基于IL-6_STAT3通路探讨参芪复方对缺血性心力衰竭大鼠Th17_Treg平衡的影响.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与心脑血管疾病诊治基于IL-6/STAT3通路探讨参芪复方对缺血性心力衰竭大鼠Th17/Treg平衡的影响史胜楠1，苗兰1，李磊1，马彦雷1，孟红旭1，史跃1，王培利2，刘建勋1（1.中国中医科学院西苑医院/基础医学研究所/中药药理北京市重点实验室 北京 100091；2.中国中医科学院西苑医院/国家中医心血管病医学研究中心 北京 100091）摘要：目的观察参芪复方对缺血性心力衰竭（IHF）大鼠的治疗作用并探究其可能的作用机制。方法选取SD大鼠60只，其中50只采用结扎冠状动脉左前降支建立IHF模型后随机分为模型组、参芪复方低、中、高剂量组、福辛普利组，每组10只，另10只设为假手术对照组，只穿线不结扎。治疗组分别按不同剂量灌胃给药，模型组与假手术组给予相同容积的生理盐水，连续灌胃5周。治疗结束后，行心脏超声检测心室结构及心功能变化；采用苏木素-伊红染色（HE）观察心肌组织病理学改变；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-17A、IL-6、TNF-、IL-10水平；流式细胞术检测外周血和脾脏Th17、Treg细胞含量；免疫组化（IHC）观察心肌组织 IL-6、STAT3、p-STAT3 表达；蛋白质免疫印记（Western blot）检测心肌组织 IL-6、STAT3、p-STAT3、Foxp3、RORt表达。结果与假手术相比，模型组LVEF、LVFS、SV、CO明显下降，LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV明显增加，并出现心肌细胞排列紊乱，伴炎性细胞浸润等病变，血清IL-17A、IL-6、TNF-水平升高，IL-10水平下降，外周血与脾脏Th17细胞百分比增加，Treg细胞百分比下降，心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、RORt蛋白表达增加，Foxp3蛋白表达下降；与模型组比较，参芪复方高剂量组心室结构与心功能指标得到改善，心肌损伤减轻，血清IL-17A、IL-6、TNF-水平下降，IL-10水平升高，Th17细胞百分比下降，Treg细胞百分比升高，心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、RORt蛋白表达减少，Foxp3蛋白表达增加。结论参芪复方可改善IHF大鼠心功能，抑制炎症反应，其机制可能与抑制IL-6/STAT3信号通路，调节Th17/Treg细胞免疫平衡有关。关键词：参芪复方 缺血性心力衰竭 IL-6/STAT3信号通路 Th17/Treg平衡doi:10.11842/wst.20220429006 中图分类号:R285.5 文献标识码:A缺血性心力衰竭（Ischemic heart failure，IHF）是由于冠状动脉病变引起管腔狭窄导致血液灌流受阻使心肌处于长期缺血状态，导致心脏结构和功能受损而表现出的一组临床综合征，是发达国家和发展中国家心血管发病率和死亡率的主要原因1。目前，IHF的治疗策略是在预防或减少心脏缺血负担的基础上延缓心室重构，如早期的血运重建术及神经内分泌激素抑制剂的应用2。这些治疗方案的不断优化在一定程度上降低了IHF的发病率，但再住院率仍居高不下，住院后的5年生存率仅为25%3。同时，在药物的长期使用中，电解质、体液代谢紊乱等不良反应也导致了患者依从性变差，临床远期疗效大打折扣。因此，探寻IHF新的治疗策略和靶点具有重要意义。近年来，IHF被认为是一种慢性免疫系统激活的 收稿日期：2022-04-29 修回日期：2023-01-20 国家自然科学基金委员会重点项目（82030124）：血瘀证发生与演变的血小板系统生物学机制研究，负责人：刘建勋。通讯作者：刘建勋，本刊编委，研究员，博士研究生导师，主要研究方向：中药心脑血管药理学研究；王培利，主任医师，博士研究生导师，博士，主要研究方向：中医药防治心血管疾病。1811 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 状态4，在心脏缺血性损伤发生的早期阶段，辅助性T 细 胞 17（T helper cell 17，Th17）、调 节 性 T 细 胞（Regulatory cell，Treg）作为CD4+T效应细胞亚群之一，可以共同协调死亡心肌细胞的清除，参与瘢痕肉芽组织形成，并通过分泌促血管生成、促存活和抗炎介质来调节随后的心脏修复和炎症消退5。然而持续的免疫细胞浸润会使得白细胞介素-6/信号转导及转录激活因子 3（Interleukin-6/signal transducer and activator of transcription 3，IL-6/STAT3）信号通路异常激活，促使Th17细胞过度分化，同时抑制Treg细胞分化，导致Th17/Treg细胞失衡6，诱导不利的心脏重塑，加速IHF的发展。因此，通过调节 IL-6/STAT3 信号通路维持Th17/Treg 细胞的动态平衡可能是防治 IHF 的靶点之一。中医学认为IHF属于“胸痹”、“喘证”等范畴，其发生和发展与“气”的功能失调有关。心气与宗气亏虚，导致血瘀、痰饮、寒凝等病理产物堆积心脉，出现心悸、胸闷、喘憋等症状。疾病后期气、血、水湿、痰瘀互为因果，形成恶性循环。因此，益气是斩断不良病理产物的基础，是恢复心主血脉功能的前提。参芪复方是本课题组通过总结临床经验和文献数据挖掘，结合正交设计和剂量筛选配制而成，以人参、黄芪为主药，人参补益心肺宗气；黄芪补气升阳，利水消肿。前期基础实验已经证明参芪复方在改善IHF大鼠心功能、减轻心肌纤维化方面具有良好药效7。现代药理研究表明，黄芪多糖可以提高免疫抑制模型小鼠 Treg 比例，降低CD4+T细胞数量，抑制IL-17分泌活性8；人参皂苷CK可以减少TNF-、IL-6含量，增加Treg细胞含量，减轻心梗小鼠心脏炎症损伤9。但是参芪复方对于IHF模型大鼠IL-6/STAT3通路及Th17/Treg免疫平衡的影响目前还未有明确报道，本研究通过构建IHF大鼠模型，对此进行初步研讨。1 资料与方法 1.1药物参芪复方由人参3 g、黄芪30 g组成（河北百草康神药业有限公司，批号分别为：2003011、2009012）。复方制备方法如下：分别按照人参、黄芪1:10的原料配比称取人参、黄芪，加药材 10 倍重量的水煎煮3次，每次2 h，每次煎煮药液经过滤去渣后合并，搅拌均匀；将步骤所得的滤液进行真空浓缩，浓缩到以水作参考密度，60时相对密度为（1.05-1.10）gcm-3的稠膏（出膏率为48%）再加入适量糊精（生药与糊精重量比为10:1），搅拌均匀，过100目筛，取筛下物进行常规喷雾干燥，得到参芪复方。阳性对照药：福辛普利（规格10 mg，中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H19980197）。1.2动物雄性SPF级SD大鼠60只，购自北京斯贝福生物技术有限公司，体质量（19010）g，许可证号 SCXK（京）2019-0010，饲养于中国中医科学院西苑医院实验动物中心，温度（252），湿度（50%6%），光照12 h，昼夜交替，自由进食饮水，适应性饲养7天后实验。本实验通过了中国中医科学院西苑医院伦理委员会审批，伦理批件号为2019XLC016-2。1.3试剂ELISA 试 剂 盒：IL-17A（美 国 abbkine，货 号：KET9005）、IL-6、TNF-（美 国 raybio，货 号：ELR-TNFa-1、ELR-1L6-1）、IL-10（中国酶免，货号：MM-0195R1）；一抗FOXP3、RORt（美国proteintech，货号：22228-1-AP、13205-AP）；一抗 IL-6、STAT3、STAT3（phospho S727）（英国 abcam，货号：ab9324、ab68153、ab32143）；流式抗体 CD4-PerCP、CD3-FITC、IL-17-PE、CD25-PE、FoxP3-APC（美国 eBioscien，货号：46-0040-82、11-0030-82、12-7177-81、12-0390-82、17-5773-82）；RPMI-1640 完全培养基（含 10%FBS）（武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：PM150110B）、Leukocyte Activation Cocktail（美国BD，货号：550583）、破膜固定缓冲液套件（德国 Thermo Fisher，货号：00-5523-00）。1.4仪器Vevo2100 型高分辨率超声影像系统（加拿大Vissual Sonics）；酶标仪/酶联免疫分析仪（美国博腾Epoch2）；电泳仪、小垂直电泳槽、凝胶成像仪（美国博乐 1645050、1658001、DOC XR+）；FACS 流式细胞仪（美国 BD FACS Canto Plus）；37，5%CO2孵箱（德国Thermo Fisher）。1.5方法1.5.1动物造模及分组大鼠术前1天禁食水，采用结扎冠脉左前降支制备心梗后心衰模型9，麻醉大鼠后将其四肢仰卧位固定至鼠板，左胸部脱毛，行气管插管，接入小动物呼吸1812 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与心脑血管疾病诊治机；随后沿左侧第4肋间开胸，钝性分离肌肉，扩胸器撑开肋骨暴露心脏，剪开心包，在肺动脉圆锥和左心耳交界1-2 mm处无创缝线穿线，结扎冠状动脉前降支作为模型组，假手术组只穿线不接扎；以结扎部位以下心肌变白，搏动减弱且心电图出现ST段弓背向上明显抬高为成功标志；缝合，在伤口处涂抹青霉素。待大鼠苏醒后取出气管插管，送至动物房，恢复正常饮食饮水。造模成功大鼠按照随机数字表法分为模型组、参芪复方低、中、高剂量组、福辛普利组各10只，假手术组10只。1.5.2给药根据课题组临床试验用药剂量按照体表面积换算法10得出大鼠的给药剂量，参芪复方低、中、高剂量分别为 1.66、3.33、4.99 gkg-1，福辛普利片 1.05 mgkg-1。各给药组连续灌胃5周，每日1次，假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃。1.5.3HE染色观察心肌组织形态学改变心超检测后，开胸取出大鼠心脏，用冰浴生理盐水冲洗，切取部分左室前壁心肌组织固定于4%多聚甲醛溶液中，经不同浓度的乙醇溶液逐级脱水，二甲苯中透明，石蜡缸浸蜡，倒入模具，进行包埋切片；将切片依次放入二甲苯、无水乙醇中梯度脱蜡；苏木素浸染6 min，自来水洗2 min，1%盐酸乙醇分化5 s，水洗7 min，伊红染2 min，流水快速冲洗，切片依次进行无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下拍照，进行图像采集分析11。1.5.4心脏超声检测大鼠心功能末次给药结束后麻醉大鼠，将胸部左侧锁骨至肋下缘进行脱毛处理。在备皮处涂抹医用超声耦合凝胶，用探头定位在乳头肌水平长轴切面，频率设定17.5 MHz，进行M型超声检查。选用左室收缩末期内径（LVDs）、左室舒张末期内径（LVDd）、左室收缩末期容积（LVESV）、左室舒张末期容积（LVEDV）评价左心室重塑情况，左室射血分数（LVEF）、每搏输出量（SV）、心输出量（CO）、短轴缩短率（LVFS）评价心功能情况，以上指标均连续测量3个周期，取平均值。1.5.5ELISA 检测大鼠血清 IL-17A、IL-6、TNF-、IL-10含量腹主动脉取血后，静置30 min，低温高速离心机以4，3000 rmin-1离心10 min，取上层血清-80冻存备用。采用 ELISA 法检测血清 IL-17A、IL-6、TNF-、IL-10水平，实验步骤按照试剂盒方法进行操作。1.5.6流式细胞术检测大鼠脾脏及外周血Th17、Treg含量摘取大鼠脾脏，用冰浴生理盐水冲洗，研磨过滤至流式管，以 1500 rmin-1离心 5 min，弃上清，用 PBS重悬后分为两管。一管用细胞刺激剂（含蛋白质转运抑制剂）进行体外刺激，37，5%CO2孵育箱培养6 h后用PBS洗涤1次，依次加入5 L CD4、CD3抗体，室温避光孵育20 min后离心弃上清，加入1 mL细胞破膜缓冲液，室温避光孵育1 h；加入2 mL细胞破膜缓冲液混匀，1500 rmin-1离心5 min，弃上清；加入5 L抗大鼠IL-17A抗体，室温避光孵育30 min，加细胞破膜缓冲液 2 mL，1500 rmin-1离心5 min，弃上清，加入400 L PBS重悬细胞上机检测；另一管进行Treg检测，按上述步骤先进行CD4、CD25染色，然后用细胞核膜试剂盒操作说明对细胞进行破核膜处理，加入5 L FoxP3抗体，孵育30 min，PBS重悬上机检测。大鼠外周血检测方法同上，其中加入细胞膜表面抗体孵育后，需进行红细胞裂解，余步骤同前。1.5.7免疫组化观察大鼠心肌组织 IL-6、STAT3、p-STAT3表达将心肌组织切片依次浸入二甲苯、梯度乙醇中脱蜡，水洗后，柠檬酸抗原修复缓冲液煮8 min（STAT3采用 EDTA 抗原修复液），自然冷却后用 PBS 溶液洗涤3 次；切片放入 3%H2O2，室温避光孵育 15 min，水洗3次；在组化圈内滴加3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min，在切片上滴加用PBS按比例稀释好的一抗（IL-6 1 800，STAT3 1 800、p-STAT3 1 800），平放于湿盒内4孵育过夜；PBS清洗3次后加入二抗（HRP标记），室温孵育50 min；PBS清洗后，切片稍甩干，加入DAB显色液10 min后终止显色；苏木素复染1 min，水洗返蓝；脱水后中性树胶封片、扫描，HALO数字病理图像分析软件测定阳性细胞表达面积12。1.5.8Western blot检测大鼠心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、RORt、FoxP3蛋白含量采用RIPA裂解液提取大鼠心肌组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。将20 g蛋白样品加入12%SDS-PAGE凝胶中进行电泳。电泳结束后，将蛋白转移到PVDF 膜上。将膜完全浸至 3%BSA-TBST 中封闭。封闭结束后根据蛋白质相对分子量裁膜，并先后在稀释于 5%脱脂奶粉-TBST 溶液的一抗（IL-6 1 1000、1813 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 STAT3 1 2000、p-STAT3 1 1000、RORt 1 2000、FoxP3 1 2000稀释）和含HRP的二抗中孵育。孵育结束后TBST洗膜，ECL暗室显色。通过Image J软件对所测蛋白条带进行分析，用内参的灰度值作为比较，对结果进行分析并计算相对百分数。1.6统计分析应用SPSS 23.0软件统计，计量资料符合正态分布且方差齐，用均值标准差（x s）表示，多组间比较应用单因素方差分析，方差不齐应用秩和检验，P0.05说明差异具有统计学意义。表1参芪复方对IHF大鼠心功能的影响（x s）组别假手术组（n=10）模型组（n=8）参芪复方低剂量组（n=9）参芪复方中剂量组（n=9）参芪复方高剂量组（n=8）福辛普利组（n=9）LVEF（%）83.855.7822.7810.73#36.4812.56*44.8310.10*51.7619.17*49.297.41*LVFS（%）54.716.9011.135.59#18.687.21*23.315.99*28.7112.80*26.114.63*SV（L）185.2245.0992.7852.09#142.9854.48*129.5032.90160.7932.05*168.7542.51*CO（mlmin-1）81.3119.5541.8724.62#64.3420.94*57.0216.4067.6813.43*73.6316.77*注：与假手术组比较，#P0.01；与模型组相比，*P0.05，*P0.01。表3参芪复方对大鼠脾脏Th17、Treg细胞含量的影响（x s，n=6）分组假手术组模型组参芪复方高剂量组福辛普利组Th17（%）2.240.504.511.90#2.880.39*3.240.38*Treg（%）10.781.558.650.97#10.411.02*10.041.23*Th17/Treg0.210.020.520.22#0.280.02*0.320.01*注：与假手术组比较，#P0.01；与模型组相比，*P0.05，*P0.01。表4参芪复方对大鼠外周血Th17、Treg细胞含量的影响（x s，n=6）分组假手术组模型组参芪复方高剂量组福辛普利组Th17（%）0.770.161.210.35#0.610.34*0.950.38Treg（%）9.430.897.730.97#9.261.66*8.611.68Th17/Treg0.080.010.160.06#0.060.03*0.100.03*注：与假手术组比较，#P0.05，#P0.01；与模型组相比，*P0.05，*P 0.01。表2参芪复方对IHF大鼠心室结构的影响（x s）组别假手术组（n=10）模型组（n=8）参芪复方低剂量组（n=9）参芪复方中剂量组（n=9）参芪复方高剂量组（n=8）福辛普利组（n=9）LVDs（mm）2.980.727.801.34#6.981.245.801.49*5.812.03*5.921.07*LVDd（mm）6.540.828.751.19#8.551.117.481.43*7.931.557.981.10LVESV（L）37.7923.46336.35132.84#263.8692.15180.18100.90*192.36130.49*181.4478.65*LVEDV（L）223.3963.08429.12129.76#406.85112.11309.68125.94*353.15140.35350.18109.87注：与假手术组比较，#P0.01；与模型组相比，*P0.05，*P0.01。假手术组 模型组 参芪复方低剂量组 参芪复方中剂量组 参芪复方高剂量组 福辛普利组100 m100 m100 m100 m100 m100 m图1心肌HE染色（HE，200）1814 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与心脑血管疾病诊治2 结果 2.1HE染色观察心肌组织形态学改变HE染色结果显示，假手术组大鼠心肌组织排列紧密有序，心肌细胞形S态完整，未见间质水肿及炎性细胞浸润。模型组大鼠心肌纤维排列紊乱、断裂，心肌间隙增大，部分肌纤维断裂，见炎性细胞浸润。参芪复方组大鼠的心肌损伤得到一定改善，心肌纤维排列较为整齐，肌纤维断裂溶解情况缓解（图1）。2.2心脏超声与假手术组相比，模型组大鼠 LVEF、LVFS、SV、CO均显著下降，LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV均明显增加（P0.01）。与模型组相比，参芪复方组大鼠LVEF、LVFS、SV、CO均有不同程度提升（P0.01或P0.05）；参芪复方组大鼠LVDs、LVESV均显著降低（P 0.01）（表1-2）。综合心肌组织病理形态变化、心功能和心室结构指标评价，参芪复方高剂量组初步显示出较好的改善效果，故在后续实验中选择参芪复方高剂量组进行其他水平的检测。2.3参芪复方对大鼠脾脏及外周血Th17、Treg细胞的影响与假手术组相比，模型组大鼠脾脏与外周血的 假手术组 模型组 参芪复方组 福辛普利组CD4-PerCPIL-17A-PECD25-PEFoxp3-APC 假手术组 模型组 参芪复方组 福辛普利组图3外周血流式细胞检测代表图（左：Th17，右：Treg）CD4-PerCPIL-17A-PE 假手术组 模型组 参芪复方组 福辛普利组CD25-PEFoxp3-APC 假手术组 模型组 参芪复方组 福辛普利组图2脾脏流式细胞检测代表图（左：Th17，右：Treg）1815 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 Th17细胞明显升高，Treg细胞明显减少，Th17/Treg细胞比显著升高（P0.01）；参芪复方组大鼠脾脏与外周血的Th17细胞水平显著下降，Treg细胞升高，同时伴随 Th17/Treg 细胞比的显著下降（P0.01 或 P0.05）（表3-4，图2-3）。2.4参芪复方对大鼠血清IL-17A、IL-6、TNF-、IL-10水平的影响与假手术相比，模型组大鼠血清 IL-17A、IL-6、TNF-含量显著上升，IL-10显著下降（P0.01）；参芪复方给药后可显著降低 IL-17A、IL-6、TNF-水平（P0.01），提高IL-10水平（P0.05）（表5）。2.5 免 疫 组 化 检 测 大 鼠 心 肌 组 织 IL-6、STAT3、p-STAT3的表达与假手术组相比，模型组大鼠心肌IL-6、STAT3、p-STAT3阳性面积增加（P0.05）；与模型组相比，参芪复方组大鼠心肌IL-6、STAT3、p-STAT3表达有不同程度下降（P0.05）（表6，图4）。2.6 参 芪 复 方 对 大 鼠 心 肌 组 织 IL-6、STAT3、p-STAT3、RORt、Foxp3蛋白表达的影响与假手术相比，模型组大鼠心肌 IL-6、STAT3、表6各组大鼠心肌IL-6、STAT3、p-STAT3阳性表达结果比较（x s，n=6，%）组别假手术组模型组参芪复方高剂量组福辛普利组IL-617.426.16637.3416.16#20.0713.12*34.449.69STAT323.883.8332.402.72#25.169.47*30.876.81p-STAT322.594.9246.6413.26#31.017.93*32.6815.41*注：与假手术组比较，#P0.05；与模型组相比，*P0.05。图4心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3免疫组化（200倍）注：从左至右分别为假手术组、模型组、参芪复方高剂量组、福辛普利组。表5参芪复方对大鼠血清IL-17A、IL-6、TNF-、IL-10平的影响（x s）组别假手术组（n=10）模型组（n=8）参芪复方高剂量组（n=8）福辛普利组（n=9）IL-17A（pgmL-1）17.071.4024.215.43#17.431.30*25.103.14*IL-6（pgmL-1）21.159.7346.233.61#22.005.85*33.493.88*TNF-（pgmL-1）120.8212.12258.1331.32#133.8829.75*135.5815.54*IL-10（pgmL-1）71.0727.3447.272.05#58.5913.69*71.0727.34注：与假手术组比较，#P0.05，#P0.01；与模型组相比，*P0.05，*P0.01。1816 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与心脑血管疾病诊治ROR蛋白表达均升高，Foxp3表达下降（P0.05）；而复方参芪可有效降低 IL-6、STAT3、ROR蛋白表达，增加Foxp3表达（P0.05）（图5）。3 讨论 中医药在治疗IHF方面有着独特的理论和丰富的经验支撑，在改善患者预后、提高生存质量方面发挥重要作用13。多项研究表明人参、黄芪的有效成分可以通过抗氧化、改变血管舒缩功能、减少血小板粘附、影响离子通道、改变自主神经递质释放和改善血脂谱等多机制、多靶点途径发挥心脏保护作用14-15。为了观察参芪复方对IHF的治疗效果，本研究采用冠状动脉结扎制备了心力衰竭模型，结果提示参芪复方可以减轻大鼠缺血性损伤导致的心肌组织病理损伤，心肌纤维排列紊乱得到改善，炎性细胞浸润减少。另外通过心超评估大鼠心功能和心脏结构，发现参芪复方高剂量组大鼠 LVEF、LVFS、LVDs、LVESV 均有明显改善，说明参芪复方在治疗IHF方面具有良好的药效。心脏由心肌细胞、心肌成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、免疫细胞等组成16。在稳态条件下，非心肌细胞表现出静止的表型，当发生缺血性损伤后，非心肌细胞活化作用于心脏发挥双面作用。其中，CD4+T淋巴细胞介导的免疫反应在HF的发病机制中起重要作用。首先，抗原呈递细胞识别了受损的心肌细胞释放出来的自身抗原蛋白，随后，幼稚CD4+T淋巴细胞通过MHC类分子产生抗原特异性免疫反应，原始抗原的幼稚CD4+T细胞被激活，最终分化为具有不同表型的亚群17。在MI早期阶段，CD4+T淋巴细胞亚群能够促进瘢痕形成，防止心脏破裂；然而，持续激活的亚群细胞可能以自身免疫反应的方式靶向心脏，促进心脏肥大、纤维化、重塑和衰竭3。Th17与 Treg细胞作为 CD4+T细胞的效应亚群之一，它们在不同的细胞因子和信号通路刺激下进行分化、扩增并作用于心脏产生不同效应18-19。二者可以相互转化、相互制衡，它们之间的平衡对于控制炎症和改善心脏免疫微环境具有重要作用。Th17细胞的特征是分泌促炎因子IL-17介导炎症反应及自身免疫疾病20-21；还能诱导间充质细胞或者成纤维细胞分泌IL-6、TNF-等炎性细胞因子，而炎症介导的间质纤维化会增加心肌僵硬度，促进IHF的发生。HF患者中循环Th17细胞的升高与左心室功能障碍呈正相关，且与不良预后高度相关22。Treg细胞主要分泌IL-10等抗炎因子，高表达叉头核蛋白3（Foxp3）转录因子，是抑制免疫炎症反应和维持免疫稳态的重要媒介23。急性心肌梗死后小鼠心脏和纵隔淋巴结中的Tregs增加并能够促进心肌组织修复；临床研究也报告了 Tregs的低水平与心血管疾病的高风险之间存在正相关，可作为心衰恶化患者再住院的独立预测因子。本研究发现IHF大鼠外周血与脾脏中Th17与Treg细胞处于失衡态势，以促炎表现Th17细胞为主要表达，同时伴随着炎性因子IL-17A、IL-6、TNF-的升高和抑炎因子IL-10的降低。而参芪复方可以有效抑制IHF大鼠炎症反应，促使Th17/Treg平衡向Treg偏移，改善这一病理态势。图5各组IL-6、STAT3、p-STAT3、RORt、FxoP3蛋白表达比较注：与假手术组比较，#P0.05；与模型组相比，*P0.05；Sham：假手术组；Model：模型组；FXPL：福辛普利组；SQH：参芪复方高剂量组。1817 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 Th17细胞的分化取决于自身的转录因子类视黄醇孤儿核受体（RORt），并受 IL-6 的调节24-25。IL-6能够与可溶性 IL-6R形成复合物，与细胞膜上 gp130分子结合，导致 STAT3 通路激活26，诱导 RORt的表达，并诱导Foxp3过度表达减少对ROR-t的抑制，促进幼稚 CD4+T 细胞分化为 Th17 细胞，进而导致 Th17和 Treg细胞之间的免疫功能失调。因此，靶向 IL-6/STAT3信号通路，激活Tregs和抑制Th17细胞的免疫调节疗法可能是防治IHF的一种有效策略。人参、黄芪及其有效成分在不同疾病中能够发挥不同的功效，有研究发现，人参皂苷CK能够通过抑制STAT3的磷酸化调控人肝癌细胞凋亡27；人参皂苷Rb1可以激活STAT3通路抑制心肌细胞凋亡和炎症反应，减轻川崎病小鼠的心肌损伤28；黄芪甲苷可以通过抑制 IL-6/STAT3 信号通路促进反复呼吸道感染大鼠的 Th17/Treg细胞平衡29。而国内外关于中药参芪复方通过调节IL-6/STAT3通路对IHF心肌损伤发挥免疫保护作用的研究鲜有报道。所以本研究初次验证了参芪复方可以通过抑制IL-6/STAT3通路发挥心肌保护作用，免疫组化和Western Blot结果分别显示参芪复方可以抑制IL-6、STAT3、p-STAT3、RORt的蛋白表达，增加Foxp3的蛋白表达。综上述，参芪复方可抑制IL-6/STAT3表达，抑制Th17细胞过度分化，促使 Th17/Treg平衡向 Treg修复表型偏移、减轻炎症反应、缓解心肌损伤、改善心脏功能，下调IL-6/STAT3信号通路表达可能是其起效的分子机制之一，更确切的详尽作用机制还需进一步深入研究与论证。参考文献 21Carter H E,Schofield D,Shrestha R.Productivity costs of cardiovascular disease mortality across disease types and socioeconomic groups.Open Heart,2019,6(1):e000939.2Bahit M C,Kochar A,Granger C B.Post-myocardial infarction heart failure.JACC Heart Fail,2018,6(3):179-186.3Jena D,Melenovsk V,Stehlik J,et al.Heart failure after myocardial infarction:Incidence and predictors.ESC Heart Fail,2021,8(1):222-237.4Meng X,Yang J M,Dong M,et al.Regulatory T cells in cardiovascular diseases.Nat Rev Cardiol,2016,13(3):167-179.5Ramos G,Hofmann U,Frantz S.Myocardial fibrosis seen through the lenses of T-cell biology.J Mol Cell Cardiol,2016,92:41-45.6Huang M Y,Yang D,Xiang M X,et al.Role of interleukin-6 in regulation of immune responses to remodeling after myocardial infarction.Heart Fail Rev,2015,20(1):25-38.7王智博,吴昱杰,张业昊,等.基于“益气活血法”的复方人参补气颗粒对心梗后心衰大鼠心肌保护药效学研究.中药药理与临床,2021,37(3):150-157.8王雪梅,贾天玉,管彬,等.黄芪多糖对免疫抑制模型小鼠Treg细胞及 Th17 细胞亚群的影响.天然产物研究与开发,2015,27(1):153-157.9杨伟,滕林,丁家望,等.人参皂苷compound K对小鼠心肌梗死后心室重构的保护及免疫机制研究.心肺血管病杂志,2016,35(6):478-481.10 Nair A,Jacob S.A simple practice guide for dose conversion between animals and human.J Basic Clin Pharm,2016,7(2):27.11 高佳明,郭浩,张业昊,等.芪龙胶囊对气虚血瘀型缺血性心肌病大鼠心肌纤维化和血液循环的影响.中国中药杂志,2022,47(5):1327-1335.12 高展旺,张昕,莫尊汇,等.基于Akt/mTOR及ERK/mTOR信号通路探究活心丸对心肌肥大大鼠自噬的影响.中草药,2022,53(5):1442-1449.13 Fu S F,Zhang J H,Gao X M,et al.Clinical practice of traditional Chinese medicines for chronic heart failure.Heart Asia,2010,2(1):24-27.14 Fan 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