化学成像技术及其在药物分析中的应用.pdf

中 国 药 品 标 准 ，（）基金项目：年度国家药品标准制修订研究课题（）第一作者简介：郑伊，研究生；研究方向：药学。：；：林雪芬，研究生；研究方向：药学。：；：通信作者简介：徐昕怡，副主任药师；研究方向：药品标准。：；：钱玲慧，研究员；研究方向：药物分析学。：，；：化学成像技术及其在药物分析中的应用郑伊，林雪芬，徐昕怡，曾苏，钱玲慧（温州医科大学药学院，浙江 温州 ；浙江大学药学院，杭州 ；国家药典委员会，北京 ）摘要：化学成像技术因其可同时提供被测对象的光谱信息与空间信息，在我国国防安全和轻工业领域已经得到较广泛的应用。随着相关技术的发展，以及化学成像技术具备“实时质量控制和在线分析”的特点，其在医药学临床诊断、药物分析、生物成像研究等领域也展现了巨大的应用前景。本文介绍化学成像技术的基本原理及其在药物分析中的应用。关键词：化学成像；技术发展；药物分析；质量控制；在线分析中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（，；，；，）：“”，：；在药品生产过程中，尤其需要关注其成分和生产过程的质量控制，因而较为理想的检测方法需要具备以下特征：允许进行在线、原位、非破坏性分析，并减少或者去除样品预处理及其所带来的人为干扰；满足大量样本、多个参数的同时检测以高效获取产品的指纹特征；具有优异的时间和空间分辨能力，以提供待测物的空间异质性、微观及动态信息。在现行的 中华人民共和国药典（简称 中国药典）中，收录了质谱法和光谱法（包括近红外分光光度法和拉曼光谱法）的检测标准。其中，质谱法通常耗时且对样品有破坏性，只适用于小样本，且无法提供样品成分分布信息。光谱法能部分弥补上述不足，如其检测速度较快、通常不破坏样品，可进行在线过程控制，但收集的信息来自样品的统计平中 国 药 品 标 准 ，（）均值，适用于分布均匀的液体、气体，而当样品是固体时，因无法提供成分的分布信息，对于空间分布不均匀的样品，测量结果会产生较大偏差。因而亟须引入新的检测技术，实现药品生产过程中高通量且更精细化的均质性分析。对此，化学成像（，）被认为是一种有效的解决策略。化学成像技术介绍 化学成像基本原理 年，和 在 自然 杂志上报道了将显微镜与红外光谱仪结合，获得具有空间分辨率的样品红外光谱信息，为传统的光谱学开辟了新的道路。年，和 通过改进显微镜，利用二维计算机控制的电机驱动显微镜台与红外显微光谱系统，获得了中红外范围的第一张化学图谱。该技术通过将特定空间的红外光谱简化为官能团特征图来获得图像，实现了对化合物的识别和定位，是化学成像发展过程中的又一突破。世纪 年代初，商业化实验用的化学成像系统面世，此后不到 年，化学成像已迅速发展为一种普遍的分析技术，在医药学领域的作用也在不断扩大。图 化学成像三维数据示意图 化学成像技术将传统成像的可视化特征和来自振动光谱的化学信息相结合，经计算处理生成关于样品组分分布的视觉图像。所得化学成像图是由两个空间维度加上一个波长维度组成的三维数据立方体 （如图 所示），可同时表征样品的空间物理特性和化学性质。其中，振动光谱通常指分子中同一电子能态中不同振动能级之间跃迁产生的光谱。根据所用光谱范围可以分为近红外光谱（）、中红外光谱（）和拉曼光谱（）。每种光谱各有特点，比如近红外和中红外光谱属于吸收光谱，近红外光谱由分子的倍频和合频产生，中红外光谱主要记录分子的基频振动 ；而拉曼光谱基于光的非弹性散射，通过测量化学键的振动或旋转等低频能来提供分子指纹图谱，是一种有效的材料化学鉴定和物理表征的分析技术 。化学成像在振动光谱学的基础上与成像技术相结合，可提供空间分辨的理化信息，具有快速、非破坏性和非侵入性、时空上可视化 等独特优势。化学成像分类化学图像可通过不同模式采集图像信息，根据其光谱分辨率可以分为：多光谱（）成像（光谱分辨率 ）、高光谱（）成像（）和超光谱（）成像（）。其中，高光谱和超高光谱成像通过测量多个窄光谱波段，可记录每个像素点的完整光谱图，所用传感器利用众多连续通道的优势来克服使用平均光谱通常无法获取的特征信息。根据测量所用光谱波段和测量原理，高光谱成像可分为拉曼、红外及近红外等成像类型 ，其适用范围不尽相同。例如近红外光谱是介于可见光谱区与中红外谱区之间的电磁波，其波长范围为 ，发生在该区域的最显著的吸收带与 、和 等官能团的基本振动能相关 ，对应的近红外高光谱成像无须进行样品预处理，可以使用光纤探针区分样品测量位置，并从单一像素点的光谱中预测其化学和物理参数，用于样品的多成分分析 ，也是目前化学成像技术中应用最广泛的定性分析方法 ，可用于质量评估（如涂层厚度、成分信息、混合物均匀性）、高通量分析、远程鉴定、工艺相关参数的提取和假药鉴定等。而拉曼化学成像能提供分子的结构、对称性和电子环境信息，并对共轭双键、芳香环等大多数药物分子中存在的特征性化学官能团高度敏感 ，由于检测过程中样品制备简单、能够在相对较短的数据采集时间内快速分析，以及灵敏性高等诸多优点 ，拉曼化学成像已经被应用于样品粒径评估、片剂特征分析等。化学成像系统化学成像系统通常由光源、光学成像系统、色散装置（波长选择）、检测器和数据采集系统这五个部分组成（图 ）。中 国 药 品 标 准 ，（）图 化学成像系统的基本组成 光源是提供光辐射的部件，例如碳化硅可用于中红外光谱，钨丝可用于近红外光谱，而在拉曼光谱学中，则是利用激光器发射激发光束。样品被光源照亮后，能透过样品的光照射到透视镜，经过入口狭缝后这些光能形成一条狭窄的光线。接着光线到达色散装置（如棱镜、光栅等），被分割成一系列狭窄的光谱波段，最后聚焦在一个检测器上。其中，色散装置是化学成像系统的核心元件，它位于光源和样品之间，用于激发波长的选择，或者位于样品和用于发射波长色散的探测器阵列之间。常用的色散装置可分为三类：单色器（如棱镜和衍射光栅）、带通光滤波器（如固定滤波器和可调节滤波器）、单镜头成像器 。例如近红外成像仪常用的色散装置有滤光片、可调谐滤光器和衍射光栅等 。根据数据采集模式，检测器可分为点映射（逐点扫描）、线映射（线性扫描）和全局成像（焦平面扫描）三种扫描类型，以及快照式成像方式。焦平面阵列检测器（，）就是常用的全局成像探测器，目前被越来越多地应用于制造近红外光谱成像仪，如 近红外光谱成像系统、傅立叶变换红外成像系统。目前，化学成像设备的生产由欧美国家占主导，如芬兰的高光谱相机采用线扫描成像，覆盖各种波长范围；比利时生产的 ，是一种小型仪器，可实现精确的高光谱数据采集。此外，美国开发的 首次以紧凑的手持式外形实现高性能高光谱 多光谱实时成像，不仅能在一次快照中获取完整可见光 近红外数据，还能以视频速率进行连续高光谱数据的捕获。尽管化学成像设备已经取得了快速的发展，化学成像技术本身的应用推广及对应的技术标准制定却相对滞后。化学成像技术在药物分析中的应用在化学成像技术中，高光谱成像作为遥感监测手段，其应用最早可追溯到航空成像 。随着相关技术的不断发展及检测需求的快速增长，基于化学成像的研究也日益增加、使用范围不断扩展，近年来已在工业生产、食品、农产品和医学等领域得到应用。其中，在药物分析过程中，化学成像通过用不同波长的光照射样品表面各个空间位点，收集其所产生的反馈信号，由此对样品所含的化学成分进行识别和量化，同时可视化分析它们在样品表面的分布情况，实现不同样品之间的快速和无损比较，目前典型方法包括近红外高光谱和拉曼高光谱成像。不同于传统光谱技术只从一个单点位置获取平均光谱来作为样品特征、易忽视样品的非均一性特征，化学成像通过扫描整个样品获取更庞大的信息量，能更准确反映样品的整体性质和精细特征，其“并行特性”还可以同时分析多个样品，适合药品的实时质量控制和在线分析。无论样品的表面区域大小，一旦出现组成成分或形态特征不同的空间位点，化学成像都能有效捕捉到，特别适合固体、半固体和液体样品的成分特性分析，用于鉴定原料药和辅料，以及定性和定量分析药品、包装和设备中的活性成分、中间体和辅料等，也可用于评价制剂工艺，还可用于鉴别假冒伪劣药物，既可用于质量控制，又可进行过程监测，在线实时反馈药品质量（图 ）。中 国 药 品 标 准 ，（）原料药和药用辅料鉴定药物一般由原料药和药用辅料组成，原料药是发挥生物活性的核心成分，药用辅料一般具有改善药物外观、调整药物释放、改善药物稳定性等功能。因此，在固体片剂中，原料药和药用辅料的含量分布对其整体质量至关重要，是保障疗效的前提，也是制药行业质量控制环节中重点关注的问题之一 。传统的近红外光谱因缺乏空间维度，只能反映光源照射点的成分信息，无法对该成分在被测试样中的分布情况进行描述，而化学成像技术正好能改进这一问题。例如 等使用近红外化学成像研究干燥的蛋白质 糖混合物的同质性，而 团队 利用拉曼光谱成像可视化观察透明质酸钠构建的微针中双氯芬酸钠的药物分布情况。图 化学成像技术在药物分析中的应用 制药过程工艺参数评价 混合均匀性在药物生产过程中，片剂的混合均匀性对于溶出行为控制至关重要。相较于传统的高效液相色谱或紫外 可见光谱法需经过样品处理和配制后方可进行片剂中药物成分含量检查，化学成像逐渐成为更具优势的替代方法 。等人 利用拉曼光谱成像和 射线粉末衍射，分别对湿法混合和干法混合制备得到的硫酸阿托品进行固态分析，结果表明湿法混合所获得的产品均匀性更好。等人 通过近红外化学成像对罗红霉素片的混合均匀性进行评估，结果显示，部分淀粉或硬脂酸镁等辅料以聚集体形式存在于罗红霉素片中，其混合不均匀性导致了较差的溶出度。压片密度片剂的密度或硬度变化对于揭示配方设计或压片过程中的缺陷具有重要作用，化学成像可以定性或定量表征这些物理性质。如 等 利用近红外化学成像技术非破坏性地评估乳糖片剂的密度分布，分析润滑剂硬脂酸镁加入量及混合时间对片剂密度的影响。在近红外图像中可以清晰显示不同混合片剂之间的密度分布差异，并发现片内密度的均匀性在很大程度上取决于粉末和模具壁之间的摩擦力。等 则利用近红外化学成像和偏最小二乘法（，）模型预测整个片剂表面的硬度分布情况。溶出度溶出度是衡量固体口服药物释放特性的重要指标，团队 利用近红外化学成像获得不同配方布洛芬片剂中崩解剂的化学信息来预测原料药布洛芬的溶出度，实验结果表明 回归模型能成功预测其溶出曲线。等 利用近红外化学成像在 范围内对异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇四种片剂原料药的溶出情况进行预测，结果表明，利福平的预测结果精度较高，相关系数为 。包衣工艺由于化学成像技术提供的光谱 中 国 药 品 标 准 ，（）和空间信息能够表征各种类型的包衣缺陷，有利于控制片剂包衣层质量。等 应用近红外化学成像定量分析单次释放微球中的涂层厚度，通过分析 处的成像信息，能够识别不均匀的涂层。除了药物最终的包衣质量控制，化学成像也能实现制药过程中的包衣工艺分析。等 通过在线近红外成像程序与 判别分析相结合，实现了实时监控片剂涂层上羟丙基甲基纤维素膜的厚度、水分含量等物理变化，有利于评估整个制剂过程中的包衣工艺。假冒药物鉴别近年来，关于销售假药劣药的新闻层出不穷。根据 药品管理法，假药是指所含成分与国家药品标准规定的成分不符的药品，以非药品冒充药品或者以他种药品冒充此种药品。假药不仅缺乏治疗效果、延误病症治愈，还可能对患者的健康安全造成严重的不良后果。因此，有效的检测技术手段是保障药品质量、用药安全的前提。在过去几十年里，通常利用薄层色谱、高效液相色谱和质谱等技术检测假冒伪劣药物，然而，这些技术在测量过程中具有破坏性、检测速度较慢，化学成像技术非侵入性的优势可实现更便捷地检测。如近红外高光谱成像技术作为药材及制剂质量控制手段的研究已被报道，且受关注度越来越高。例如过期的左氧氟沙星片经常因为其在化学性质上的变化很小而难以检测，许多不良商家会利用这点进行再包装而谋利。谭超 等人在原有的近红外光谱检测的基础上结合化学计量学，采用主成分分析法（，）进行鉴定，能区别同一品牌过期和未过期的片剂以及不同品牌的片剂。等 采用近红外测量结合多变量数据分析、主成分分析等数学数据处理方法进行药物检测，根据进入样品的光分散在样品内部后反射回来得到的信息进行区别，结合高光谱成像得到可视化图像，获得更多关于药物成分的非均匀分布信息，有效区分假冒伪劣药物。目前，化学成像技术在我国的应用主要集中于国防和轻工业领域，在食品和农业相关领域也有涉及。例如食品检测方面，孟庆龙等 通过采集猕猴桃的高光谱图像，提取猕猴桃损伤区域以及完好无损区域的光谱反射率，结合 判别分析方法以及 模式识别方法对结果进行分析，来判别猕猴桃的成熟度。李兴鹏等 通过近红外光谱以及高光谱成像对木本油料产品掺假进行检测，比较其营养成分、霉变与缺陷等变化。在农业方面，虞佳佳 等人通过高光谱成像进行农作物的病害检测。随着化学成像技术的进步，其在我国生物医药领域也逐步得到了应用。比如利用红外化学成像和 固体核磁共振技术分析头孢呋辛赖氨酸的成盐性 ；受激拉曼散射显微镜与微小的拉曼探针为生物系统提供了新的研究手段 ；将病理图像分析与高光谱病理数字化图像结合，提高了对病变组织器官的深层次分析的效率和准确率 等。但整体而言，化学成像技术在我国药物分析领域的应用仍然有待推广。综上，化学成像技术在国内外的应用汇总如表 所示。表 化学成像技术在国内外生物医药领域的应用示例 生物医药领域应用优点参考文献国外（药物分析）原料药和赋形剂鉴定增加空间维度更全面的检测 制药过程工艺参数评价混合均匀性参与制药的各个过程，应用广泛 压片密度 、溶出度 、包衣工艺 、鉴别假冒药物非入侵性检测便利谭超 、国内食品检测食品营养成分，掺假度等鉴别孟庆龙 、李兴鹏 农业病毒检测虞佳佳 生物医药准确率，精确度提高等薛晶 、陈煜嵘 化学成像技术指导原则和应用要点早在 年，美国 正式发布了过程分析技术（，）的制药工业指导原则，而化学成像作为重要的 工具，也被应用于药品的工业生产和质量控制。年，欧洲药典增刊 新增全球首个化学成像指导原则，用于药品质量保证和控制以及生产环境下的药品分析。近期，英国药典也增补了该指导原则。目前化中 国 药 品 标 准 ，（）学成像技术在我国的研究和发展也日趋深入，但相关管理方面还处于空白状态，亟须开展相关研究并制定指导原则。化学成像法通过可视化分析样品表面的分布特征，促进不同样品之间的快速和无损比较，可作为经典光谱分析方法的补充，特别适合于分析化学含量和（或）物理形态不均匀的样品。参考各国药典化学成像技术指导原则内容，在检测分析过程中，需注意以下事项：样品制备样品制备应与所使用的成像技术及仪器设备相对应。如用探头原位测量则不需要样品制备，但非接触聚焦（以拉曼散射为例）则需要进行样品表面制备以获得一个平整的表面。如果是仪器无法补偿的形变，需要对样品表面进行机械性修饰，例如将片剂凹面压平；而通过自动重新对焦可以补偿成像过程中样品表面的轻微不均匀性问题。在衰减全反射 红外成像中，由于镜片和样品之间需要接触，也必须进行样品表面制备。同时，样品需要根据成像设备及方法要求妥善放置于检测台，并尽可能减少镜面反射等干扰，探头（或光束）、样品和探测器之间的角度和距离应符合设置要求 。仪器设置基于采集模式选择合适的仪器后，首先要进行仪器性能评估和验证，避免错误解读和人为干扰，以确保检测过程中所得信息的准确性。在此过程中，需要对化学成像系统组件（主要包括光源、光学成像系统、色散装置、检测器和数据采集系统）进行确认或校准，确保成像系统可正常运行，各参数符合化学成像技术要求和分析目的。数据采集化学成像数据处理用超立方体进行解析，超立方体指包含每个三维图像像素的光谱强度和波长数据 。根据构建超立方体的方法，化学成像的图像采集模式可以被分成摆扫式扫描（，点映射）、推扫式扫描（，线映射）和凝视扫描（，全局成像）三种类型。这三种图像采集模式最大的区别在于空间分辨率（指仪器能够有效辨别的最小空间距离，决定成像质量 ），需根据检测对象和目的进行选择。此外，样品表面的拓扑结构也可能会影响成像性能，因此，所检测的样品表面必须对分析目的有代表性。图像处理通过化学成像获取的图像数据非常复杂，须进行一系列的图像分析处理才能从这些复杂数据中提取到所需信息（图 ）。图 图像处理常用步骤示意图 反射率校准由于在测量过程中，即使在光源强度不强的情况下，检测器仍然会产生暗电流，并且暗电流与温度、波长等有关，所以在计算反射率时必须对其进行校正（）。对此，在获得样品图像（）之前，需先进行背景图像和暗图像的拍摄。背景图像（）由放置在均匀、高反射率标准或白色陶瓷的场景中来获取 ，暗响应（）则通过关闭光源，完全覆盖镜头并记录相机响应而获得 。得到相关数据之后，使用以下公式对原始数据进行校正 ：（）。数据预处理预处理通常是为了消除光谱信息中的非化学偏差（例如，由于表面不均匀性引起的散射效应、来自外部光源的干扰、随机噪声），因此，通过适当的数学分析对光谱数据进行预处理，对于提高样品中的有效信息和消除光谱数据中不必要的变化至关重要。超立方体分类超立方体是三维空间上的数据集，由于其信息量较大，因此通常采用复杂的多元分析工具进行分类。超立方体分类能够识别具有相同光谱特征的区域，提供关于样品的物理和化学性质以及分布和浓度信息 。分类完成后，将图像矩阵折叠回三维形式，由此构建化学图像。图像加工处理进行图像处理，将分类步骤得到的对比度转换为描绘成分分布的图像。具有强度缩放的灰度或颜色映射通常用于显示图像中像素之间的组成对比度。单波长图像较容易构造，但可能会有偏倚或受样品表面厚度的变化而产生误导，相比之下，多波长图像能更好地表示样品组成。多波长图象经过图像融合，即不同波段的两个或多个图像组合形成新图像，能在样本中不同化学区域之间体现更大的对比度。中 国 药 品 标 准 ，（）数据分析样品图像中的像素排列表示其化学或物理属性及特征的分布，经数据分析，可以探索相应的光谱特征、空间特征以及两者的结合。由于多数情况下光谱重叠显著，获取某一化学成分在特征波长处的光谱具有难度，因此需要引入更大比例的光谱信息，并应用多变量分析方法进行特征提取。在此基础上，通过设置阈值以及根据单色或伪色强度尺度将数据转换为一组颜色或灰度来显示样品，以强调在每个像素上目标分析物的存在情况及比例。展望尽管化学成像技术已经被广泛应用于地理勘测、食品、农业、医药学等领域，但它仍然存在一定的局限，在制药行业的常规检测中也面临着一些挑战。目前的化学计量学工具，如主成分分析和偏最小二乘分析，并不足以分析超立方体数据；超立方体图像采集处理和分类也需要相对较长的时间。但随着计算机处理速度的提高、相应硬件的改进、更精确和高效的算法的出现，化学成像的这些不足也会得到改善，以推进这种新兴技术在药品质量和过程监测方面的进一步应用。药品标准是药品生产、流通、使用和监督管理部门共同遵循的法定依据 。随着经济发展的全球化，经济交往、技术交流，打破了国家和区域的疆界，形成了全球范围的大生产和大流通 。由此，“创新、协调、绿色、开放、共享”新发展理念的重要性日益凸显。中国药典 也应与时俱进地贯彻落实新发展阶段的新发展理念，使其在保障药品质量安全、促进医药产业转型升级、医药产业进出口贸易等方面持续发挥更强的基础性和引领性的作用 。在未来，随着技术及相关仪器设备的不断发展，化学成像有望成为一种高效并被广泛应用的无损型质量控制在线分析方法。因此，开展 中国药典 化学成像技术指导原则的增订，不仅能进一步编制好新时代新阶段的 中国药典，而且还能进一步推广多信息融合检测技术在药物分析领域中的应用，同时引导国产仪器的研发升级。参考文献 中华人民共和国药典 年版 四部 ：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：闵玮，杨驰，王平 生物医学中的化学成像：光学显微镜的下一个研究前沿 光学与光电技术，（）：，：，（）：李昀，范世福，肖松山，等 化学成像技术的原理和发展 光谱仪器与分析，（）：，（）：白文明，王来兵，成日青，等近红外高光谱成像技术在药物分析中的研究进展 药物分析杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：中 国 药 品 标 准 ，（），：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（），：，（）：?，：，：，：，：，（）：孟庆龙，冯树，南谭涛，等 猕猴桃挤压损伤高光谱快速检测研究 包装工程，（）：，（）：李兴鹏，姜洪?，蒋雪松，等 木本粮油林果品质的近红外光谱及成像无损检测研究进展 食品与发酵工业，（）：，（）：虞佳佳，何勇基于高光谱成像技术的番茄叶片灰霉病早期检测研究 光谱学与光谱分析，（）：，（）：薛晶，张锐，田冶，等 利用红外化学成像和 固体核磁共振技术分析头孢呋辛赖氨酸的成盐性 中国新药杂志，（）：，（）：，：陈煜嵘，王耀南，张辉，等 医学高光谱显微成像与智能分析关键技术研究及应用 人工智能，（）：，（）：，：，（）：，：，：，：，（）：张伟试论药品标准与药品质量 中国药品标准，（）：，（）：张伟 发挥药品标准导向作用 助力经济社会高质量发展 中国药品标准，（）：，（）：徐昕怡，许华玉，陈蕾，等 贯彻落实新发展理念编制好新时代新阶段 中国药典 中国药品标准，（）：，（）：，：，（）：（收稿日期：）