海洋真菌Aspergillus jensenii SS5中化学成分研究.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1902-1906海洋真菌Aspergillus jenseniSS5中化学成分研究胡靖瑶1-2，袁瑞瑛1.2*，王广明，蔡诗琪，周明琦，王富乾3*，蔡由生21西藏大学医学院，拉萨8 50 0 12；武汉大学药学院，武汉430 0 7 1；武汉市第一医院药学部，武汉430 0 2 2摘要：利用多种柱色谱分离技术从海洋真菌Aspergillus jenseni SS5的液体发酵产物中分离获得4个已知化合物，并通过NMR、H R-ESI-M S、X单晶衍射等技术鉴定了它们的结构，分别是epigriseofulvin（1）、s t e r i g ma t o c y s t i n（2）、b r e v i a n-amideM(3）、m e l e a g r i n（4），其中化合物13是首次从曲霉属真菌A.jenseni中分离获得。采用SRB法对分离获得的天然产物进行体外细胞毒性测试,结果表明化合物4对人肺癌A549细胞和人肝癌Bel-7402细胞均有较好抑制作用，化合物2 对A549人肺癌细胞株有较好抑制作用。本研究作为海洋真菌A.jensenii SS5的化学成分的补充研究，发现了2 个具有较好细胞毒活性的化合物，为曲霉属海洋真菌活性天然产物的开发提供了理论依据。关键词：海洋真菌Aspergillus jenseniSS5；化学成分；细胞毒活性中图分类号：R284.1D01:10.16333/j.1001-6880.2023.11.008Chemical constituents of marine fungus Aspergillus jenseni SS5文献标识码：AHU Jig-yaol-,YUAN Rui-ying*,WANG Cuang-ming,文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)11-190 2-0 50.2CAI Shi-qi?,ZHOU Ming-qi?,WANG Fu-qian3*,CAI You-sheng Medical College,Tibet University,Lhasa 850012,China;2 School of Pharmaceutical Sciences,Wuhan University,Wuhan 430071,China;3 Department of Pharmacy,Wuhan No.1 Hospital,Wuhan 430022,ChinaAbstract:Four natural products were isolated from the fermentation extract of the marine fungus Aspergillus jenseni SS5 usingvarious column chromatographic separation techniques,and their structures were identified as epigriseofulvin(1),sterigmato-cystin(2),brevianamide M(3),and meleagrin(4)by NMR,HR-ESI-MS and X single-crystal dffraction.Compounds 1-3were obtained for the first time,and all the compound were tested for in vitro cytotoxicity by SRB assay.The results of cytotox-ic activity test showed that compound 4 had inhibitory effect on human lung cancer A549 and human liver cancer Bel-7402,and compound 2 had inhibitory effect on A549.The study of the chemical composition of the marine fungus A.jensenii SS5 hassome guiding significance,and two compounds were found to have good cytotoxic activity,which provides some theoretical ba-sis for the development of active natural products of marine fungi of the genus Aspergillus.Key words:marine fungus Aspergillus jenseni SS5;chemical constituents;cytotoxicity海洋是地球上最大的表面资源,其中存在着巨大的生物多样性,是天然产物的重要来源之一。尤其是其中多种多样的海洋微生物,在很大程度上还未被开发。海洋真菌在极端的生存环境下,有着独特的代谢方式与途径，生存繁殖方式、适应机制,从收稿日期：2 0 2 3-0 3-2 8基金项目：科技部重点研发项目（2 0 18 YFC0311000）；湖北省自然科学基金面上项目（2 0 2 0 CFB726，2 0 2 1CFB347）；武汉市卫健委医学科研项目（WX20A14）*通信作者Tel:86-018986136008;E-mail:，2017103060019 而产生结构新颖、具有多种生物活性的次级代谢产物,引起国内外科学家的密切关注1,2 ，成为当前最具开发前景的海洋天然产物新药源，也是研发新型先导化合物的热点之一3曲霉属广泛分布于陆地和海洋环境中,海洋曲霉已证实具有产生大量结构多样次级代谢物的能接受日期:2 0 2 3-0 7-0 5力。1992 年Numata等4 报道了首个海洋曲霉来源的天然产物,揭开了海洋曲霉次级代谢产物研究的篇章。截至2 0 18 年,研究报道的海洋曲霉来源的新天然产物数量已经超过了97 9个，包括聚酮类、生物Vol.35碱类、类、大环内酯、酰胺类、笛体类、卤代物类、肽类等多种类型,这一系列海洋真菌次级代谢产物具有抗肿瘤、抗病毒、清除自由基、抗氧化、神经保护、抗炎、抗心脑血管等疾病、抑菌和抗虫等多种生物活性5.6 。例如，从海洋真菌Aspergllus niger发酵产物中提取得到了化合物 aurasperone H,对人急性早幼粒白血病细胞 HL-60 具有显著的细胞毒性7 。海洋真菌AspergillusjenseniLW128发酵粗提取物中获得的二苯醚类化合物diorcinol D具有良好的抗菌活性 。有必要进一步对罕见的海洋曲霉属真菌进行深人研究，充分发掘其生物合成潜力，以获得更多可以开发为前体药物的天然产物。因此本实验以一种从中国南海海洋沉积物中分离获得海洋真菌As-pergllus jenseni SS5 为研究对象,对其发酵产物进行化学成分鉴定,以期获得具有显著细胞毒活性的次级代谢产物，为小分子癌症治疗药物设计提供新思路。1材料与方法1.1 仪器与材料BrukerAVANCE400和6 0 0 超导核磁共振仪；LC3000高效液相色谱仪（瑞亿斯公司）；SB-2000旋转蒸发仪器（上海艾朗仪器有限公司）。提取分离所用分析纯试剂丙酮、醋酸乙酯、甲醇、石油醚等（湖北申试化工科技有限公司）；色谱级甲醇（湖北弗顿科学技术有限公司）。人肺癌A549和人肝癌Bel-7402均购自美国模式培养物集存库（ATCC）;5-氟尿嘧啶（5-FU）（纯度99%，批号F6627,Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司）。1.22菌种来源本实验所使用的真菌菌株是从中国南海海洋沉积物中分离获得,编号SS5,菌株由武汉大学药学院洪葵教授课题组鉴定。根据测序结果构建系统发育树,菌株SS5与Aspergillus jensenii NRRL58600亲缘关系最近,比对结果中其序列相似度为99.2 8%,结合形态学分析,初步判断菌株 SS5 为曲霉属真菌 A.jenseni。1.3菌种的发酵与分离提取将2 6 下静置培养30 d后的液体发酵的菌丝体破碎,丙酮超声提取3次，每次2 0 min，浓缩提取液,和培养液混合,浓缩后用醋酸乙酯萃取3次,浓缩得到浸膏（32.0 g）。浸膏经正相硅胶柱色谱分离,石油醚-醋酸乙酯(2 0:1、10:1、5:1、2:1、1:2）梯度洗脱,得到9个部分AI。组分B(1.5g)用正相胡靖瑶等：海洋真菌Aspergillus jenseniSS5中化学成分研究1903硅胶柱色谱分离,石油醚-醋酸乙酯（5:1、2:1、1:2)梯度洗脱后,得到4组分B1B4。B3（2 98 m g）组分进一步采用Sephadex LH-20柱色谱（二氯甲烷-甲醇1:1）分离，得到7 个组分B3aB3g。B3d（34mg)通过半制备HPLC分离纯化(6 0%甲醇,体积流量3mL/min,254nm），得到化合物1(6 mg,t=15.6min)2(8 mg,tR=26.1 min)。组分E(3.1 g)经正相硅胶柱色谱分离,用二氯甲烷-甲醇(50:11:1)梯度洗脱后,得到6 个组分,即E1E6。E2（18 4mg)经 Sephadex LH-20 柱色谱（甲醇）分离得到 E2a(31 mg)、E2 b(2 2 m g)、E2 c(39 m g)、E2 d(19mg）、E2 e(6 1 m g）。E2 b 经半制备HPLC分离（40%80%甲醇，体积流量3mL/min,254nm）得到化合物3(6 mg,tr=15.3min)。G 部分(8.3g)经Seph-adex LH-20柱色谱（二氯甲烷-甲醇1:1)分离,得到7 个组分 G1 G7。G 1(135 mg)经正相硅胶柱色谱分离,用石油醚-醋酸乙酯（10:1、5:1、2:1、1:1)梯度洗脱后,得到6 个组分 GlaG1f。G l c(15 m g)经半制备型HPLC分离（55%甲醇，体积流量3mL/min，254 nm)得到化合物4(2 mg,tr=25.6 min)。1.4化合物活性测试采用SRB法9,测试了化合物1 4化合物对人肺癌A549和人肝癌Bel-7402两种细胞的生长抑制作用,5-氟尿嘧啶（5-FU)为阳性对照,选用对数生长期细胞,胰酶消化后用含10%胎牛血清 RPMI1640培养基调整细胞浓度至2 10 4个细胞/mL,按照每孔190 L细胞悬液接种在96 孔培养板中,37、5%CO，培养2 4h。药物处理孔加人10 L样品溶液（终质量浓度化合物为5g/mL,混合物为50g/mL），阳性药物孔加人终质量浓度为5g/mL的5-FU进行处理;对照孔加人含等体积溶媒的培养基,37,5%CO,培养3d。弃去培养基,加入10 0L4预冷的50%三氯乙酸(TCA)固定细胞。先静置5min，然后再移至4放置1h。倒掉固定液，蒸馏水洗涤5次去除TCA,空气干燥1h。每孔加人0.4%SRB溶液8 0 L,室温染色30 min。弃染液，1%醋酸洗涤5次充分去除未结合的SRB,空气干燥。加人150 L10 mmol/L Tris-base(pH10.5)溶解,微型振荡器上振荡5 min。M 5酶标仪测定ODs510m值。根据公式：肿瘤细胞生长抑制率=（O D 对照OD药物）（OD对照OD空白）10 0%计算各化合物的细胞抑制率。19042结果2.1结构鉴定化合物1白色结晶（甲醇)；+80（c0.11,Me0H);HR-ESI-MS:m/z 353.0781 M +H)*,分子式为CizHizCIO;H NMR（6 0 0 M H z,CDCl,)8:6.13(1H,s,H-5),5.55(1H,$,H-3),4.03(3H,s,4-0Me),3.98(3H,s,6-0Me),3.62(3H,s,2-0Me),2.84(1H,ddd,J=13.4,4.7,6.7 Hz,H-6),3.03(1H,dd,J=16.7,13.4 Hz,H-5),2.43(1H,dd,J=16.7,4.7 Hz,H-5),0.96(3H,d,J=6.7 Hz,6-Me);13 C NMR(150 MHz,CDCl,)8:197.1(C-4),192.5(C-3),170.8(C-2),169.5(C-6),164.6(C-7a),157.8(C-4),105.0(C-3),104.9天然产物研究与开发(C-3a),97.2(C-7),90.8(C-1),89.5(C-5),57.0(4-0Me),56.7(2-0Me),56.4(6-0Me),40.0(C-5),36.4（C-6 ）,14.2（6-M e）。以上数据与文献10.11报道一致，故鉴定化合物1为epigriseoful-vin。对获得的化合物1单晶进行了X射线衍射实验(见图1),进一步确证了化合物结构。单晶数据如下：四方晶系，晶系空间群P41,=0.89546（5A,b=0.895 46(5)A,c=1.981 71(11)A,V=1.5890(2)A3,Z=4,T=170 K,(Mo K)=0.272 mm,Peale=1.475g/cm,反射收集18 538(4.548 2 0 52.818）,独立衍射点317 3（Rint=0.0495,Rsigma=0.0337）,最终计算得到R,=0.0353（I 2(1)和wR,=0.0828,Flack参数=0.0 3(3)。Vol.350602C1C2C1503C7C8C504C401C1705C9C12C13C10C11图1化合物1的X射线晶体结构Fig,1 X-ray crystal structure of compound 1化合物2 浅黄色无定形固体；331（c0.11,(CH,),CO);HR-ESI-MS:m/z 325.070 1 M+H*,分子式为CisH/zO;H NMR(600MHz,CDCl,)8:13.23(1H,s,0H-3),7.50(1H,d,J=8.3Hz,H-5),6.83(1H,d,J=8.3 Hz,H-6),6.81(1H,m,H-14),6.74(1H,dd,J=8.3 Hz,H-4),6.51(1H,t,J=2.4 Hz,H-17),6.44(1H,s,H-11),5.45(1H,t,J=2.4 Hz,H-16),4.81(1H,dt,J=7.2,2.0 Hz,H-15),4.00(3H,s,H-18);3 C NMR(100MHz,CDCl,)8:181.5(C-1),109.1(C-2),162.4(C-3),111.4(C-4),135.8(C-5),106.6(C-6),155.1(C-7),154.2(C-8),106.6(C-9),164.7(C-10),90.6(C-11),163.4(C-12),106.0(C-13),113.3(C-14),48.2(C-15),102.6(C-16),145.5(C-17),56.9（C-18)。以上数据与文献2.3 报道一致,故鉴定化合物 2 为 sterigmatocystin。化合物3无色块状结晶（甲醇);5142(c 0.13,(CH,),CO);HR-ESI-MS:m/z 322.118 2M+H*,分子式为CisHisN,O,;H NMR（40 0MHz,CDCl,)8:8.40(1H,d,J=8.1 Hz,H-9),7.88(1H,d,J=8.1 Hz,H-6),7.75(1H,t,J=8.1 Hz,H-7),7.61(1H,d,J=7.4 Hz,H-17),7.61(1H,d,J=7.4 Hz,H-21),7.45(1H,t,J=8.1 Hz,H-8),7.26(1H,t,J=7.4 Hz,H-18),7.26(1H,t,J=7.4 Hz,H-20),7.20(1H,t,J=7.4 Hz,H-19),6.40(1H,d,J=4.9 Hz,H-2),5.93(1H,dd,J=9.1,6.2 Hz,H-13),4.09(1H,dd,J=13.3,9.1Hz,H-15),3.83(1H,dd,J=13.3,6.2 Hz,H-15);13C NMR(100 MHz,CDCl,）8:7 5.5(C-2),149.2(C-3),146.3(C-5),127.5(C-6),134.7(C-7),126.8(C-8),126.5(C-9),120.1(C-10),160.0(C-11),57.0(C-13),169.6(C-14),129.3(C-17),128.1(C-18）,12 6.6（C-19),12 8.1（C-2 0),12 9.3（C-2 1）。以上数据与文献14 报道一致,故鉴定化合物 3 为 brevianamide M。化合物4黄色无定形粉末；599（c0.05,Me0H);HR-ESI-MS:m/z 434.181 6 M +H+,分子式为CzH2N,04;HNMR（40 0 M H z,CD,OD)8:8.32(1H,s,H-15),7.82(1H,s,H-18),Vol.357.62(1H,d,J=7.7 Hz,H-4),7.38(1H,s,H-20),7.29(1H,t,J=7.7 Hz,H-6),7.09(1H,t,J=7.7Hz,H-5),7.02(1H,d,J=7.7 Hz,H-7),5.41(1H,s,H-8),5.06(2H,m,H-23),3.77(3H,$,1-0Me),1.32(3H,s,H-24),1.32(3H,s,H-25);13 C NMR(100 MHz,CD,OD)8:101.7(C-2),52.6(C-3),127.0(C-3a),124.6(C-4),123.1(C-5),128.0(C-胡靖瑶等：海洋真菌Aspergillus jenseniSS5中化学成分研究19056),111.5(C-7),146.7(C-7a),109.2(C-8),142.9(C-9),159.4(C-10),124.5(C-12),165.6(C-13),107.7(C-15),125.9(C-16),136.5(C-18),42.1(C-21）,112.3（C-2 3）,6 4.2（N-0 M e）。以上数据与文献15.16 报道一致，故鉴定化合物4为meleagrin。化合物1 4的化学结构如图2。OHMeoHCIOH12图2 代化合物1 4的化学结构Fig.2 Chemical structures of compounds 1-42.2肿瘤细胞毒活性活性测试结果表明（见表1），海洋真菌A.jensenii SS5中的化合物4对A549人肺癌细胞株和Bel-7402人肝癌细胞株均有较好的抑制作用,在5g/mL浓度下，初筛抑制率分别为41.2 3%、42.23%（阳性对照5-氟尿嘧啶对两株肿瘤细胞抑制率分别为47.45%、7 2.99%）；化合物2 对A549人肺癌细胞株的初筛抑制率为47.34%。化合物1和3在初筛浓度下对这两种细胞无明显细胞毒活性。表1化合物1 4的癌细胞生长抑制活性Table 1Inhibitory activity of compound 1-4 on cancer cell growth化合物Compound12345-FU注：“”表示无明显生长抑制活性。Note:“-indicates no significant growth inhibitory activity.3讨论与结论从海洋真菌A.jenseni SS5的粗提取物中分离得到四个化合物：epigriseofulvin（1）、s t e r i g ma t o c y s t i n（2）、b r e v i a n a mi d e M(3）、me l e a g r i n(4）,其中化合物13是首次从海洋A.jenseni中分离得到,极大地丰富了曲霉属真菌A.jenseni次生代谢产物结构的多样性。大量的研究结果已经证明,海洋曲霉属真O肿瘤细胞生长抑制率Inhibition rate on tumor cell growthA549Bel-740247.34%41.23%47.45%HOH3菌是多种具有丰富生物活性的次级代谢产物的重要来源,许多海洋曲霉来源的新天然产物具有较好的抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性,因此本文对4 种化合物的细胞毒性进行了测试,结果表明化合物4可以有效抑制人肺癌A549细胞和人肝癌Bel-7402细胞，化合物2 对A549人肺癌细胞株有较好抑制作用,这两种化合物有望作为抗癌前体药物进行深人研究,本研究也为天然活性化合物的开发提供了一定的理论依据。参考文献1 Huang RH,Han XB,Liu J,et al.Research progress on sec-ondary metabolites with anti-phytopathogenic activities of ma-rine-derived Aspergillus sp.and Trichoderma sp.J.Jiang-su Agric Sci(江苏农业学报）,2 0 2 0,36:1332-1341.2Zhao CY,Zhu TH,Zhu WM.New marine natural products ofmicrobial origin from 2010 to 2013 J.Chin J Org Chem(有机化学）,2 0 13,33：1195-12 34.3Fu YQ,Yu YM,Ma RY,et al.Advances in research on ma-42.23%rine fungi bioactive substances J.Shandong Chem Ind(山72.99%东化工）,2 0 19,48:6 3-6 5.4Numata A,Takahashi C,Matsushita T,et al.Fumiquinazo-lines,novel metabolites of a fungus isolated from a saltfishJ.Tetrahedron Lett,1992,33:1621-1624.5Jin LM,Xu X,Bao YC.New research progress on antitumornatural products from marine-derived fungi J.Nat Prod ResDev（天然产物研究与开发）,2 0 17,2 9:152-158.6Guo L,Wang C,Guo JC,et al.Identification of marine-de-rived Aspergillus tubingensis LWG-42 and isolation of its an-tioxidant active compoundsJ.J Microbiol（微生物学杂41906志),2 0 17,37:30-35.7Li DH,Han T,Guan LP,et al.New naphthopyrones from ma-rine-derived fungus Aspergillus niger 2HL-M-8 and their invitro antiproliferative activity J.Nat Prod Res,2016,30:1116-1122.8Zhang JX,Duan YY,Bi HK,et al.Secondary metabolites ofthe marine-derived Aspergillus jenseni LW128 and the anti-bacterial activityJ.A c t a M ic r o b io l Sin（微生物学报），2023,63:419-429.9Jiang N,Song CW,Wei LK,et al.Inhibition effect of ethanolextract from Eupatorium fortunei Turcz on human colon canc-er RKO cells proliferation in vitro J.Chin J Ethnomed Eth-nopharm（中国民族民间医药），2 0 18,2 7:32-35.10 Wu HH,Tian L,Sha Y,et al.Griseofulvin constituents frommarine fungus Y26-02J.J Shenyang Pharm Univ(沈阳药科大学学报）,2 0 10,2 7:2 8 2-2 8 5.11 Brossi A,Baumann M,Burkhardt F.Griseofulvin.V.Syn-theseversuche in der griseofulvinreihe J.Helv Chim Acta,天然产物研究与开发1962,45:1292-1297.12 Liu XB,Zheng N,Liang LQ,et al.Secondary metabolitesfrom the endophytic fungus Fusarium equiseti and their anti-bacterial activities J.Chem Nat Compd,2019,55:1141-1144.13 Zhu F,Lin Y.Three xanthones from a marine-derived man-grove endophytic fungus J.Chem Nat Compd,2007,43:132-135.14 Li GY,Yang T,Luo YG,et al.Brevianamide J,a new indolealkaloid dimer from fungus Aspergillus versicolor J.OrgLett,2009,11:3714-3717.15 Shang Z,Li XM,Meng L,et al.Chemical profile of the sec-ondary metabolites produced by a deep-sea sediment-derivedfungus Penicillium commune SD-118 J.Chin J OceanolLimnol,2012,30:305-314.16 Zheng CJ,Sohn M,Lee S,et al.Meleagrin,a new fabI inhibi-tor from Penicllium chryosogenum with at least one addition-al mode of action J.PLoS One,2013,8:e78922.Vol.35