTGAAGACAATAACAAGT-3，反向5-TCATTTATACTGGCTGGAACA-3;circ_0032434的引物序列：正向5-GTTCCTATTTGTATTCATTGC-3，反向 5-TCGTTCTTGCTTGTTCAT-3;miR-744-3p的引物序列：正向5-GCTAGGGCTAACAGCAGTCTT-3，反向5-GTTGAGGTTAGTGGCAACAGC-3;ApoE的引物序列：正向5-GAAGAGCGGGTGCTCTGTTT-3,反向 5-CGTAGATCCTCCATGTCGGC-3;GAPDH的引物序列：正向5-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3，反向5-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3。扩增结果根据2-C法计算mRNA的相对表达量。7.ELISA检测小鼠海马组织中-淀粉样蛋白（a my l o i d -protein，A）、淀粉样蛋白前体蛋白(amy-loid precursor protein，A PP）、白细胞介素-1（In t e r l e u k i n-1b e t a,IL-1）肿瘤坏死因子-（t u mo rnecrosis factor-,TNF-）的含量样本制备：采集小鼠海马组织后，按照每10 mg组织加人10 0 1生理盐水，研磨为组织匀浆，412000g离心15min，分离得到组织上清即为结肠组织ELISA样本。采用试剂盒检测A、A PP、IL-1和TNF-含量变化。简要操作如下：将标准品工作液和待测样品加入样品孔中，将覆膜覆在酶标板上，轻轻晃动混匀，37 孵育2 0 min；弃去酶标板中液体，洗涤液洗涤，重复5次，拍干，除空白孔，每孔加人酶标抗体，盖上覆膜，37 孵育30min,弃去液体，洗涤液洗涤，重复5次，拍干；在样品孔中加人显色剂A、B，盖上覆膜，轻轻震荡混匀，37 避光孵育10 min；加入终止液，终止反应，立即用酶标仪测定450 nm光吸收值。根据标准品浓541脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第9 期度对应光吸收值制作标准曲线，并根据样品光吸收值计算样品相应浓度。8.Morris水迷宫实验于处死小鼠当天进行Morris水迷宫实验。Morris水迷宫实验结束后立即处死小鼠取海马。水迷宫由一直径为12 0 cm，高30 cm的圆形水池、摄像头及透明站台组成，池壁上有东、西、南、北4个人水点，将水池分为4个象限。从第一象限开始作为小鼠人水点，依次放人水中。定位航行实验：在不同象限训练小鼠4次，时间为6 0 s。空间探索实验，巡航结束后记录小鼠6 0 s内穿越平台次数及在各象限时间。9.Westernblot检测小鼠海马组织Caspase3和Bcl-2 的表达收集小鼠海马组织，按照每10 mg组织加人100uLRIPA裂解液，使用研磨棒在冰上充分研磨组织后，4，12.0 0 0 rpm离心10 min，收集上清，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE将蛋白进行分离，之后转移在PVDF膜上，脱脂牛奶封闭作用1h，分别用兔抗鼠Caspase3（1:10 0 0）Bc l-2（1：1000），4过夜孵育，后用山羊抗兔二抗37 孵育2h，加人ECL显色液，曝光，并采用ImageProPlus5.0分析蛋白灰度并进行定量，根据内参蛋白，计算目的蛋白相对表达水平10.统计学方法采用SPSS20.0和GraphPadPrism8.0软件对相关数据进行统计分析。海马组织中circ_0014063表达与A、A PP、I L-1、T NF-含量之间的相关性采用Spearman相关性分析，计量资料两组间比较采用独立样本采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以均数标准差（xs）表示；以P0.05为差异有统计学意义。结果1.七氟烷对海马组织circRNA表达影响（图1）A5circ_0014063Bcirc_0014063circ_00324344328cire_003243463stableedown2一20201200log2(foldchange)未处理组七氟烷麻醉组未处理组七氟烧麻醉组A：未处理组和七氟烷麻醉组差异circRNA:B:qRT-PCR检测circ_0014063和circ_0032434表达注：与未处理组比较，“P0.05图1七氟烷对老年小鼠海马组织circRNA表达影响circRNA-seq结果显示，与未处理组比较，七氟烷麻醉组有2 38 个circRNA表达降低，2 41个circRNA表达升高。qRT-PCR结果显示，与未处理组比较，七氟烷麻醉组circ_0014063和circ_0032434表达升高，差异有统计学意义（P0.05）（图1）。2.生物信息学预测circRNA调控网络（图2）AEF2KBPB2NF708C7o2PG8OAPTORSPRXAL.117190.3FA1OTATHX1SHOBGRWC1ACTL7AABRALAO17CA：c i r c _0 0 140 6 3和circ_0032434调控网络BGlycine,serineandthreonine.metabolismPl3K-Akt signalingpalthwayHumanpapillomavirus intectionJAK-STATsignalingpathwayCoronavirusdisease-COVID-19MineralabsorptionTuberculosis-GenecountsHuntingtondisease2Kaposisarcoma-associatedherpesvirus inlection3HepatitisC-1*log10(qvalueCholesterolmetabolismCytosolicDNA-sensing pathway7.5Lipidandatherosclerosis5.02.5Humancytomegalovius infectionMeaslesAutoimmunethyroiddiseaseHumanimmunodeficiencyvirus1infectionNecroptosisAlzheimerdiseasemRNAsurveilancepathway0.00.10.20.30.4GeneRatioB：K EG G 分析circ_0014063靶基因参与信号通路图2生物信息学预测circRNA调控网络对circ_0014063和circ_0032434进行靶miRNA和mRNA预测，结果显示，circ_0014063靶向4个miRNA，18 个mRNA，包括miR-744-3p调控的认知功能障碍关键基因Apoe。c i r c RNA _0 0 32 434靶向4个miRNA，16 个mRNA，见图2 A。K EG G 分析circ_0014063靶基因参与AD、坏死性凋亡等信号通路（图2)。3.沉默circ_0014063对miR-744-3p、A p o e 表达影响（图3）542脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第9 期Acirc_0014063BmiR-744-3pCApoe81.5-5-aa4-6-1.0-b4bb2-0.5-2一100.0-0-对照组模型组治疗组对照组模型组治疗组对照组模型组治疗组A：c i r c _0 0 140 6 3相对表达水平；B：mi R-7 44-3p 相对表达水平；C：A p o e相对表达水平注：与对照组比较，*P0.05；与模型组比较，p0.05图3沉默circ_0014063对七氟烷介导的miR-744-3p、A p o e表达影响qRT-PCR结果显示，与对照组比较，模型组小鼠海马组织circ_0014063、A p o e 表达升高，miR-744-3p表达降低。与模型组比较，治疗组小鼠海马组织circ_0014063、A p o e 表达降低，miR-744-3p表达升高，差异有统计学意义（P0.05）（图3）。4沉 默circ_0014063对 A、A PP、I L-1、TNF-含量影响（图4、图5）ABAPPA400-25-a20-a300-(8/8u)鲁号b(8/8u)15-b200-10-100-5-00对照组模型组 治疗组对照组模型组治疗组A：沉默circ_0014063B：沉默circ_0014063对A含量影响对APP含量影响IL-1TNF-aCD15-25-a20-a10-(8/8u)画号b(8/Bu）15b10-5-含5-00对照组模型组治疗组对照组 模型组 治疗组C：沉默circ_0014063D：沉默circ_0014063对IL-1含量影响对TNF-含量影响注：与对照组比较，P0.05；与模型组比较，*P0.05图4沉默circ_0014063对七氟烷介导的A、A PP、IL-1、T NF-含量影响ELISA结果显示，与对照组比较，模型组小鼠海马组织A、A PP、IL-1、T NF-含量升高，差异有统计学意义（P0.05）。与模型组比较，治疗组小鼠海马组织A、A PP、I L-1、T NF-含量降低，差异有统计学意义（P0.05）（图4）。Spearman相关性分析结果显示，小鼠海马组织中circ_0014063表达 与 A、A PP、I L-1、T NF-含量均呈正相关（P0.05）（图5）。AB400R0.749625-R=0.6499P=0.0001P-0.000120-300-(8/8u)鲁易gV(8/Bu)勇号ddv15-200-10-100-5-0-0-TTTTT02468100246810circ_0014063表达水平circ_0014063表达水平A：c i r c _0 0 140 6 3表达B:circ_0014063表达与A含量相关性与APP含量相关性CD15R-0.729930-R-0.7155P-0.0001P=0.0001(8/8u)鲁8 1-11(8/8U)鲁号D-NL10-20-510-0-0TT102468100246810circ_0014063表达水平circ_0014063表达水平C:circ_0014063表达D:circ_0014063表达与IL-1含量相关性与 TNF-含量相关性图5海马组织中circ_0014063表达与A、A PP、IL-1、TNF-含量相关性5.沉默circ_0014063对七氟烷导致的小鼠认知功能障碍影响（图6）水迷宫实验结果显示，与对照组小鼠比较，模型组小鼠逃脱时间增加，在第二次就表现显著性差异（P0.05）,穿台次数降低，差异有统计学意义（P0.05）。与模型组小鼠比较，治疗组小鼠逃脱时间减少，在第三次就表现显著性差异（P0.05），穿台次数增加，差异有统计学意义（P0.05）（图6）。A60B5a对照组a模型组4-S）彩a40治疗组320-21一001234对照组模型组治疗组次数（n）A：水迷宫中小鼠逃脱所用时长B：小鼠总共穿台次数注：与对照组比较，*P0.05；与模型组比较，P0.05图6 沉默circ_0014063对七氟烷导致的小鼠认知功能障碍影响543脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第9 期6.沉默circ_0014063对小鼠海马组织凋亡水平的影响（图7)对照组模型组治疗组Caspase3Bcl-2GAPDHABCaspase3Bcl-22.51.0-a2.00.81.5-0.61.0-b0.4-b0.5-0.2-a0.00.0对照组模型组治疗组对照组模型组治疗组A：Ca s p a s e 3蛋白表达水平B：Bc l-2 蛋白表达水平注：与对照组比较，P0.05；与模型组比较，P0.055图7沉默circ_0014063对七氟烷介导的调亡水平影响Westernblot结果显示，与对照组比较，模型组小鼠海马组织Caspase3表达升高，Bcl-2表达降低。与模型组比较，治疗组小鼠海马组织Caspase3表达降低,Bcl-2表达升高,差异有统计学意义(P0.05）。讨论七氟烷是临床上常用的吸人型麻醉剂，具有安全性和有效性5。但是最近几年的研究发现，七氟烷麻醉与认知能力下降有关，尤其是在老年啮齿动物和人类中6 。目前研究发现了几种涉及七氟烷麻醉损害认知功能的分子途径，包括内质网应激、线粒体功能障碍、神经元调亡、自噬、血脑脊液屏障（blood-cereboospinal fluid barrier，BCFB）破坏以及神经炎症等，随后导致认知障碍。在本实验中，使用七氟烷吸人麻醉致老年小鼠认知功能障碍，水迷宫实验中模型组小鼠的逃避潜伏期增加和穿越平台次数减少，这表明七氟烷可造成小鼠空间记忆学习能力下降。circRNA是一种新型的具有闭环结构的非编码RNA，广泛存在于真核转录组中，可以通过竞争性内源性RNA调控靶基因的表达，circRNA具有miRNA吸附作用，并通过这种竞争结合microRNA影响后续的转录调控行使的调控作用(8 。circRNA主要以外泌体的形式运输，可通过BCFB进入血液循环9 。据研究报道circRNA参与了神经调节系统0 。ZhaolI等研究，circRNA可能在阿尔茨海默病(Alzheimers disease，A D)等神经系统疾病中发挥关键作用。此外，Zhang等12 在含有衰老加速易感基因的小鼠中研究了与circRNA相关的ceRNA网络，发现这些circRNA相关ceRNA网络可能会影响未来AD的诊断和治疗。circRNA可促进淀粉样蛋白前体蛋白（amy-loid precursor protein，A PP）和-分泌酶（-secre-atase，BA CE1)的降解，并减少-淀粉样肽在AD中的异常积累3。此外，研究发现麻醉所致的认知功能障碍的机制与AD相似，例如大脑细胞凋亡、炎症增加和错误折叠蛋白的积累14。在本实验中，通过circRNA-seq检测了七氟烷麻醉和未处理老年小鼠海马组织，根据关键差异circRNA绘制ceRNA调控网络，结果表明与未处理组比较，七氟烷麻醉组有2 38 个circRNA表达降低，2 41个circRNA表达升高，其中七氟烷麻醉组circ_0014063和circ_0032434的基因表达水平升高，说明circ_0014063和circ_0032434可能参与了七氟烷所致的老年小鼠认知功能障碍的发展，通过circRNA-miRNA预测circ_0014063可能与miR-744-3p存在circRNA-miRNA关系，即circ_0014063可能发挥对miR-744-3p的海绵吸附作用。通过KEGG分析，发现miR-744-3p的靶基因参与AD、坏死性调亡等信号通路。其中ApoE作为一种多功能蛋白，在脂质代谢中具有重要作用。它通过脑脊液和血浆运输脂质，包括胆固醇等15。年龄和载脂蛋白基因E(ageandapolipoprotein E，A p o E)的基因表达调控作用与AD、帕金森病（Parkinsonsdisease，PD）、缺血性脑卒中等神经或神经退行性疾病有重要联系，且受miR-744-3p的调控作用16 。本研究qRT-PCR结果显示，当给予小鼠si-circ_0014063后，小鼠海马组织circ_0014063、A p o E表达降低，miR-744-3p表达升高。以上结果说明，沉默circ_0014063可以增加miR-744-3p，降低ApoE的表达水平发挥治疗作用。circ_0014063作为七氟烷所致的老年小鼠认知功能障碍的关键性差异基因，可能通过circ_0014063-miR-744-3p-ApoE信号轴发挥作用。之前的研究发现，低度炎症对七氟烷引起的认知衰退至关重要17 ，并可导致神经元凋亡18 ，并降低突触可塑性作为学习和记忆的生物学基础9 。炎症过程中的关键递质是炎症细胞因子，它由脑中的（收稿日期：2 0 2 2-11-2 1）544脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第9 期神经胶质细胞和浸润的白细胞以及脂肪组织、免疫细胞以及外周的其他细胞类型产生。-淀粉样蛋白(amyloid-protein，A）分子量约4kDa，由淀粉样前体蛋白（-amyloid precursor protein，A PP)水解而来，由细胞分泌，在细胞基质沉淀聚积后具有很强的神经毒性作用。在本实验中，通过给予si-circ_0014063治疗后，小鼠海马组织中A、A PP、I L-1、T NF-含量降低，并显著改善小鼠认知功能障碍，减少小鼠记忆学习能力缺失，进而保护脑功能。神经元凋亡是认知功能障碍的一个重要因素2 0 。在过去的工作中，已发现许多基因与神经元调亡有关，例如HMGB1/TLR4、c a s p a s e 3、b c l-2、ROS和P53等2 1，在本实验中，与对照组比较，模型组小鼠海马组织Caspase3表达升高，Bcl-2表达降低，表明七氟烷吸人会导致小鼠海马组织凋亡增加，而给予si-circ_0014063治疗后，小鼠海马组织Caspase3表达降低，Bcl-2表达升高，减轻了海马组织的调亡。综上所述，七氟烷可导致老年小鼠认知功能损伤，circRNA调控网络在其中发挥重要作用。七氟烷可能通过调控circ_0014063/miR-744-3p/ApoE信号轴介导海马组织凋亡，最终诱发老年小鼠认知功能障碍，可为临床的防治研究提供一定的参考。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突作者贡献声明郑育秀、刘丽丽、黄泽波、王涛，刘莉芳：资料收集和整理、撰写论文；郑育秀：论文审阅和指导参考文献1Kristensen LS,Andersen MS,Stagsted LVW,et al.The biogenesis,biology and characterization of circular RNAsJJ.Nat Rev Genet,2019,20(11):675-691.2刘珈璇，陈燕，许波群.环状RNA的蛋白编码功能研究进展.医学综述,2 0 2 2,2 8(9):16 7 1-16 7 6.3Chen L,Wang C,Sun H,et al.The bioinf