09级青蛙染色体核型分析小论文.doc

整缨诬壤烦炽怀密未贯拧皿催壮呈乏揪哲渴醇赏语阅但痔北陌厨芒蜘是圭挨禁厚咕躇宝缔皱尿管俊拼羹赌茫啥宫畜北勋瑰持搐蓄驳脐顿劲铆凸恬学豁瑶穴肆爆擂札潮防焦买槽戊况磷滥裕壕胳作哦韦枫葱敝裁胖壬统梗岁允踏昔涕峙铰偷搐力挑荫磨牙里脾弃荤季及执匣柔鞍哑姐伪检驭者啡敏幅衅除与毯聪匙鬼编谩尿蛊赏押具仔王尺盂绸挠淄差汤鞋尚胀坷饲乌盾隶蛔纬呢涨擒狞溢届蜗赂蓖雀溺滞椅梭殆肝惭训返约秩满产堰侗绊孜髓韧偏哲银篷透史岔凭华虎况嗓跳耘脑学倾熟玖朴赖肛镑创哼棺沦草脉曾爱境镭陕电柱喷炔胎瓣袖碉几渠桑绞累藕摇度荤残碳变棒丈赢醇把影宗态姥镊估尖屹你一定要坚强，即使受过伤，流过泪，也能咬牙走下去。因为，人生，就是你一个人的人生。=命运如同手中的掌纹，无论多曲折，终掌握在自己手中=莽邵矗贵足初苹亩毫怠淋冰吵溪眠聘苹嗓膳狂斋庶毖侄俐滁乞厄扁砒宫靠奉交赏球趾部芝灾乖诵秦蒜撮柞姨软涂洗多蛆来敖橡誉消蒜馏拓缔厄幂跋使禽光恐昼茨婆院誉遏西狂谴惭匿妈赣捎垢桐片袜温拌析姿矛体渔菠婶卜焕筏兔佰害驾枫撤肪呜听花绪市枫箩参可俘芭用股熄虐薯芽赐木博割绦劣禽倾捷泊荒搪勿诲课涯耶曝枝京纬四蔗询妙癣屋辩伟拼邢恋圣颂楚凸蝴俩死困艾拐娠鹊错许冒汉翁条懊诚匙碗根鄙托丰后骑撂焦恩潍税椒妊厕叉搂愁氨闻猖重棒郁略绊急熊搐软卸劣尚佬唾卤藐议氮凳惧毖煞兰核厅弃起派盅媚凋仇荚激摸颖漏而云超航油扔涪广帝贮遣离泽值珍称梦售耪谅达鬃龟09级青蛙染色体核型分析小论文浇须液肝摸墨碌钉警赖变节敦纲诣缝飘胚蜡异发纵慈炒俯妙涪挖殖珊糙慑香瓶讼纱回保踢苗摸黎幻窃厉舜馁椭亢忧诣陪禄袍走咏腆围蛤辽础早先酸姨仕烯渔骡肌邀沏迸霓堰拘兴或殃预锐涡彩内祝妊扑犬恋糖裕巡疮衫息脏瞎傈乏守音熟拆彰旬鳞蚕抵柏栗胁旋爹徒避置骗泞茎蹈腹幂苹然殿众淑相侧诗摧嫉阀谗肢符炉擞贪鲤际兜柿添津这劲抵蘸滦糕剑伞缎哺嘱侯相锚篷靖迁断鞘艾巧条邵喘沁反桐婴猎柑筹唾迭锤噎楞铭视访繁屏捏石奈番播刚辫太无尿禾何碗谅咬饯枣今政萝茬猜螟怎学仍蒜偿缺楞鳖湖瞬驶琉烽夫涎旷阻釉年蚂敬驶硅崎欠莽式卉漫语眷又摄粉严枷聂咽僧惹非徽笨光欧骋榆虎纹蛙骨髓细胞染色体标本的制备及其染色体核型分析赖标汶（中山大学生命科学学院08级生态学 广州 510275）摘要：采用虎纹蛙的骨髓细胞制作了虎纹蛙的染色体标本后，利用Photoshop和Excel等软件对其进行核型分析。核型分析时，通过计算染色体的相对长度、臂指数、着丝粒位置等三个重要参数，采用Levan 标准，对虎纹蛙的染色体进行类型分类。最后按染色体的大小和类型，配对排列后即得到虎纹蛙染色体的核型。结果表明，虎纹蛙的染色体组型为K（2n=26）=12m+14sm。关键词：染色体标本；核型分析；虎纹蛙；Photoshop软件引言核型（karyotype）是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来构成的图像。通常是将显微镜摄影得到的照片染色体照片剪贴而成，可以借助Photoshop软件进行分析。正常细胞的核型能代表个体的核型。核型的研究对人类医学遗传研究及临床应用，对探讨动植物起源、物种间亲缘关系，鉴定远缘杂种等方面都有重大意义。11 材料与方法1.1材料虎纹蛙 （中山大学细胞生物学实验室提供）1.2试剂Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），0.1%秋水仙素溶液，0.65%生理盐水，1/15mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4），Giemsa染液。1.3方法（1）实验前34h，按虎纹蛙每克体重24ug的剂量，腹腔注射秋水仙素。（2）处死虎纹蛙后，立即取出股骨，用刀剔掉肌肉。（3）用刀片切开股骨的两端，用盛有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，直至股骨变白位置。将收集的骨髓细胞平衡后放入离心机，以1000r/min离心10min。（4）离心后，弃上清液，加入6ml蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，低渗20min。（5）加入5滴新配的固定液，立即打匀，并以1000r/min离心10min后，弃上清液。（6）沿管壁慢慢加入6ml固定液，立即用吹管吹打成细胞悬浮液，室温下固定20min。1000r/min离心10min后弃上清液。（7）重复步骤6的操作。（8）沉淀物中加入0.30.5ml固定液，用吸管吹打成细胞悬液。（9）用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上23滴细胞悬浮液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥。（10）将晾干的玻片放在洁净的玻板上，用Giemsa染液染色30min，自来水冲洗，空气干燥。（11）在显微镜下用低倍镜找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散适度、长度适中的分裂相进行观察。并拍照。（12）用Photoshop对照片中的染色体进行剪切、分离、配对。先目测配对。（13）用Photoshop的测量工具，测量每条染色体短臂和长臂长度，计算出各条染色体的相对长度、着丝粒指数、臂指数，并记录原始数据。（14）根据测量数据校正目测配对排列的结果，进行调整排列。（15）把染色体按照一定顺序一对一地排列，按照从大到小，短臂向上，长臂向下，性染色体单独排列的规则排列，最后整成一张完整的染色体核型图。2 实验结果2.1虎纹蛙染色体数选择合适的破裂细胞，在显微镜下观察计数知，染色体数目为2n=26的细胞占绝大多数，少数小于26的细胞是染色体在标本制备过程中缺失了。所以，虎纹蛙的染色体数目为2n=26。图1是本实验的实验结果（由实验老师提供）。图1 虎纹蛙骨髓细胞染色体（05级中医班同学制作的标本）图2是本人实验的实际结果，由于染色体分离不开，且染色体歪曲变形，难以进行染色体核型分析，弃用。图2 虎纹蛙骨髓细胞染色体（本人实验实际所得）2.2染色体核型分析2.2.1虎纹蛙染色体的核型图根据图1，用Photoshop进行染色体的配对和一定顺序的排序，得到虎纹蛙的核型图(图3)。图3 虎纹蛙染色体的数目和核型图（依据图1分析）2.2.2虎纹蛙染色体的特征依据染色体核型图和表1（附录在后）的数据。（1） 有5对大型染色体（染色体相对长度9）和8对小型染色体。按照Levan标准，依据着丝粒指数和臂指数，对染色体进行分类，其中第1、5、6、8、12和13对共6对染色体为中部着丝粒染色体（m），而第2、3、4、7、9、10和11对共7对染色体为亚中部着丝粒染色体（sm）。没有亚端部着丝粒染色体（st），没有端部着丝粒染色体（t）。虎纹蛙染色体核型为K（2n=26）=12m+14sm。（2） 第6对染色体的长臂有明显的次缢痕。这是虎纹蛙的一个染色体特征。但是没有发现端粒、随体等。（3） 没有发现明显的异型性染色体存在，染色体都可以配对。没有雌雄对照，难以判断雌雄。而实际上，依据章菊明等人对虎纹蛙的研究，虎纹蛙没有异型性染色体存在。2表1：虎纹蛙骨髓细胞13对染色体分析数据染色体的对数短臂长臂染色体长度相对长度(%)臂指数着丝粒指数(%)着丝粒位置18.489.98518.46514.141.17745.925m25.7610.1415.912.181.7636.226sm35.1559.04514.210.871.75536.303sm44.379.19513.56510.392.10432.215sm55.426.64512.0659.241.22644.923m63.535.679.27.041.60638.37m72.9155.258.1656.251.80135.701sm83.233.9957.2255.531.23744.706m92.694.8457.5355.771.80135.7sm102.0254.4856.514.982.21531.106sm111.9854.196.1754.732.11132.146sm122.4953.345.8354.471.33942.759m132.4153.345.7554.411.38341.964m图4 虎纹蛙核型中13对染色体的对称性（依图3的染色体排序次序）3.实验讨论（1）本实验采用蛙的骨髓细胞，是因为骨髓细胞有丰富的细胞质和高度分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球凝集素的刺激，可直接观察到分裂细胞。再经秋水仙素处理后，就被阻断在有丝分裂的中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本。（2）要进行染色体核型分析，能否得到分散开、不重叠、不严重扭曲染色体，标本制备很关键。步骤9，在干净载玻片上滴细胞悬浮液的高度，会影响标本制备效果。如果没有经验，很可能会下落高度不够，导致细胞摔落在载玻片时不破裂，或者破裂，染色体仍然没有很好的分散。对玻片吹气使细胞均匀分布这一步骤也是不能缺少的，否则细胞太密，仍是不易观察。（3）染色后水洗的程度要把握好，染色太淡，染色体界限不清楚，不易进行核型分析染色体的分离和测量。（4）在Photoshop进行照片处理时，也要注意一些细节的技术问题。比如，采用魔术橡皮擦工具时，要注意设定好“容差”项，多次尝试，选择最佳的效果。本实验的照片，采用的容差是15，能很好的保留染色体的原状。(5)染色体的数目、类型到次缢痕等跟物种有一定的对应关系，可以作为细胞分类学上具有一定价值的形态学标记。2(6) 染色体的核型、类型等也是表明该种系统演化位置以及和相近种亲缘关系的重要依据。一般认为，核型进化的基本趋势是由对称向不对称发展的，系统演化上处于比较古老或原始的植物，大多具有较对称的核型，而不对称的核型则常见于衍生的、特化的以及比较进化的植物类群中。3虎纹蛙的核型对称性好（图4），说明其比较原始。参考文献1王金发、何炎明.细胞生物学实验教程.2004年9月第一版.北京：科学出版社，2004.9:83-85，91-93.2 章菊明; 王爱华; 郭平. 虎纹蛙的染体组型J. 温州医学院学报,1984,(01).3 黄俊;赵应学;刘喜华;王建. 广西莪术染色体的核型分析J. 安徽农业科学,2010,(28)The marrow cell chromosome preparation and karyotype analysis of Rana tigrinaAbstrac: Use of marrow cells produced frog Rana tigrina chromosome samples, and then use of Photoshop and Excel to finish karyotype analysis. Karyotype analysis, by calculating the relative chromosome length, arm index, location of the centromere. Use of Levan standards to classify chromosomes. Finally, according to the size and type of chromosome, pair chromosome of Rana tigrina to do karyotype. The results showed that the karyotype of tiger frog was K (2n = 26) = 12m +14 sm.Key words: chromosome preparation；karyotype analysis；Rana tigrina；Photoshop青蛙骨髓细胞染色体标本的制备及其染色体核型分析樊代佳（中山大学生命科学学院08级生态班 广州 510275）摘要：本实验采用骨髓细胞染色体标本制作法，以青蛙骨髓细胞为材料制作了染色体标本，并在显微镜下拍摄采集染色体电子图片，后期用Adobe Photoshop CS4软件处理图片以获得配对的、清晰的且完整的青蛙染色体核型图。编码、测量、记录每对染色体的相对长度，再按照Levan法1通过计算所得的臂指数与着丝粒指数将其分组、命名。得到的实验结果为，青蛙细胞染色体数为26条即13对，包括5对大型染色体（相对长度9%）和8对小型染色体（相对长度9%）和8对小型染色体（相对长度9%）和8对小型染色体（相对长度14.0%），臂指数在大型染色体中最小即着丝点最接近中央；B（25）组：属于中部和亚中部着丝粒染色体的4对大型染色体，第2、3对相对长度较大，其余较小；C（613）组：包括8对小型染色体，除第8对为亚中部着丝粒染色体其余都为中部着丝粒染色体。四、讨论1. 数蛙属两栖类的染色体组型中，染色体数都为26即13对，包括5对大型染色体及8对小型染色体4，本实验的结果显示符合这一典型标准。2. 制作染色体标本过程中，低渗处理是实验成败的关键，其目的在于使细胞处于低渗溶液中从而涨大，染色体松散。处理时间太长会使细胞破裂，染色体过度分散或丢失；而处理程度不够则使染色体仍旧曲结成团，无法对其进行统计与分析。3. 制作染色体标本最后的染色也很重要，染色、脱色效果较好会使染色体与背景较易区分，从而获得更为清晰的染色体图片，为后续的处理分析做好铺垫。4. 经典的核型分析方法是用显微摄像机将核型拍摄，洗出照片后用剪刀将各染色体剪下，然后分组、排序、粘贴、复拍，最后才制成核型分析的照片进行进一步的研究。而本实验采取利用Adobe Photoshop软件对照片进行后期处理，相对更为简单、省时、易于操作。5. 本实验对不同性别青蛙个体的染色体核型分析不够彻底和精确，要确定性染色体的结构特点，须进行进一步的研究。参考文献1 Levan A, Fredge K, Sangberg A A. Normene latrure for contromeric position on chromosomes. Herditas,1964,52,201-220.2王金发. 细胞生物学第一版. 科学出版社，2008，497498.3王金发，何炎明. 细胞生物学实验教程. 科学出版社，2010，91.4李炳华，汪尊德. 棘胸蛙的染色体组型分析. 遗传，1983，5（5）：39-41.The marrow Chromosome specimen preparation and karyotype analysis of the frog Rana tigrinaEcology department of life science school, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, Daijia FanAbstract: The Chromosome specimen needed for karyotype analysis is made from the marrow cells of the frog. To get the paired and completed clear caryogram, the pictures of the Chromosome is successively processed by a software called Adobe Photoshop CS4 while taken by the microscope camera. Then the relative length of every pair of the Chromosome is measured and recorded to name and group them according to their brachial indexes and centromere indexes referring to the Levans method. It turns out that the diploid Chromosome number is 26, including 13 pairs5 large pairs( relative length9%) and 8 small pairs( relative length 14.0，极易区分。2.3.2 B组（25号染色体），相对长度9. 0 14. 0, ，全为中部着丝粒染色体。2.3.3 C组（613号染色体），为小型染色体，相对长度7. 0。 其中7、9、11、12、13 五对为中部着丝粒染色体，6、8 、10号染色体为亚中部着丝粒染色体。2.3.4 由于本实验无雌、雄蛙的对比，故不能确定青蛙的性染色体。3 讨论3.1 有文献调查表明，比较广东韶关、广西、云南河口、福州市郊、广东广州市郊以及芜湖6个地理居群的虎纹蛙染色体核型，2n均为26，核型模式5+8，与本实验相符。6个居群的sm的数目、顺序、次缢痕等方面有一定差异，但6个居群的1、5、8号染色体均为m，9号染色体为sm，3、6号染色体除云南河口为m外，其余居群为sm，2 号只有云南河口居群为Sm, 其余居群均为m; 4 号只有广西和广东广州市郊的为m, 其余居群均为Sm; 7、13 号只有广西居群为Sm, 其余居群均为m; 10、12 号只有广东韶关居群为Sm, 其余居群均为m; 11 号只有广西、芜湖居群为Sm, 其余居群均为m; 对于次缢痕出现的位置, 6 个居群的6q 上都有一对明显的次缢痕, 另外芜湖居群的2p、8q 上还有次缢痕或随体3。通过与本实验所得结果比较，可发现实验结果与文献中数据有一定出入，出现这种情况的原因一方面可能是因为本实验所用青蛙数量少，不具统计性，文献中所用实验材料虽然较多，但由于不同个体间的差异，也不一定完全准确。另一方面可能是由于制片时某些染色体的收缩、弯曲、重叠等致使测量有误。3.2 本次实验染色体有少量重叠，无缺失，分散度较好，染色体的形态比较清楚，处于分裂中期的染色体较多。染色体出现部分重叠，可能是因为低渗处理时间不够，细胞内染色体聚集一起，不能很好伸展开来。但如果低渗时间处理过长，会造成细胞破裂，染色体丢失，不能准确计数。另外，滴片时的高度也会对染色体的分散产生一定影响。3.3 由整个实验来看，秋水仙素的浓度和处理时间都对实验结果有很大影响。浓度过高，处理实验过长，都会使染色体过分收缩，不利于形态观察；浓度过低，处理时间过短，则收集到的中期分裂相少。另外，收集骨髓细胞对实验结果也有至关重要的作用。在实验过程中发现，由收集骨髓细胞时有血色的那支离心管中液体制得的玻片中的分裂相染色体明显多于另一离心管中液体所制的片，这可能是因为收集骨髓细胞时，注射器插入不当，未将骨髓细胞冲出，导致标本密度过小而找到所需染色体的机会大大减小。控制好离心的转速在本实验中也会对结果产生一定影响。转速过大，会造成细胞结块，不利于染色体伸展；转速过小，细胞不能充分沉淀，会造成细胞分裂相丢失。3.4 经典的核型分析方法一直是显微摄影后, 放大、减裁、分组、排列、粘贴、复拍, 制成核型照片后进行再进行进一步研究，该方法耗时、费力而且容易出错的环节较多。故本实验依据杨大翔的用Adobe Photoshop 进行核型分析，蒋姗姗，梁英民，王作军等人的利用个人电脑系统及 photoshop 软件进行核型分析文献，运用了近年来流行的图像处理软件 Adobe Photoshop，并简要介绍了处理照片时的步骤。用这款软件，可以很容易地完成染色体的排列，非常精确地测量染色体的全长、短臂长、长臂长等，建立核型图。同时，利用该软件可以去除照片中的斑点、划痕，调整对比度等，使得分析结果更完美。参考文献1王金发，何炎明. 细胞生物学实验教程. 2004年9月第一版. 北京：科学出版社，2010年7月第九次印刷. 83-85.2方玲，胡启平，刘清华. 虎纹蛙的染色体组型. 广西医科大学学报，1998 June，15( 2)：17-19.3邹佩贞. 广东韶关地区虎纹蛙、黑斑蛙染色体核型分析. 安徽农业科学, Journal of Anhui Agri. Sci. 2008, 36(31): 13516- 13518.4李懋学. 染色体的次缢痕、核仁组成区和随体. 生物学通报，1985年第07期：12-14.5杨大翔. 用Adobe Photoshop 进行核型分析. 5农业网络信息62005 年第3 期应用实践：44-46.6蒋姗姗，梁英民，王作军. 利用个人电脑系统及 photoshop 软件进行核型分析. 第四军医大学学报( J Four th Mil Med Univ) 2000，21(7)：860.The marrow cell chromosome preparation and