DB21∕T 2396-2015 水稻品种抗稻瘟病基因检测 PCR法.pdf

ICS 65.020.01 B 04 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 23962015 水稻品种抗稻瘟病基因检测 PCR 法 2015-05-18 发布 2015-07-18 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 23962015 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由辽宁省农业科学院提出。本标准由辽宁省农村经济委员会归口。本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责起草。本标准主要起草人：陆晓春、郑文静、丛玲、赵家铭、王妍、张丽霞、白春明、王春语、朱振兴、马丽、李丹、王平、李金红等。本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责解释。DB21/T 23962015 1 水稻品种抗稻瘟病基因检测 PCR 法 1 范围 本标准规定了检测水稻品种抗稻瘟病基因的 PCR 检测法，包括原理、仪器设备、试剂和材料、防污染措施、实验步骤及结果分析。本标准适用于水稻品种中抗稻瘟病基因 pita、pid2、pid3、pik、pikp、pikm、piks、pi21、pi36、pi37和 pi5 的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 农业部 1485 号公告-42010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 3 术语及缩略语 下列术语及缩略语适用于本标准 3.1 正向引物：处于 DNA 双链上游的引物，简称 F 引物。3.2 反向引物：处于 DNA 双链下游的引物，简称 R 引物。3.3 内参引物：在聚合作用起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。3.4 DNA:Deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸。3.5 PrimeSTAR HS DNA Polymerase:高保真 DNA 聚合酶。3.6 PrimeSTAR Buffer（5）:5PCR 反应液。3.7 dNTP Mixture（10mM）:单核苷酸混合液（10mM）。3.8 PCR:Polymerase chain reaction。3.9 TAE：Tris-Cl、冰醋酸、EDTA 缓冲液。DB21/T 23962015 2 3.10 Goldenview：核酸染料，替代溴化乙锭。3.11 DNA Marker：标准分子量的核酸标记。3.12 bp:Base pair,碱基对。3.13 Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。4 原理 根据水稻抗病基因保守区序列设计特异性引物，提取不同水稻品种的 DNA，对试样进行 PCR 扩增，依据是否扩增获得预期大小的 DNA 片段及特定的序列来判断样品是否携带该抗病基因。5 仪器设备 5.1 台式离心机。5.2 PCR 仪。5.3 凝胶成像系统。5.4 琼脂糖电泳槽及电泳仪等电泳装置。5.5 恒温水浴锅。5.6 分析天平：感量 0.1g、0.01g 和 0.1mg。5.7 具盖塑料离心管：2mL，0.2mL。5.8 研钵、研杵。5.9 移液枪和吸头：1000 L,200 L,10 L。5.10 其它相关仪器设备 6 试剂和材料 6.1 供试水稻叶片或种子。6.2 DNA 提取试剂盒。6.3 PrimeSTAR HS DNA Polymerase。6.4 PrimeSTAR Buffer（5）。6.5 dNTP Mixture（10mM）。6.6 DNA Marker：可以清楚地区分 100bp1000bp 的 DNA 片段。6.7 50TAE 缓冲液，使用时稀释 50 倍。DB21/T 23962015 3 6.8 加样缓冲液。6.9 引物 见附录 A。除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。7 防污染措施 检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。8 实验步骤 8.1 水稻 DNA 提取 按农业部 1485 号公告-42010 的规定执行。8.2 PCR 反应 8.2.1 将试样 DNA、PrimeSTAR Buffer（5）、dNTP Mixture、正向引物及反向引物及 ddH2O 置于冰上融化。8.2.2 在 0.2mL 加盖无菌离心管中，按先后顺序加入：PrimeSTAR Buffer（5）6 L dNTP Mixture(2.5 mM)2.4 L 正向引物及反向引物(100nM)0.2 L(终浓度:0.2M0.3M)，试样 DNA 1 L（20100ng）ddH2O 20.1 L PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/L)0.3 L 用移液枪抽打混匀，盖上盖子短暂离心，置于冰上待用。8.2.3 将离心管置于 PCR 仪中，反应程序为：95 预变性 5 min，95 变性 30 s，55 61 退火 30 s，72延伸 30 s 60 s（每对引物的退火温度及延伸时间参见附录 A），29 个循环，72 总延伸 5 min，4 保存。8.3 PCR 产物电泳 8.3.1 用 200 mL 玻璃烧杯称取琼脂糖 0.5 g，加入 1TAE 缓冲液 50 mL。8.3.2 杯口用锡箔纸盖好，置微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。8.3.3 琼脂糖冷却至 50 左右时加入 2.5 L Goldenview，混匀，迅速将胶倒至模具中，放置上样梳。8.3.4 待胶完全凝固后，拔下上样梳，置于盛有 1TAE 缓冲液的电泳槽中。8.3.5 吸取 5 L PCR 反应液，与 1L 加样缓冲液混匀，上样，130v 电泳 0.5 h1.0 h。8.3.6 电泳结束后，取下琼脂糖胶，利用凝胶成像系统观察电泳条带大小，并照相。8.4 PCR 产物测序 DB21/T 23962015 4 将 25L 的 PCR 产物提交至 DNA 测序技术机构，测序。9 结果分析 9.1 判定原则 9.1.1 模板质量的检测 所有参试品种的DNA，需用水稻内参引物（Primer9）检测，以确定DNA模板的浓度及纯度适宜,如用水稻内参引物（Primer9）扩增时无特异性PCR产物，则需重新提取试样DNA。9.1.2 结果判定原则 鉴定水稻品种中是否携带抗稻瘟病基因时，如不能扩增出特定长度的 PCR 产物，则可判断试样中不含有相应的抗病基因；如可扩增出特定长度的 PCR 产物，则需结合电泳结果和测序结果共同分析。9.2 Pita 9.2.1 电泳结果分析 用附录 A 中 Primer1 扩增，如该品种携带 Pita 抗病基因，则其 PCR 产物应为 467bp，电泳图中其产物片段应处于 DNA Marker 的 400 bp500bp 间；反之，如无 PCR 产物或 PCR 片段长度与 467bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pita 抗病基因。9.2.2 测序结果分析 PCR 产物的序列与附录 B 所示序列 seq-1 分析在 431 bp433 bp 处，如碱基序列为 GCT 则该品种所含抗病基因则为 Pita 的抗病等位基因；反之，如该品种在 431 bp433 bp 处测得的序列为 TCT 或其它序列，则认为参试品种含有 Pita 的感病等位基因。9.3 Pid2 9.3.1 电泳结果分析 用附录 A 中 Primer2 扩增，如该品种携带 Pid2 抗病基因，则其 PCR 产物应为 496bp，电泳图中其产物片段应处于 DNA Marker500bp 左右；反之，如无 PCR 产物或产物片段长度与 496bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pid2 抗病基因。9.3.2 测序结果分析 PCR 产物的序列与附录 B 所示序列 seq-2 分析在 263 bp265 bp 处，如碱基序列为 ATA 则该品种所含抗病基因则为 Pid2 的抗病等位基因；反之，如为 ATG 或其它序列，则认为参试品种含有 Pid2 的感病等位基因。9.4 Pid3 9.4.1 电泳结果分析 用附录 A 中 Primer3 扩增，如该品种携带 Pid3 抗病基因，则其 PCR 产物应为 550bp，电泳图中其产物片段应处于 DNA Marker 500bp600bp 间；反之，如无 PCR 产物或产物片段长度与 550bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pid3 抗病基因。DB21/T 23962015 5 9.4.2 测序结果分析 PCR 产物的序列与附录 B 所示序列 seq-3 分析在 232 bp234 bp 处，如碱基序列为 CAG 则该品种所含抗病基因为 Pid3 的抗病等位基因；反之，如为 TAG 或其它序列，则认为参试品种含有 Pid3 的感病等位基因。9.5 Pik/Pikp/Pikm/Piks 9.5.1 电泳结果分析 用 Primer4 扩增，如该品种携带 Pik/Pikp/Pikm/Piks 抗病基因，则其 PCR 产物应为 992bp，电泳图中其产物片段应处于 DNA Marker 1000bp 左右；反之，如无 PCR 产物或产物片段长度与 1000bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pik/Pikp/Pikm/Piks 抗病基因。9.5.2 测序结果分析 PCR 产物的序列与附录 B 所示序列 seq-4 比对，如在 685 bp687 bp 处碱基序列为 GAG 且在 754 bp756 bp 处为 CCT，则该品种所含抗病基因为则为 Piks 的抗病等位基因；如在 685 bp687 bp 处碱基序列为 CAG 且在 754 bp756 bp 处为 CCT，则该品种所含抗病基因为 Pikm 的抗病等位基因；如在 685 bp bp687 处碱基序列为 AAG 且在 754 bp756 bp 处为 CAT，则该品种所含抗病基因为 Pik 的抗病等位基因；如在 685 bp687 bp 处碱基序列为 AAG 且在 754 bp756 bp 处为 GAT，则该品种所含抗病基因为 Pikp 的抗病等位基因；反之，待检品种在上述区域序列与几种等位基因均不符，则认为参试品种不含有 Pik 及其它几个抗病等位基因。9.6 Pi21 9.6.1 电泳结果分析 用 Primer5 扩增，如该品种携带 Pi21 抗病基因，则其 PCR 产物应为 633 bp，反之，如无 PCR 产物或产物片段长度与 633bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pi21 抗病基因。9.6.2 测序结果分析 PCR 产 物 的 序 列 与 附 录 B 所 示 序 列 seq-5 比 对，如 在 138 后 及 在 321 后 分 别 有ctgccgcagccgccgccgccg21 个及 tgcaagccggaggagccgccgaagccgccgccggagaagccgccgccg 及 48 个碱基的缺失（即去除前后引物结合的位置，参试品种序列应与 seq-5 所示序列一致），则该品种所含抗病基因为 Pi21的抗病等位基因；反之，若待检品种不存在上述特定序列的缺失，则认为参试品种不含有 Pi21 抗病基因。9.7 Pi36 9.7.1 电泳结果分析 用 Primer6 扩增，如该品种携带 Pi36 抗病基因，则其 PCR 产物应为 452 bp，电泳图中其产物片段应处于 DNA Marker 400 bp 500 bp 间；反之，如无 PCR 产物或产物片段长度与 452bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pi36 抗病基因。9.7.2 测序结果分析 PCR 产物的序列与附录 B 所示序列 seq-6 分析在 271 bp273 bp 处，如碱基序列为 AGT 则该品种所含抗病基因则为 Pi36 的抗病等位基因；反之，如为 AAT 或其它序列，则认为参试品种含有 Pi36 的DB21/T 23962015 6 感病等位基因。9.8 Pi37 9.8.1 电泳结果分析 用 Primer7 扩增，如该品种携带 Pi37 抗病基因，则其 PCR 产物应为 600 bp，电泳图中其产物片段应处于 DNA Marker 600bp 附近；反之，如无 PCR 产物或产物片段长度与 600 bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pi37 抗病基因。9.8.2 测序结果分析 PCR 产物的序列与附录 B 所示序列 seq-7 比对，如在 295 bp297 bp 处碱基序列为 GTA，且在 319 bp321bp 处碱基序列为 ATG，则该品种所含抗病基因则为 Pi37 的抗病等位基因；如在 295 bp297 bp处碱基序列为 GCA 或其它序列，以及在 319 bp321bp 处碱基序列为 ATC、ATA 或 ATT 或其它序列，则认为参试品种含有 Pi37 的感病等位基因。9.9 Pi5 用 Primer8 扩增，如该品种携带 Pi5 抗病基因，则其 PCR 产物应为 1105 bp；反之，如无 PCR 产物或产物片段长度与 1105 bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pi5 抗病基因。DB21/T 23962015 7 A A 附 录 A（规范性附录）用于扩增抗稻瘟病基因的引物 抗病基因 引物序列 (5-3)退火温度()延伸时间(s)F ACTTCATGTT TGTCTGTACA GCA Pita Primer1 R TCAAACAATC ATCAAGTCAG 55 30 F GAT ATGTAGGCAC TAACTTCTTC Pid2 Primer2 R CCAAGATACA CAGATCCAAA CC 55 30 F CATGACAACC CTTCAGACAT Pid3 Primer3 R ACAGAGCAGG AACTTCAGAT 55 30 F GCAGAGTTCATCAGATCCGAGCT Pik/Pikp/Pikm/Piks Primer4 R GCTGATATGT TGTCGATGAG ATG 55 60 F AAGGTGGAGTACGACGTGAA Pi21 Primer5 R TCACATGATG GAGCAGGCGT T 55 60 F GTTCATGATA TGGTGCTCGA TC Pi36 Primer6 R TCCGGCAGCT CTTCTATTGT AC 55 30 F AATGAACTGA AGACCATGCT GGA Pi37 Primer7 R TGGAAGTACA TCTCGTCTAG AAG 55 40 F CCAAGTGCAA CTAGAGGTAT GGT Pi5 Primer8 R GTGCATCATC TTCAGATATC AGG 56 70 F TCAGCAACTGGGATGATATGGAG 水稻内参引物 Primer9 R GCCGTTGTGGTGAATGAGTAAC 55 30 DB21/T 23962015 8 B B 附 录 B（规范性附录）扩增子序列 抗病基因 序列编号 抗稻瘟病基因扩增 DNA 片段 Pita Seq1 ACTTCATGTT TGTCTGTACAGCACCATGCA TGACTTTTGT GGAAGGAGCA ATGCCGAGTG TGCAAAGGTT AAATCTAAGGTTCAATGCCA ACGAGTTCAA GCAGTATGAC TCTAAGGAGA CAGGGTTGGA ACACTTGGTCGCCCTTGCAG AGATCTCTGC AAGAATTGGG GGCACTGATG ATGATGAATC AAACAAAACTGAAGTGGAGT CTGCCTTGAG GACTGCAATT CGCAAGCATC CGACGCCGAG CACTCTTATGGTTGATATAC AATGGGTGGA TTGGATCTTT GGTGCTGAAG GGAGAGACTT GGATGAAGATTTGGCACAAC AAGATGATCA CGGGTATGGA TTTTTCATTC TATTCCCAGG TTACAACTTACAAGGATTAT TGAGCTTCTT TCTTTCTCTG CCGTGGCTTC TATCTTTACC TGCTATGCATCTTCAACCTG ACTTGATGAT TGTTTGA Pid2 Seq2 GAT ATGTAGGCAC TAACTTCTTC CCTCCTGCGG CTAAGACGAA CCTTACGGGT TGTAAGAGTG CCTGTACAGG CAACTGCTCTTGTGTTGCTG TGTTCTTTGA TCAATCTTCA GGCAATTGTT TCCTTTTCAA CCAGATCGGAAGCTTGCAGC ACAAAGGTGG GAATACAACT CGTTTCGCAT CTTTTATCAA GGTATCAAGCAGAGGAAAAG GTGGGAGTGA TAGTGGCAGT GGGAAGCACA ATACCATTAT TATTGTCATTATACTCGGAA CTTTGGCTAT CATAGGCGTC CTTATTTATA TTGGTTTCTG GATCTACAAGAGGAAGAGGC ATCCTCCACC ATCACAAGAC GACGCTGGTT CATCGGAAGA TGATGGATTTCTGCAAACAA TATCCGGAGC ACCAGTGCGG TTCACTTACA GGGAGCTCCA GGATGCGACAAGCAACTTCT GTAACAAGCT TGGTCAGGGA GGGTTTGGAT CTGTGTATCT TGG Pid3 Seq3 CATGACAACC CTTCAGACAT TACTACTCAT GGAAGCTAGT TCTCAAATGGTTCATCACCT AGGCTCTCTT GTGGAGTTAA GAACCTTTCG TATCAGCAAG GTGCGAAGTTGCCATTGTGA GCAGTTGTTC ATGGCCATCA CTAATATGAT TCATCTTACC CGTCTTGGGATCCAGGCAGA CAGTAGTCAA GAAGTGCTGC ATCTTGAATC ACTTAAACCT CCTCCTCTACTTCAG AAACT TTTCTTGCAA GGTACATTAT CTCATGAATC ATTACCTCAT TTCGTGTCTGTAAGCAATCT GAATAACCTC ACGTTTCTAC GTCTTGCTGG GTCAAGAATT GACGAAAATGCATTCCTTAA TCTTGAGGGA TTACAGCAGT TGGTAAAGCT ACAGCTTTAT GATGCATATGATGGAATGAA TATATACTTC CATGAGAACT CATTTCCAAA GCTCAGAATA CTGAAAATATGGGGTGCCCC ACACCTGAAT GAAATTAAGA TGACAAAAGG AGCTGTGGCA AGCCTAACAGATCTGAAGTT CCTGCTCTGT Pik/Pikp/Pikm/Piks Seq4 GCAGAGTTCATCAGATCCGAGCTGGAGGCC GTGCACTCTC TCCTCACCCC AAATATCTTGGGGAGGATGG GGGATGACGA TGCGGCGTGC AAGGATGGCT TGATTGCGGA GGTCCGGGAGCTGTCCTACG ACCTGGATGA TGCCGTCGAC GACTTCTTGG AGCTCAATTT CGAGCAGCGAAGAAGCGCAA GCCCTTTCGG TGAGCTCAAG GCAAGAGTTG AGGAGCGTGT CTCCAATCGCTTCTCTGACT GGAAGCTACC GGCGGCGAGC CTTCCGCCGT CGTCGGTACA CCGTCGAGCTGGCTTGCCGC CACCAGATGC AGGGCTGGTG GGGATGCACA AACGTAAGGA DB21/T 23962015 9 AGAGCTCATCGAGTTGCTGG AACAAGGGAG CAGTGATGCT TCACGATGGC GCAAGCGAAA ACCTCATGTCCCCCTCAGGA TAATGGGAGG GGAAATGCAA AAAATCGTGT TCAAGATTCC CATGGTGGACGATAAGAGCC GTACAAAAGC AATGTCATTG GTTGCAAGTA CGGTTGGAGT GCACTCGGTTGCAATCGCCG GTGACCTAAG AGACCAGGTT GTGGTGGTCG GTGATGGCAT TGACTCCATCAATCTGGTCT CTGCGCTCCG GAAGAAGGTG GGCCCTGCGA TGTTTCTGGA GGTCAGCCAAGTAAAGGAAG ATGTGAAGGA GATAACGGCG ATGCTTGCGC CGGTGAAATC CATATGTGAATTTCACGAGG TCAAAACAAT TTGCATCCTT GGATTGCCAG GGGGAGGCAA AACAACGATTGCCCGAGTAC TATATCATGC ATTGGGAACG CAGTTCCAAT GCCGGGTTTT CGCATCAATCTCTCCAAGTT CCAGCCCCAG TCCCAATCTA ACAGAGACTC TTGCAGACAT TTTCGCTCAAGCACAACTAG GAGTAACTGA TACACTTAGC ACACCATATG GTGGGAGTGG GACCGGGAGAGCTCTTCAACAACATCTCATCGACAACATATCAGC Pi21 Seq5 AAGGTGGAGTACGACGTGAAGAACAACAGGGTGATCGTGCGCGGGAAGTTCGACCCGGAGAAGCTGTGCAAGAAGATCTGGTGCAAGGCCGGCAAGATCATCAAGGAGATCCTCATCGTCGACGTCTGGCCGCCGCCGTGCAAGCCGCCGCCGTGCGAGAAGCCTCCGGAGGACTGCAAGCCCAAGCCCTGCCATTGCTGCAGCTGCGAGAAGCCCAAGCCCAAGCCCAAGCCCTGCCACTGCGAGAAGCCCAAGCCCTGTCACTGCGAGAAGCCCAAGCCATGCGAGAAGCCGCCGCCGAAGCCGGAGTGCAAGCTGGTGCCGTACCCTTACCCGGTGCCGTACCCGTACGCCGGGCAGTGGTGCTGCCCAAAGCCTGAGCCGCCGAAGCCGCCGCCGGAGCCACCGAAGGAGCCGGAGCCGCCGAAGCCGTGCGGGTGCTCGCACGCCTTCGTGTGCGTCTGCAAGCCGGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGTGCGGGTGCTCGGGGGGCCACGGGAACTGCGGCTGCGGCATCAGGCCGTGGCCGCCGCAGGTGTGGCCGCCGCCGCCCGTCTGCCCGCCGCCGCCGTGGTGCTACACCGAGGACAACGCCAACGCCTGCTCCATCATGTGA Pi36 Seq6 GTTCATGATA TGGTGCTCGA TCTAGCTCGT TCATTGACAA GTGAACAAAA CTTTGTCACCGTATTGGATA ACGATGAGCA ACGGAAACCT GAAAGCACCA ATGCTCGTAG GTTGGCCCTGCACCGTACGA GTATCACGAG CTATCGATTT GTTAATATGG ATATGAAGAA AGTGAGGTCATTTGTTGCCA CTGAGTGCAA TAATGGCAAT AATAGTGTGG CACCACCAAG GTTCCAAGTTTTACGTGTGT TGTCCTTGGA CAAATGTAGT GGTATGGAGG ATTATTACAT AGAAAGTATC TTGCAGTATG CTGGAAGGCT GGGTCACCTG AGGTGCCTCC AGCTTTCCTC ACACACAGAG TTTCATAGGC TCCCTAAAGA ATTAGGAGAT CTCAAGTTTC TAAAAATACT GGACTTGGGTGATTGTGGCG GTACAATAGA AGAGCTGCCG GA Pi37 Seq7 AATGAACTGA AGACCATGCT GGAGAAAGCC AAGGAGTTCC GTGAGCTGAT TCACTTACCTGCTGGTAATA GTCTTGAGGG TCCCAGTGTA CCAACAATTG TTGTTCCTGT AGTGACATCGCTATTGCCGC CAAGAGTATT TGGTCGCAAC ATGGATCGCG ATCGCATAAT ACATCTTCTTACTAAGCCAA TGGCTACTGT TTCTAGCTCA GTCGGCTACT CTGGTTTGGC CATTGTTGCACATGGAGGAG CAGGAAAATC CACCTTAGCA CAATGTGTTT ACAATGACAA GAGGGCACAAGAACATTTTG ACGTCAGGAT GTGGGTCTGC ATCTCACGCA AACTTGATGT TCATCGCCATACACGTGAGA TTATCGAGTC AGCAACAAAT GGAGAGTGCC CTCGTGTGGA CAATCTTGATACTCTCCAGT GCAGATTGAA GGACATAATG CAAAAATCAG AGAAATTCCT GCTTGTGTTGGATGACGTCT GGTTTGATGA ATCCGTCAAT GAGAGGGAAT GGGACCAGTT GCTTGATCCTCTTGTTTCTC AGCAGGAGGG GAGCAGAGTT TTGGTGACTT CTAGACGAGA TGTACTTCCA DB21/T 23962015 10 Pi5 Seq8 CCAAGTGCAA CTAGAGGTAT GGTACAACAG ATTCCAGGAA ACCAGCTCTC ATCGCCTTCA TCTCATCTTT CTTCCTTTGC ATCAAGCTCA GCGCCATTTG CATCCTCCTC TTCGGACACC TCAACAAGTG AGCATCCAGT GCCTAATGAA GAGGCGGCAG GTATGGTACT TCAAATAATT TTCTCCCGAT TTAATCATCT CAAGATGAGG TTCACTTCTT TATTTGAATA TACCATTATA AGGAAATAGA TCATGCGCCC TCTTGTTTAA AGGAATTTGA TGTTTTTTTA TATTCGCTCT CTTTGAGATA TACCTGTCAT CCAGCAGTGG TAAAAAGGAT AGTATATAGC TGACAAATAT GTTCATATAA TTTCCTTGTG GGTAATTTTG ATATTCTCTT TCTATCTTAA TACGTGTTAT GAGCACCGGC TAATGACCGA ATGGGGTATG AATGGAACAC CGGAGGTCGA GGCTTTTGGC AGCCTCTTCG ACGTCTGGCC CATGATCGGC GACGAAAGCA AAAGCAGGGG ATGAGAGAGT AGAGAATTGG AGACGAGACT ATAGATTGAA TCTTGCTTGG TTCATTCATG ATTTCGTGGC CCTTAATTAG GCTTACGATT GAACTGAATT AGCTAATAAA AAAGGATAAC AAAGTCTTCT CTAAATGTAA GCAATCGGAT CACTATCGCT CGTCCGGCAT GCCGCGTCAG TTTTCAGCTC GCGTGATCTC CTTCGACGCC GCTTGGACCG GTTGCTGCAT CCGCGTAGTT GCGTTTCTTC ATGTAGACGA TTCCGACCCT TTACATTACA ACTACTTGGA ATTCTTTGAG TGTTCTAAAA TAATTTGGAT AGTGGTACAT ATGTGGTTAC ATTTTCTTAA TGGTGACATA TAGCCAAGTT GGACTAAGAT TAATTTTAAT TTGTGTGGAA TGAGAAAGAG TCAAGACAGT TTGATACGTA GAAGTTTGCA TATTCAGAAC CTTATACTGG TTTGTCTTGG TTTATTTTCT TGACAATGCA GCTTTGACAG TTCCTCGGTC CAAAGAGAAA TGCGACAACA CTCCCATGCC GGTAAAAGAT GGCCTGATAT CTGAAGATGA TGCAC 注：阴影部分为等位基因间的多态性位点，加下划线的为引物结合位点。_