汉黄芩素促进自身免疫性肝炎模型大鼠Th17_Treg细胞平衡.pdf

年 月第 卷 第 期基础医学与临床 收稿日期：修回日期：通信作者（）：文章编号：（）研究论文汉黄芩素促进自身免疫性肝炎模型大鼠 细胞平衡邓 娟，王秀芳，孙瑞青空军军医大学第一附属医院 消化内科，陕西 西安 摘要：目的 探讨汉黄芩素（）对自身免疫性肝炎（）大鼠 细胞平衡的影响。方法 随机选出 只大鼠作为对照组，其余大鼠通过尾静脉注射伴刀豆球蛋白（，）溶液构建 模型大鼠。将造模成功大鼠随机平分为 组、组（）、组（）、组（）、组 信号通路激活剂丙戊酸（），每组 只，每天给药 次，持续 。检测血清中炎性因子及肝功能指标；染色观察肝脏组织病理形态；流式细胞测量术检测脾脏 细胞水平；检测脾脏类视黄酸相关孤儿受体（）、叉头框蛋白（）以及肝组织 信号通路蛋白质的表达。结果对照组大鼠肝组织结构正常，染色清晰；组大鼠肝组织细胞出现水肿，细胞体积增大导致肝窦受压变窄，出现大量炎性细胞浸润以及少量坏死现象。组较对照组丙氨酸氨基转移酶（）、天门冬氨酸氨基转移酶（）活性、白介素（）和 含量、细胞水平、家族 转录因子（）、含 基序的 转录因子 相关家族（）蛋白表达均显著上升（），和 含量、细胞水平、蛋白水平均显著下降（）；与 组相比，组、组、组肝损伤情况得到改善，、活性、和 含量、细胞水平、蛋白表达均显著降低（），和 含量、细胞水平、蛋白水平均显著升高（）；逆转了 对 大鼠的改善效果。结论 可能通过下调 信号通路促进 大鼠 细胞平衡。关键词：汉黄芩素；信号通路；自身免疫性肝炎；细胞中图分类号：文献标志码：，：（）（）（，），（），（），（），（），；基础医学与临床 （）（），（）；，（），（），（），（）（）（），（）；，（），（）；：；自身免疫性肝炎（，）是一种复杂的免疫介导的肝病，患者大多数需要终身治疗，以防止肝硬化和终末期肝病的发展。目前，关于 的治疗主要以糖皮质激素和硫唑嘌呤治疗，但治疗效果有限。汉黄芩素（，）是一种黄酮类物质，是从黄芩根（）中分离得到的天然成分，是一种常用的用于过敏和癌辅助治疗的药材。的抗氧化作用已在多种疾病中得到证实，特别是与炎性反应有关的疾病，如非酒精性脂肪性肝炎。不仅能够激活小鼠肝细胞（）中转录因子（，）成纤维细胞生长因子（，）表达，改善代谢性疾病，还能通过核因子 相关因子（，）介导的核转录因子（，）信号缓解脓毒症肝损伤。与自身免疫紊乱直接相关，辅助性 细胞（）和调节性 细胞（）失衡会导致免疫系统紊乱促进 的发生。信号的持续失调会促进肝脏炎性反应和肿瘤发展产生。下调 信号轴会促进肝卵圆细胞分化为肝细胞进而缓解肝损伤。本研究旨在探究 对 大鼠 细胞平衡和 信号通路的影响。材料与方法 材料 动物：级雄性 大鼠（）贵州医科大学实验动物中心，生产许可证号：（黔）。本研究已获得本院动物伦理委员会的批准。试剂及试剂盒：汉黄芩素（）（北京伊塔生物科技有限公司）；伴刀豆球蛋白（，上海源叶生物科技有限公司）；信号通路激活剂丙戊酸（，）（北京百奥莱博科技有限公司）；丙氨酸氨基转移酶（，）试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶（，）试剂盒和肿瘤坏死因子（，）试剂盒博辉生物科技（广州）有限公司；白介素（，）试剂盒、白介素（，）试剂盒和白介素（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；、抗体、抗类视黄酸相关孤儿受体（，）、叉头框蛋白（，）、家族 转录因子 （，）和含 基序的 转录因子 相关家族（，）抗体（公司）。方法 大鼠的分组及处理：随机选择 只大鼠作为对照组，其余大鼠参考先前文献，通过尾静脉注射 溶液 ，每周 次，连续注射邓娟 汉黄芩素促进自身免疫性肝炎模型大鼠 细胞平衡 周，构建 大鼠模型。随机选择 只大鼠根据 染色情况判断造模是否成功，将造模成功大鼠随机分为 组、组、组、组和丙戊酸（）组，每组 只。组、组、组 分 别 腹 腔 注 射 、，每天 次，持续 。组在注 射 （）的 基 础 上，随 后，注 射 ，每天 次，持续 。组和对照组给予等量 氯化钠溶液。采集标本：药物治疗结束第 天，通过腹主动脉采血 ，经 离心 后取上清液，置于 保存以备后续 检测。麻醉后处死大鼠，分离肝脏和脾脏组织，一部分肝脏组织固定于 多聚甲醛中用于 染色和免疫组化，剩下的肝脏组织和脾脏组织储存于 中用于 和流式细胞测量术。检测血清中炎性因子及肝功能：取上述保存的血清，参照 试剂盒步骤检测大鼠血清中肝功能指标（和）以及炎性因子（、和）水平。染色观察肝脏组织形态：取 多聚甲醛溶液中固定的肝脏组织，经过水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋后切成 薄片，随后将切片置于烤箱，脱蜡、脱水后，用苏木精和伊红染色，在光学显微镜下观察肝脏组织形态。流式细胞测量术检测脾脏 细胞水平：分离脾脏组织的淋巴细胞，加入缓冲液细胞悬浮液，使每孔细胞浓度稀释到 细胞，与、避光孵育 ，用流式细胞仪检测 细胞数量，另外与、避光孵育 ，检测 细胞数量。检测脾脏、以及肝组织 信号通路蛋白表达 取 保存的肝脏和脾脏组织，分别加入 裂解缓冲液后提取总蛋白，将蛋白质进行定量、电泳、转膜，将膜于室温封闭 后分别加入一抗：抗（）、（）、（）、（）、（）和 抗体（），于 孵育一夜，加入 标记的山羊抗兔二抗（），室温孵育 ，加入 试剂使蛋白条带显影后。使用 软件分析蛋白的吸光度值。统计学分析用 软件进行统计分析，计量资料用平均值标准差（）表示，所有数据经过方差齐性和正态性检验，多组间比较采用单因素方差分析。结果 对大鼠血清、活性的影响与对照组相比，组大鼠、活性显著上升（）；与 组相比，组、组、组大鼠、活性依次显著降低（）；与 组相比，组大鼠、活性显著增加（）（表）。表 对大鼠血清、活性的影响 （，）（）（）（）；对大鼠血清炎性因子的影响与对照组相比，组大鼠 和 含量显著上升（），和 含量显著下降（）；与 组相比，组、组、组 大 鼠 和 水 平 显 著 降 低（），和 水 平 显 著 上 升（）；与 组相比，组大鼠 和 含量显著增加（），和 含量显著减少（）（表）。对大鼠肝脏组织损伤的影响对照组大鼠肝组织结构正常，染色清晰；组大鼠肝组织细胞出现水肿，细胞体积增大导致肝窦受压变窄，出现炎性细胞浸润及少量细胞坏死现象。组、组、组改善了以上现象；组与 组结构相似（图）。基础医学与临床 （）表 对大鼠血清炎性因子的影响 （，）（）（）（）；图 染色检测肝脏组织病理变化 （）对大鼠脾脏 细胞水平的影响与对照组相比，组大鼠 细胞水平、均显著上升（），细胞水平显著下降（）；与 组相比，组、组、组大鼠 细胞水平以及 依次显著降低（），细胞水平显著上升（）；与 组相比，组大鼠 细胞水平、比例显著增加（），细胞水平显著减小（）（表）。对大鼠脾脏中、水平的影响与对照组相比，组大鼠 水平显著上表 对大鼠脾脏 细胞水平的影响 （，）（）（）（）；邓娟 汉黄芩素促进自身免疫性肝炎模型大鼠 细胞平衡升（），水平显著下降（）；与 组相比，组、组、组大鼠 水平依次显著下降（），水平依次显著升高（）；与 组相比，组大鼠 水平显著增加（），水平显著减少（）（图）。对大鼠肝组织 信号通路蛋白表达的影响与对照组相比，组大鼠、蛋白表达均显著上调（）；与 组相比，组、组、组大鼠、蛋白表达依次显著降低（）；与 组相比，组大鼠、蛋白表达显著增加（）（图）。讨论 是一种病因不明的慢性进行性肝病，全球 患病率呈上升趋势，特别是在男性中。会导致肝硬化和相关并发症，甚至有发展为肝细胞癌的风险。因此，寻找 的潜在治疗药物极其重要。可通过调节肝星状细胞的活化和凋亡来减轻肝纤维化，成为治疗和预防肝慢性炎性的潜在药物。可以改善氧化应激和炎性反应，从而成为缓解败血症肝损伤的潜在治疗剂。本研究发现，组大鼠肝组织出现明显的病理损伤，同时、活性升高，与既往研究一致，表明 大鼠造模成功；不同剂量 的干预不仅改善了肝脏病理损伤现象，还降低了、活性，表明 ；图 对大鼠肝中、水平的影响 （，）；图 对大鼠肝组织、蛋白表达的影响 ，（，）基础医学与临床 （）尤其是高剂量（）可减轻肝损伤，提示 可能是 的潜在治疗靶点。细胞在多种免疫性疾病中发挥促炎作用，而 细胞是维持免疫稳态和诱导免疫耐受的关 键 因 子，失 衡 促 进 了 的 发生。细胞可以通过产生促炎因子（、和），募集中性粒细胞，进而加重炎性反应；而 细胞可以通过产生抗炎因子（和），维持免疫稳态。与 分别是 细胞和 细胞的转录调控因子。本研究发现，可通过调节炎性因子水平促进 大鼠 平衡。激活会破坏肝脏稳态，加重小鼠肝纤维化。下调、表达可以抑制肝癌 的 发 展。下 调 信 号 轴 会 恢 复 平衡进而缓解大鼠自身免疫性葡萄膜炎。在本研究中，、蛋白高表达，与 相 关 报 道相 似，提 示 大 鼠 中 信号 通 路 处 于 激 活 状 态；而 治 疗 后、蛋白水平下降，提示 可通过下调 信号通路，促进 平衡，减轻 大鼠肝损伤。为了进一步证实此推测，在 治疗的基础上，注射 信号通路激活剂，结果发现 可消除 对 大鼠肝损伤的治疗作用。综上所述，可能通过下调 信号轴来维持 平衡，进而改善 大鼠肝脏损伤。且 治疗效果呈剂量依赖性。然而，是否可以通过调控其他通过起到同样缓解肝损伤的效果需要进一步探究。参考文献：，：，：，：，：，：，：高丽萍，毛小荣辅助性 细胞 调节性 细胞失衡在大鼠自身免疫性肝炎模型中的研究中国临床药理学杂志，：，：，：，：，：（），：邓娟 汉黄芩素促进自身免疫性肝炎模型大鼠 细胞平衡 ，：，（），：，：，：，：，：冯锦 介导的 信号通路对自身免疫性肝炎模型小鼠巨噬细胞的免疫调节及机制的研究免疫学杂志，：