小鼠呼吸状态下晶状皮质层脑电波分析.doc

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频率范围，以及如何振荡涉及行为仅部分understood3。在增量频率范围（0.5-4赫兹）新皮层神经元的振荡被认为是通过包括两个新皮质和丘脑神经元circuits4,5机制所产生的，并与慢波睡眠在人类和动物的通常相关联。然而，在LFP和尖峰活动三角形带振荡活动中的清醒，头部固定mice6-8.At其余晶须桶皮质中也观察到，小鼠呼吸节奏地在1和3HZ之间的频率，其对应于所述差分频率范围神经元振荡。虽然已经示出在行为水平的呼吸和晶须的流动是动态锁相在这个频率band9-11，在桶皮质神经节律是否与呼吸仍未得到研究。为了检验清醒小鼠呼吸休息时呼吸频率桶皮质三角振荡之间可能存在的联系，我们同时测量呼吸节奏和神经元的活动在清醒的头固定小鼠的胡须桶状皮层。我们发现，在胡须桶状皮层2的增量带神经元振荡。图1 |振荡神经元的活动相锁了呼吸。在清醒小鼠呼吸道和局部场电位（LFP）信号sin桶状皮层之间的相关性和一致性。从一个鼠标数据显示，但结果是转载于5出5只小鼠。 （一）呼吸节律（黑色）和两个LFP信号同时记录在晶须桶皮层（红色和蓝色），处于静止状态。拍摄地点是300毫米分开。 （二）自相关函数（左）呼吸和LFP信号和LFP-呼吸交叉相关（右）。曲线的颜色对应于一个。 （三）同作为录音的，反而加速呼吸引起的短暂暴露于缺氧的空气中。 呼吸（四）自相关函数（左）和 LFP信号和LFP-呼吸交叉相关（右）。曲线的颜色对应于一个。 （五）瞬时呼吸频率（上）和 LFP-呼吸相关性（底部）在正常加速的呼吸通过暴露于低氧空气引出。呼吸频率和一致性在5-S的时间窗口进行了计算，移动2.5的脚步。相干绘制在右侧显示一个伪彩色代码。在顶部面板灰色背景显示暴露于空气中缺氧时间。在a和c所示的数据是在电子商务中所示的完整数据且具有两个3-S段（时间轴在a和c共同与1中的E）。 分别为相位锁定到呼吸节律，并主要由嗅球活性驱动。此外，相位振幅耦合分析表明，LFP振荡伽马频带进行振幅调制的相位与呼吸节律。因此，我们的研究结果表明，呼吸活动直接调制慢（1-4赫兹），有节奏的体感晶须桶状皮层神经元的活动，并通过相位幅度耦合机制间接调节伽玛带电源。几项研究发现，西塔-PHAS-amplitude耦合，感觉，运动和认知processes12-15。我们的研究结果表明这样一个可能的神经机制，嗅觉和触觉晶须sensation9-11之间的跨模态的相互作用。 结果 呼吸锁定LFP振荡桶皮质。采用多电极细胞外记录技术，我们测得的尖峰和局部场电位（LFP）的活性清醒，头部固定小鼠的体感晶须桶状皮层。同时，呼吸活性通过测量空气温度的波动，在鼻孔的前方（见方法）监测非侵入。 LFP以及单层和多层单元秒杀活动进行了相关性节奏与呼吸（图1,2）。 影响对振荡嗅觉bulbectomy的。 Respirationlocked神经元活动已知会发生在啮齿动物嗅球，通过嗅觉感觉神经元的激活与从动 每次呼吸通过nose16,17。 Fontanini等al.18,19已经表明，这些振动可以传播到嗅觉梨状皮质。在休息的平均呼吸率C57BL / 6J小鼠是165呼吸min_1或2.75赫兹（参考文献20）。因此，小鼠呼吸在静息率位于神经元oscillations1定义的1-4 Hz的频率变化范围内。我们问是否在感官晶须筒呼吸锁定神经元三角波段振荡可以通过嗅球活动的推动。作为第一个实验性的方法，我们手术切除嗅球（以N？6）小鼠。嗅觉bulbectomies消除桶皮质增量带振荡和呼吸和个LFP（图3）之间的相关性。我们在呼吸频率的连贯性方面量化这种降低呼吸和LFP之间的锁定。这是由于bulbectomy减少了LFP-呼吸相干对应于平均减少了91（图3），因此，高度显著减少（Po0.001（二侧），曼 - 惠特尼U检验）。 LFP振荡与鼻腔气流。要控制，如果不涉及到呼吸等作用是负责呼吸和LFP之间的一致性的bulbectomized小鼠的损失，我们执行了完整的，麻醉的小鼠气管切开术（N？3）通过鼻子呼吸消除。这个操纵选择性地阻止激活嗅球通过鼻气流，同时使灯泡完好无损。 LFP的活动被记录在晶须桶皮质和呼吸活动是通过胸部的运动监测。此外，我们产生通过独立于自发呼吸气管（图4）的鼻子的人工节奏气流。这是在三个不同的气流的频率和受控的体积中进行的 模仿的B0.15毫升（见法）鼠标的休息潮气量。被选择的频率为人工鼻气流要低（0.8HZ），高（3.2Hz）或相同（1.6Hz）作为平均 麻醉的小鼠自发性呼吸频率。在气管切开小鼠，呼吸和桶皮质LFP活性之间的相关性弱（图4b，D，F，右，绿色），但LFP活性强烈的节奏鼻气流（图4b，D，F相关，右，黑色）在所有三种测试的频率。图2 |秒杀活动的节奏与相关呼吸。单（N？3）和多单元（N？9）秒杀活动被记录在两个清醒小鼠的胡须桶状皮层。互相关值与呼吸尖峰活动是为三分之三单个单元和九分之八多组录音显著。单机秒杀活动（一）跨尖峰时间间隔直方图记录了在清醒小鼠的胡须桶状皮层10分钟。插图示出了第一（左）和最后一个（右）10的动作电位的波形的叠加。 （二）互相关的单单元尖峰活性与呼吸（发病吸气周期的时间）。蓝线代表了原始的互相关。黑线代表代理相关的分布的中值。顶部和底部的红色线条描绘的代孕相关分配的第5和第95百分位数分别为（见方法或细节）。生的相关性被认为是显著如果互相关值超过了代理相关的分布的5或95百分位边界。 鼻腔气流和LFP活动之间的相关性最高的发生在鼻腔气流的1.6 Hz的节奏。这可能是由于产生共振皮层主要神经元，其中已示出的现象，以具有优选的亚阈值频率接近1.6Hz（参见21页）。 LFP活动如下电嗅球刺激。通过鼻子有节奏的气流可能会产生小的机械力对嗅球可能导致由于对记录电极的脑组织小运动神经元的反应。因此，我们又进行对照实验中，我们通过进行气管切开术消除鼻腔气流，但现在调节神经元活动在嗅球通过电刺激，同时记录皮层每桶LFP活动。我们使用有节奏的电刺激，包括当前步骤简要列车激活同侧嗅球在用于人工鼻气流刺激（0.8，1.6和3.2赫兹），在以前的实验中相同的频率。这些刺激引起的桶皮质个LFP（图5）的刺激锁定的节奏波动，确认有节奏的嗅球活动节奏调节在晶须桶皮质神经元的活动。图3 |嗅球活动带动皮质振荡。减少记录在清醒，头部固定条件不变，嗅觉bulbectomized小鼠呼吸和局部场电位（LFP）信号之间的连贯性。（一）呼吸（黑色）测量为在小鼠的鼻孔前的温度和同时记录LFP信号（红色和蓝色）的bulbectomized鼠标的筒皮质。该呼吸信号进行归一化的平均的减法和除法由SD（二）自相关函数（左图）的LFP的和中所示的呼吸信号和crosscorrelations（右）的呼吸信号和任一LFP信号之间。红色和蓝色曲线表示从由相应的颜色的绘制个LFP获得的交叉相关。（三）呼吸信号和LFP信号之间的一致性暗算呼吸频率。单个数据点代表的呼吸和同时记录LFP信号之间的50个数据段内的一致性。不同的符号代表不同的小鼠，白色和黑色的符号代表完整，bulbectomized小鼠分别。总共有52和1850-S段从五个完整和六bulbectomized小鼠进行采样，分别为。多个相同的码元代表多个平行LFP测量（最多五个电极的晶须桶皮层）或多个LFP样品中一只小鼠在相同的记录部位。沿x轴的每个码元位置由平均呼吸速率对应的50-S段期间确定。在C中显示的数据（四）总结。白色和黑色的方块，并须图表示的装置（蜱内侧的框），在第一和第三四分位数（底部和拖曳上端）和数据（晶须）的扩展区中的白色和黑色的数据点C，分别。和呼吸节奏相振幅耦合。最近的研究表明，伽马射线波段的幅度或功率调制的相位增量波段振荡，这一发现被称为相位幅度coupling14,15,22。我们的数据还表明这种类型的交叉频率的互动。我们发现，伽马振荡（75赫兹）的晶须桶皮质的功率被调制的相位与呼吸周期（图6）。因此，不仅缓慢振荡，而且高频率的活动中的晶须桶皮质链接到呼吸。这样的交叉频率的耦合已经牵涉在空间和时间上的协调与高级脑functions14,23相关的神经元的活性。通过使用自举统计方法，利用相位随机化替代数据（见方法），我们表明，去除嗅球中被淘汰电力的呼吸相关的调制各地的过渡，从伽玛（30-80Hz）的频率范围为快（ 80-200Hz）振荡。发生相反的下面和上面的该频带的嗅觉bulbectomy后，其中观察到相位振幅耦合（图6）中的频率范围。 逆行追踪。通过respirationlocked神经元活动的途径达到每桶晶须皮质目前尚不得而知。在小鼠的嗅觉大或梨状皮质被称为显示呼吸锁定神经元oscillations18,19，因而从主嗅球的桶状皮层的通路一个似是而非的链接。以确定晶须桶皮质是否接收从梨状皮层或其它嗅觉有关的领域的直接预测，如内嗅皮层，杏仁核或眶额cortex24,25，我们注入了逆行示踪剂（荧光金）入桶皮质（见方法）。前脑的神经元投射到晶须桶皮质的标签是与先前的研究一致（例如，参考文献26）。投射神经元中发现了腹后内侧丘脑（VPM），并在较小程度上为以及在腹后外侧丘脑（VPL）。标记的神经元中也发现了一些皮质区，包括对侧皮质桶，以及相邻的同侧皮质区，包括二级体感（S2），嗅和岛叶皮质和延髓运动皮层。在躯体感觉皮层区域，投射神经元分别在层2,3和5中，而不是在层1或4稀疏，大标神经元主要存在被发现在基底前脑核，这些都是已知的项目的基底核可能胆碱能神经元多个皮质区。 图4 |鼻气流需要连接呼吸皮质振荡。在晶须桶皮质局部场电位（LFP）振荡与鼻腔气流在麻醉气管切开鼠标。数据显示，从一个鼠标，但结果载于3/3小鼠。 （一）代表鼻腔气流通过升气管（黑色）开幕调制在0.8 Hz的原始信号，通过下行气管的开口自主呼吸测量扩胸运动（绿色）和桶皮质LFP（淡红色：原始信号，红色：过滤在0.510赫兹）。 在该信号具有相同的颜色惯例，以及互相关滤波的LFP信号的鼻气流（黑色）和向胸部移动（绿色）（右）（b）的自相关函数（左图）。所有的相关性从50秒时长的数据段包括一个显示的痕迹计算，由小组内的标签所示。 （三）在鼻腔气流调制为1.6赫兹。 （四）自相关和互相关作为在B在C的信号。 （五）如在鼻腔气流调节在3.2赫兹。 （六）自相关和互相关作为，b表示在电子信号。鼻腔气流和扩胸运动的单位是任意的，但通用的A，C和E。 讨论 我们发现，呼吸锁定通过鼻子引起的气流嗅球活动的背后是清醒小鼠的体感皮层三角洲带神经振荡的主要动力。皮层神经元振荡与呼吸的协调是去除嗅球（图3）后，减少了91。体感皮层的振荡可以通过包括在气管切开小鼠灯泡的控制气流活化实验直接链接到嗅球活性（图4）或者通过灯泡（图5）的电刺激。两者的操作导致枪管皮质活动相位的调制锁定到气流或电刺激。 Adrian27已经显示，1950年呼吸机振荡尖峰和LFP活动在哺乳动物嗅球。最近的一项研究在大鼠证实，灯泡呼吸锁定振荡取决于节奏的气流通过nose17。这些振荡不需要的气味的检测，因为哺乳动物嗅觉感觉神经元也是机械传感器，信号引起的鼻airflow28压力变化。 图5 |嗅球的电刺激夹带的皮质活性。 （一）平均每桶皮质LFP回应同侧嗅球与0.8 Hz的有节奏的刺激，电刺激。刺激包括了重复每1.25秒10毫秒当前步骤（50 MA）50赫兹的火车（？0.8赫兹）的。箭头指向的刺激列车的发作。电刺激的文物（标标stim.artif大括号）出现密集的垂直线截断在底部。 LFP信号在全国30个刺激的火车平均。该由电池驱动的刺激隔离单元（A380，世界精密仪器，美国）软件生成和D/土木工程署1401的输出（包括剑桥电子设计，英国）和刺激电流。 （五）平均LFP反应中所描述的三种不同的刺激频率在两个不同的刺激电流测量。响应于每个刺激frequencycurrent组合测定中三只小鼠。响应幅值进行归一化到每个动物的到0.8赫兹/80毫安刺激的最大响应和跨三只小鼠的平均值。响应幅值为刺激电流，刺激频率的函数。误差线表示标准误差。 图6 |电源的高频振荡呼吸调制。呼吸锁定和波段振荡的一个完整的清醒和清醒bulbectomized鼠标桶皮质LFP活动之间的相位振幅耦合，其次是人口的统计数据。 （一）呼吸系统的活动（上图），伽玛波段振荡（中间曲线）和增量振荡（浅绿色底曲线）和相位（墨绿色下部曲线）在一个完整的鼠标幅度。伽马振荡（75赫兹）的振幅峰值节奏地相位锁定到增量周期。 （二）伽马振荡幅度为三角洲相（红色）的函数。固体和虚线的黑线表示平均值，并从1000相位随机化的代理人所估计的替代振幅分布的2.5和97.5的界限。伽玛调幅是在三角洲周期阶段0显著。 （C，D）同A，B分别，但对于一个bulbectomized鼠标。去除嗅球后，伽马波段振荡的幅度调制是不再相位锁定到呼吸。 （五）通过呼吸道（增量）的频率的相位和频率范围从1到256赫兹的的幅度之间的平均向量的长度（MVL的实黑线）相振幅耦合的定量分析（对数比例）。灰色和白色背景的描绘常用频段boundaries1。固体和点缀灰色线表示的均值和95个百分点，分别代孕是指从1000相位随机代用品估计向量长度值。 （F）与呼吸LFP相位振幅耦合的完整和bulbectomized老鼠人口统计。 MVL值来自同一组的LFP段被计算为在图1中的相干性分析中使用。 2c中（从5完好52样品和来自六个bulbectomized小鼠18个样品）。的曲线图代表样品超出代理MVL值分布在完整的（黑色）95百分位边界的分数和bulbectomized小鼠（灰色）绘制为振幅频率（对数换算）的函数。相位频率被固定在呼吸频率。对晶须桶皮质呼吸锁定嗅球活性的影响并不限于三角形带振荡相位振幅耦合的分析表明，在晶须桶皮质伽马波段振荡活动的功率进行调制的相位与呼吸锁定三角形带活动呼吸作为链接到嗅觉和活性晶须运动触觉探索行为之间的相互作用已提出的Welker，基于早期行为观察大鼠。最近的研究证实，呼吸道和胡须的触觉行为协调，mice9和ratsl0，提示嗅觉和触觉感官收购的协调互动。事实上，这两个感觉系统都不是独立被研究显示进一步支持这一之一的结果的损失增加的灵敏度，在其他感觉形式。 搅打和呼吸运动的小鼠与动态相关性是在缓慢的晶须（5HZ）特别强的相关性。因此，缓慢地搅拌过程中，从晶须感觉输入是可能有助于在晶须桶皮质的呼吸-LFP的连贯性，除了嗅球感觉输入。然而，晶须感官反馈呼吸，LFP一致性的贡献不能超过最大相干的10时，由于bulbectomy实验证明，嗅球活动占90LFP呼吸的连贯性。 由于皮质活动三角形带振荡也存在于哺乳动物中谁呼吸比小鼠更慢（例如，人类），很可能涉及丘脑回路并联神经元机制的存在产生增量振荡独立的呼吸节律的。我们的研究结果表明，但是，呼吸可能导致躯体感觉皮层活动的有节奏的调制在物种特异性的呼吸速率。取出嗅球减少的呼吸频率91的呼吸，LFP的连贯性。因此，在小鼠嗅球活动负责大部分的呼吸锁定神经元振荡，但其他呼吸与感觉输入，例如从三叉鼻腔气流传感器，上呼吸道传感器和胸部的肌肉，很可能也贡献。这些可能是负责剩余呼吸锁定调制bulbectomized小鼠中观察到，也可以存在于动物不佳或没有意义的嗅觉，像海豚。 我们的发现提供了一个潜在的神经机制在清醒，表现小鼠嗅觉和晶须触觉之间的相互作用。行为的研究显示，呼吸和晶须的动作的时序是动态的，协调的。结果曹等A1。表明通过活性气味和触感嗅探和高频搅打可以在小鼠中独立地发生，同时研究通过Deschenes等人提出的连续强相大鼠两个节奏之间的锁定。 伽马振荡大鼠的桶状皮层已被证明能增加 马上探索搅打行为前，后机械地搅拌刺激.无论这些变化，放射性活度分别与呼吸的这些研究并没有解决。我们的研究结果表明，每桶皮质伽玛带电源相位调制与呼吸可以在协调嗅觉和触觉感觉处理的作用。关于呼吸锁定振荡的晶须感觉处理的潜在功能作用的其他线索可能来自不同的物种进行了比较研究。鼠，沙鼠，仓鼠和龙猫，谁也有桶皮质和能动的胡须，也有增量频带内休息呼吸频率（1.2，1.4，0.7和0.7Hz，分别）。我们的研究结果为基础的物种可以预期，显示呼吸锁定伽玛功率调制的桶状皮层，类似于鼠标。相比之下，Guniea猪拥有晶须桶皮质，但有immotile mystacial胡须，因而缺乏积极晶须感应的行为。如果伽马功率的呼吸锁定调制并起到呼吸与晶须触觉传感的协调作用，也可能是不太明显的，甚至不存在于动物没有存活触感。 综上所述，在嗅球呼吸锁定神经元振荡落后于小鼠的体感皮层三角洲带神经振荡的主要动力。此外，波段振荡，这已被广泛地涉及在更高的皮层处理，是振幅调制的相位随呼吸。因此，生活配套呼吸行为，图桶皮质传入7逆行追踪。代表图像显示在脑注射后逆行示踪剂（荧光金）到每桶皮质逆行标记。在S1BF（一）注射部位（桶皮质）。 （二）逆行标记细胞没有在梨状皮层（PC）的实测值。逆标神经元主要是在层对侧皮质桶（T），同侧腹后内侧（VPM），丘脑（D），同侧相邻S2（体感）皮层（E）2,3和5中找到。还有神经元在同侧基底前脑（BF）核（F）的稀疏的标签。集成电路，内囊; LH，下丘脑外侧; VPL，腹后外侧丘脑; VL，腹外侧丘脑。比例尺（一），400pm。 （B-F），100m的。图片A-T和D-的票价从不同的小鼠。 认为是由脑干中心大多控制，具有对小鼠高阶大脑活动意想不到的，间接的影响，通过嗅觉系统。无论是类似的影响 于大脑活动的呼吸也存在于其他皮层区域也可能在人类中，其嗅球中相对于新皮层大小已大大减少，仍有待所示。 方法 动物。实验是在成年雄性C57BL/ 6J（B6）小鼠中进行（48周龄，1825克体重）。雄性小鼠被用来避免变性相关的动情周期行为生理措施。小鼠饲养在繁殖地，具有12小时光照/标准笼深循环住房与最大随意获得食物和水只成年小鼠。光周期（在1200至1700小时）期间进行的所有实验。无小鼠经过任何以前的实验过程。所有的动物实验程序遵守经田纳西州健康科学中心动物护理和使用委员会的大学指南。实验室动物护理（NIH出版号86-23，修订版1996年）的原则随访。 准备清醒，头部固定记录。对于手术，小鼠被麻醉了3异氟醚（百特医药产品，迪尔菲尔德IL）中氧气的孵化室，转移到立体定位头安装和麻醉是通过喉舌继续1-2.5异氟醚氧。异氟烷浓度控制用蒸发器（高地的医疗设备，CA）中。麻醉深度调整，直到小鼠没有表现出对后爪的反射撤退到一个强大的压力。钝耳棒被用来防止损坏耳膜。核心体温，用直肠温度计测量，维持36.5和38.0度C之间有feedbackcontrolled加热垫（金控公司，Bowdoinham，ME）。手术技术的详细elsewhere34,35进行了描述。简单地说，一个小的开颅手术（直径1-2毫米）中提出了合适的晶须桶皮质1毫米后到前囟和3.5mm的横向中线。暴露的，但完整的硬脑膜上覆盖着三重抗生素（沃尔格林，美国），以保持湿润，减少感染的风险。一个圆柱形的塑料腔（0.45厘米直径的到8mm高）被放置在颅骨开放和充满三重抗生素。三个小螺钉（1/80圆顶头，直径0.8毫米，长2mm，小零件公司，迈阿密湖，佛罗里达州）分别固定在颅骨，以及金属头后是安装前至前囟门。该腔室，头后和头骨螺钉被固定到位的牙科丙烯酸类，如前面所述。小鼠皮下注射5毫克kg_1镇痛Torbugestic（堡Doege，USA），以减轻疼痛和0.5ml乳酸林格氏液作为补液手术的第一个24小时内两次。 电生理记录和清醒小鼠呼吸监测。使小鼠的头部手术后的安装和录音室后3-4天的恢复期，在0900和1500适于头部约束的实验情况，期间在同一天进行15分钟时长的头固定两会前小时。在这些会议上，头部保持固定和身体上覆盖着宽松的塑料半管（直径5厘米，长10厘米），以限制运动。小鼠通常适于将头部固定在2-3会话与第三会话期间判断通过显着减少行走和跑步动作与上述第一或第二比较。在实验设置中，头部保持装置和记录程序已经详细的技术publication34说明。总之，头部固定夹紧涉及金属头后固定在鼠标的头骨的金属固定装置，使用机器螺钉。三重抗生素糊剂然后从记录室中取出，并在腔室冲洗和填充用无菌生理盐水溶液。 在每次实验前，小鼠被允许容纳在头部固定的情况为30分钟的记录之前。 对于外记录，一个计算机控制的微驱动（MiniMatrix，托马斯录制，德国）的导向管中下降进入盐水填充的录音室，以小于从大脑硬脑膜表面2毫米的距离。的不锈钢导向管也用作参考电极和被折衷连接到经由盐溶液的脑组织。然后，2-5电极（玻璃隔热钨/铂，阻抗：3.5-5.0MO）分别为通过完整的硬脑膜进入晶须桶状皮层慢慢前进。电极升降控制了用微米的分辨率和数字化监控。局部场电位和尖峰信号通过带通滤波器在0.1到200 Hz和200 Hz至8 kHz的分离，分别使用硬件滤波放大器（FA32;多通道系统）。滤波和放大电压信号进行数字化，并存储在计算机的硬盘（16位A/ D转换器，采样率，420千赫的动作电位，41千赫个LFP）采用CED power1401和的Spike2软件（包括剑桥电子设计）。 基于与暖空气的呼气相关的温度变化的呼吸行为进行监控。热敏电阻（Measurement Specialties公司，波士顿，MA，USA）被放置在一个鼻孔（或下降气管切开的一些实验）的前面，以及呼吸循环能可靠地计量时温度升高，呼气时下降，分别为吸气动作。升高的温度表示为热敏电阻的电压信号的正偏差，这因此对应于呼气动作（图1,2）。生热敏电阻的电压信号进行数字化，在1千赫，并与电生理信号一起存储。 在每个记录会话完成后，林格氏溶液去除，录音室充满了三联抗生素和小鼠回到了自己的家笼。每只动物通常参与实验1-2周。 气管切开术和鼻气流控制。为了进一步探讨这个问题神经元的活动是否被锁定到呼吸的运动行为或鼻腔气流，从而嗅球的激活，我们就从鼻腔气流打开了气管麻醉小鼠独立呼吸。当鼠标可以通过降气管自发呼吸，我们能够通过升气管流动的空气，以独立地调节鼻气流。 对于气管切开术的电生理记录之前的表现，小鼠（n？3）麻醉用阿佛丁（400毫克kg_1）。该气管切开术完成后，麻醉下继续用1-2异氟烷在通过下行气管的开口吸入的氧气。利用压电薄膜接触胸壁自主呼吸监测。升气管连接到Picospritzer三（派克汉尼汾公司，克利夫兰，俄亥俄州，美国）通过使空气（模仿B0.15ml潮气量）进气管来调节鼻腔气流。鼻气流被调节奏的一半，同样加倍的自主呼吸频率（1.6赫兹）。鼻气流被调制为0.8，1.6或3.2赫兹和使用热敏电阻作为下面详细描述的放置在鼻孔的前面进行了监测。 嗅球的电刺激。调查是否在晶须桶皮质局部场电位的活性可以通过在没有鼻气流的嗅球的电刺激来调节，我们在麻醉，tracheomotized小鼠中进行的实验（N +3）。下阿佛丁麻醉下进行气管切开手术，以消除鼻腔气流，因此与呼吸相关的延髓活动。麻醉，然后继续使用异氟醚通过肺吸入气管。小鼠被安装在立体框架，与颅骨右侧晶须桶皮质和嗅球以上被打开了。记录电极插入晶须桶皮质。同心双极刺激电极被降低到嗅球的完整硬脑膜。我们电刺激与节奏刺激模式组成的刺激与间列车间隔为1.25，0.62和0.28的S50Hz的列车的灯泡，对应于0.8，1.6和3.2赫兹，分别刺激节奏。刺激的列车包括了使用50或80毫安刺激电流10毫秒当前步骤。我们保留了列车次数步骤持续时间恒定，同时改变脉冲的数目，以产生不同的刺激frequencies.The刺激列车有30个，15个和8的电流的步骤为0.8，1.6和3.2Hz刺激 节奏，分别为。创造低氧条件。我们通过使老鼠1分钟至缺氧（B10氧）的空气，同时连续地记录所述局部场电位增加的呼吸活动的频率。为此，定制设计的塑料盖被放置在鼠标离开进入到录音室和头部后通过的开口的顶部。呼吸行为，如上所述与一个热敏电阻进行了监测。的空气在腔室中的组合物是通过在1/0的比率混合的大气用氮气控制 常氧和半缺氧条件。气以1 lmin_1的速率流入所述腔室。一个氧气分析仪（GB-300，Teledyne公司的分析。INSTR。，工业城，CA，USA的）连续监测腔室中的O 2浓度。以下至少5分钟稳定LFP记录的，将小鼠暴露于缺氧空气（10O2）1分钟，接着在常氧的空气。呼吸频率，血氧饱和度和心脏率使用MouseOx（斯塔尔生活Sci.Corp。美国匹兹堡）测定，并与电生理数据前，中，暴露在空气中缺氧后，一起记录。 分析局部场电位。 LFP数据收集在清醒，头部固定条件从五个完整和六嗅觉bulbectomized小鼠。初步分析鉴定涉及的LFP活动的respiratoryactivity的相关性和静止呼吸节律的频率。被选择用于进一步分析的稳定的静息呼吸节律（5Hz）期间。相干分析主要集中在静息呼吸的频率范围（1-3赫兹），不包括与嗅探的短暂发作相关的较高的呼吸速率。 分别计算各对同时记录呼吸和LFP信号，以及每个信号的自相关（图1）的交叉相关。呼吸频率被确定为从呼吸信号后0.5和10赫兹（第4阶Butterworth滤波器）之间的带通滤波来计算功率谱的峰值频率。 相位的呼吸节律或鼻气流和LFP振荡之间的锁定通过计算这两个信号之间的相干性评估。一致性谱估计以下列方式：静息呼吸的50-S段和LFP信号服役的呼吸，LFP连贯性的估计。这些细分市场的进一步细分19子段5 sduration有2.5秒的重叠。为每个子段，计算theautospectrum每个信号和所述与呼吸LFP信号的交叉谱的分开。的自相关和互谱进行平均在50-S段，平均交叉频谱进行归一化的平方根的呼吸和LFP信号的平均值autospectra的。比较正常和bulbectomized小鼠呼吸，LFP一致性的程度，我们从每个相关频谱带的连贯性值在相应的呼吸频率和测试的区别在相干值两组与曼的意义Whitney U检验。当我们进行的时间分辨方式的相干性分析，我们采样的9 - S的重叠连续10秒的段（即，步长为1秒的变化），并采用上述的相干谱估计到每个10秒的段与1-S子段0.5-S重叠。 研究了LFP活动的交叉频率相位振幅耦合，我们从LFP提取录像的振荡相位FFP ETT和振幅咏ETT在时间t，并在两个不同的频率，分别，也就是说，相位频率fp和振幅频率fa 。用于该提取中，我们所用的子波变换与在时间t和频率定义的F之类pffifffiffi_ EXP絠2PF eu_tT_ exp_eu_tT2_= e2s2T_Morlet小波。的参数s被设置为10/（1207米），使得小波包含振荡约10个周期。将所得到的振幅除以它的均值，以使绝对振幅值，这依赖于频率，不影响即将举行的相位 - 幅度耦合分析的结果。 频率发和FP之间的相位 - 幅度的耦合程度，测定与平均向量长度MVL？ 1T RT0 XFA; FP etTdt_ （式（1）， 其中T是信号和XFA的持续时间，FP是指XFA复合信号; FP ETT_咏ETT EXP iffpETTI（公式（2）。相位频率fp被固定在呼吸频率，推定为呼吸信号的功率谱的峰值频率。幅频发是不同的取值范围为1256 Hz之间的频率，均匀采样对数刻度。要测试的平均向量长度的意义，是从原始信号施加随机相移为原始信号的每个傅立叶系数在频域，然后反比傅立叶变换的随机信号返回到生成千相位随机化的替代物时域。平均向量长度是完全相同的方式对原始信号计算出的每个人。原来的平均矢量的长度被认为是显著高，如果它超过了95百分位的替代平均向量的长度。 平均向量长度计算从人工制品的免租期抽样录音的50-S段。对于每个正常小鼠，获得了2-3个样品，例如人造体的无段。对于每个bulbectomized小鼠中的50 - S的一个段被采取。 分析扣球活动。二清醒，头部固定小鼠，记录扣球活动晶须桶皮质，同时监测呼吸的行为。扣球活动录得共12个站点，每个鼠标6。秒杀活动采用固定阈值提取。如果信号尖峰信号的信噪比是大于四间尖峰时间间隔有一个不应期45MS，我们把它作为一个独立的单元伽玛分布（N？3）。所有其他秒杀列车被视为多单元的信号（N？9）。该脉冲序列进行卷积，以单位面积的高斯和S2.5毫秒，并且将得到的函数率与呼吸信号（即，热敏电阻器电压输出）。为了确定穗呼吸相关的重要意义，我们通过随机移动的相对时间秒杀列车呼吸时间产生的替代关系。穗列车可以通过0秒和记录的完整时间之间的任意值转移的时间。所有尖峰时间是由相同的值移位，保留峰值间隔序列。该过程重复100次，每次计算移位脉冲序列的相关性，并节省了相关值。从这些100的替代关系，我们计算出的中值相关系数的分布在每个延迟时间的第5和第95百分位数。相关性被认为是显著如果原始相关系数的值超过了替代分布的第五或第95百分位数（图2）。 跟踪研究。五只大鼠麻醉（腹腔注射）与氯胺酮/甲苯噻嗪（100/10毫升kg_1），并放置在一个立体框架（Stoelting，Wood Dale的，IL，USA）。头皮被打开了中线切开，脑袋被调整咬栏前囟和lambda之间夷为平地。体温维持在35度C使用加热垫。玻璃微吸管填充5荧光金（FG，荧光染料，有限责任公司，科罗拉多州丹佛市，美国）下降到每桶皮质和示踪剂（正位_1.0毫米，正中侧面3.8毫米，背腹_0.3毫米？）通过离子导入（精密电流源，Stoelting有限公司伍德戴尔，IL，USA）注射，在2毫安（周期8秒开和8秒关），共20分钟。注射移液管留在原处的前和注射后10分钟。补充麻醉给予必要在整个手术保持在深度麻醉的动物。 经过5天的存活期，小鼠用磷酸盐缓冲盐水和4多聚甲醛心脏灌注。取出大脑并放入4多聚甲醛中1天，然后转移到30缓冲蔗糖溶液，并储存在4_C为至少1周。冠状切片（40毫米，每一个其他部分）中连续使用冷冻切片机切割。 FG可以使用荧光显微镜观察，所以没有进一步的组织学处理是必要的。切片冲洗，安装，空气干燥和盖玻片上salinecoated载玻片用DPX封固用于组织学。所有的材料都可视化，并使用Leica（DMRXA2，徕卡，班诺克本，IL，USA）配备了一台数码相机（滨松ORCA-ER，滨松市，静冈县，日本）和图像处理软件落射荧光显微镜（Simple PCI，滨松成像，日本静冈县）（图7）。分析局部场电位。 LFP数据收集在清醒，头部固定条件从五个完整和六嗅觉bulbectomized小鼠。初级分析涉及识别LFP活动的呼吸活动的相关性和静息呼吸节律的频率。被选择用于进一步分析的稳定的静息呼吸节律（5HZ）期间。相干分析主要集中在静息呼吸的频率范围（1-3赫兹），不包括与嗅探的短暂发作相关的较高的呼吸速率。 分别计算各对同时记录呼吸和LFP信号，以及每个信号的自相关（图1）的交叉相关。呼吸频率被确定为从呼吸信号后0.5和10赫兹（第4阶Butterworth滤波器）之间的带通滤波来计算功率谱的峰值频率。 . 相位的呼吸节律或鼻气流和LFP振荡之间的锁定通过计算这两个信号之间的相干性评估。一致性谱估计以下列方式：静息呼吸的50-S段和LFP信号服役的呼吸，LFP连贯性的估计。这些细分市场的进一步细分19子段5秒的持续时间与2.5秒的重叠。为每个子段，计算各信号和所述与呼吸LFP信号的交叉谱的单独的自谱。的自相关和互谱进行平均在50-S段，平均交叉频谱进行归一化的平方根的呼吸和LFP信号的平均值autospectra的。比较正常和bulbectomized小鼠呼吸，LFP一致性的程度，我们从每个相关频谱带的连贯性值在相应的呼吸频率和测试的区别在相干值两组与曼的意义Whitney U检验。当我们进行的时间分辨方式的相干性分析，我们采样的9 - S的重叠连续10秒的段（即，步长为1秒的变化），并采用上述的相干谱估计到每个10秒的段与1-S子段0.5-S重叠。研究了LFP活动的交叉频率相位振幅耦合，我们提取从LFP录音的振荡相位P（t）和振幅A（t）的时间t，并在两个不同的频率，分别，也就是说，相位频率fp和幅频发。用于该提取中，我们所用的子波变换与在时间t和频率定义的F之类F0.5Morlet小波