黑木耳胶原蛋白酶法提取及分离纯化研究.pdf

562023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究收稿日期：2023-01-11 基金项目：黑龙江省自然科学基金联合引导项目（LH2020C078）；黑龙江省重点研发计划指导类项目（GZ20210166）；哈尔滨市科技计划自筹经费项目（ZC2022ZJ020002）；黑龙江东方学院科研项目（HDFKY200101）。作者简介：毕海鑫（1997-），女，硕士，研究方向：农产品资源开发与综合利用，E-mail：。*通信作者：那治国（1980-），男，博士，教授，研究方向：植物蛋白加工，E-mail：。黑木耳胶原蛋白酶法提取及分离纯化研究 毕海鑫1，林雨泽1，孟桥2，那治国2，*（1.黑龙江东方学院食品工程学院，哈尔滨 150066；2.哈尔滨商业大学食品工程学院，哈尔滨 150028）摘 要：为获得优质的黑木耳胶原蛋白，本研究通过单因素实验和响应面法对碱性蛋白酶法提取黑木耳胶原蛋白的工艺条件进行优化，并采用盐析、DEAE-52 离子交换层析、Sephadex G-75 凝胶过滤等方法对黑木耳胶原蛋白进行分离纯化。结果表明：在酶解温度 55、pH 8.5 条件下优化得到的黑木耳胶原蛋白最佳提取条件为：碱性蛋白酶（2240 IU/mg）添加量 7%、料液比 168 g/mL、酶解时间 2.0 h，此条件下，黑木耳胶原蛋白得率为 0.65%；最佳盐析条件为：4 mol/L NaCl、24 h、15 ；最佳 DEAE-52 分离条件为：洗脱时间160 min、上样浓度 300 g/mL、上样 pH 7.2、NaCl 洗脱浓度 0.2 mol/L；经 Sephadex G-75 凝胶过滤层析后胶原蛋白纯度可达到 72.6%，胶原蛋白回收率 74.3%。因此，碱性蛋白酶法及盐析、DEAE-52、Sephadex G-75层析可有效提取纯化黑木耳胶原蛋白，为黑木耳胶原蛋白的深入研究及应用开发提供了理论依据。关键词：黑木耳；胶原蛋白；碱性蛋白酶；分离纯化中图分类号：TS202.3/TS255.1 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2023）09-0056-10doi：10.19804/j.issn1006-2513.2023.09.008Optimization of enzymatic extraction，separation and purification of collagen from black fungusBI Haixin1，LIN Yuze1，MENG Qiao2，NA Zhiguo2，*（1.College of Food Engineering，East University of Heilongjiang，Harbin 150066；2.College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150028）Abstract：In order to obtain high quality collagen from black fungus，the extraction conditions of collagen by alkaline protease were optimized by single factor experiment and response surface method.The black fungus collagen was separated and purified by salting out，DEAE-52 ion exchange chromatography and Sephadex G-75 gel filtration.The results showed that the optimal extraction conditions were as follows：alkaline protease（2240 IU/mg）7%，solid-liquid ratio 168 g/mL，and enzymatic hydrolysis time 2.0 h.Under these conditions，the yield of collagen was 0.65%.The optimal salting-out conditions were as follows：4 mol/L NaCl for 24 h at 15.The optimal DEAE-52 separation conditions were as follows：elution time 160 min，loading concentration 300 g/mL，loading pH 7.2，and NaCl elution concentration 0.2 mol/L.Being purified with Sephadex G-75 gel filtration chromatography，the purity of collagen was 72.6%and the recovery of collagen was 74.3%.Therefore，the alkaline protease method and salting out，572023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究DEAE-52 and Sephadex G-75 chromatography could effectively extract and purify the collagen from black fungus.The study provides theoretical basis for the further study and application of the collagen from black fungus.Key words：black fungus；collagen protein；alkaline protease；separation and purification黑木耳（Auricularia auricula）又名木耳、桑耳等，属木耳科类，由菌丝体和子实体两部分组成，多数单片子实体呈现叶磷片状及人耳形状，外缘近似波浪，表面呈光滑的褶皱，颜色为深褐色，厚度约 2 mm、宽度约 3-5 cm，其品种及产地不同，宽度长短不一，最宽可达 12 cm1。黑木耳作为重要的食用菌属之一，富含多糖、多酚等活性成分及丰富的铁元素，具有降血脂、降血糖，抗凝血、抗氧化等保健功能及药用价值。黑木耳还含有丰富的蛋白质，含量为 10.016.2 g/100 g2，是优质的蛋白质来源。蛋白水解后可产生多种生物活性肽，如黑木耳活性肽与钙的螯合物可以有效降低骨质疏松的风险3。根据黑木耳生长周期短、资源丰富和安全性高等特点，已有少数研究者从黑木耳中提取出安全优质的食用蛋白质。此外，黑木耳质地为胶质，带有弹性，复水及保水能力良好，这些特性与其蛋白类型和结构密切相关4，如：研究发现黑木耳二级结构存在三重螺旋结构，且部分亚基分子量高于 100 kDa5。而胶原蛋白作为基本的细胞外蛋白，是蛋白质的分支，其氨基酸占比最大，涵盖 18 种氨基酸6。哺乳动物及骨骼、海洋生物等均是天然胶原蛋白肽的重要来源7，然而近年来，由于某些动物易患疾病和水体污染物超标等影响，加之部分人群的宗教信仰问题8-9，使胶原蛋发展受限。因此，国内外部分学者逐渐将研究方向转为植物胶原蛋白，但当前，关于黑木耳蛋白质提取的研究已存在，有关黑木耳胶原蛋白的提取及分离纯化的研究却鲜见。本研究以黑木耳粗蛋白为原料，采用碱性蛋白酶法提取黑木耳胶原蛋白，在酶法提取胶原蛋白过程中，胶原肽链之间的共价键主要由末端肽与胶原相互作用分解而成，末端肽与碱性蛋白酶反应后，酶通过增加醋酸介质中胶原的增溶来提高提取效率10，该法不仅对胶原的三重螺旋结构无干扰、能够维持胶原蛋白的稳定性，还可能降低胶原的抗原性。胶原蛋白的纯化方式有盐析、透析、离子交换色谱、凝胶过滤色谱等11，根据溶解度及分子量等差异，通常采用两种或两种以上方法使胶原蛋白达到所需纯度。因此，基于上述碱性蛋白酶法提取黑木耳胶原蛋白，并进行响应面优化后，通过盐析、DEAE-52 弱阴离子交换层析、Sephadex-G75 凝胶层析，提高黑木耳胶原蛋白纯度，以扩展胶原蛋白的来源，为开发更为安全的胶原蛋白及黑木耳胶原蛋白的深入研究提供科学依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂黑木耳：市购，产自黑龙江省伊春市；牛血清蛋白（标准品）：美国 Sigma-Aldrich 公司；纤维素酶（50 U/mg）、木聚糖酶（100 U/mg）：上海蓝季科技有限公司；碱性蛋白酶（2240 IU/mg）：Novozymes 公 司；DEAE-52 纤 维 素：Pharmacia 公 司；透 析 袋、Sephadex G-75：长春赛奥克生物科技公司；羟脯胺酸标准品（纯度 99%）：北京首化生物科技公司；氯胺 T、氢氧化钠、乙醇、盐酸、高氯酸等分析纯试剂：天津大陆化学试剂厂。1.2 仪器与设备KQ-500 VDE 双频数控超声波清洗器：昆山超声仪器公司；常压恒温烘箱：吴江欧博电热设备公司；pH 计：上海精科仪器公司；W177 中草药粉碎机：天津泰斯特仪器公司；HWS-26 电热恒温水浴锅：南京桑力电子设备厂；UV-5200紫外可见分光光度计：上海元析仪器公司；层析柱（28 mm80 cm）：上海宸桥生物科技公司；TG16-WS 台式高速离心机：上海分析仪器厂；Bio 冷冻干燥机：Agilent 公司；HL-2D 恒流泵：上海驰唐电子公司。1.3 实验方法1.3.1 黑木耳蛋白质的提取参照实验室前期研究结果，采用酶水解-超声波碱法12。将黑木耳清洗、干燥、粉碎后过582023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究孔径 0.180 mm 筛，称量黑木耳粉 2 g，加入一定量去离子水充分混匀，导入胶体磨中，开机循环5 min，在 20 MPa 下均质 10 min，然后加入 0.8%混合酶（木聚糖酶和纤维素酶质量比例为 11），在温度 50 的条件下酶解 2 h，再于 90 灭酶15 min。调整酶解液的 pH 值至 4，并在 250 W、49 的条件下采用超声波提取 40 min 后，以4000 r/min 离心 10 min，收集上清液，得黑木耳蛋白提取液，冷冻干燥后得到黑木耳粗蛋白。1.3.2 黑木耳胶原蛋白的提取及工艺优化以黑木耳粗蛋白为原料，采用碱性蛋白酶法进一步提取黑木耳胶原蛋白。1.3.2.1 提取工艺的单因素实验设计 在酶解温度55、酶解 pH 8.5 的条件下，分别考察料液比、酶解时间以及酶添加量对胶原蛋白得率的影响。固定提取条件为：料液比 160 g/mL、酶解时间2 h、酶添加量 7%；设计各单因素条件为：料液比 140、150、160、170、180 g/mL、酶解时间 1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、酶添加量5%、6%、7%、8%、9%，进行黑木耳胶原蛋白的提取，测定胶原蛋白得率。1.3.2.2 提取工艺的响应面优化设计 根据单因素实验结果，料液比、超声温度和超声时间对胶原蛋白得率具有显著影响（P0.05）。在此基础上，采用 Box-Benhnken 中心组合设计实验，以黑木耳胶原蛋白得率为响应值，进行 3 因素 3 水平的响应面分析，确定黑木耳胶原蛋白最优提取条件，设计因素及水平见表 1。表 1 响应面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments水平A 料液比/（g/mL）B 酶解时间/hC 酶添加量/%-11501.5601602711702.581.3.3 黑木耳胶原蛋白得率测定羟脯胺酸（HYP）作为胶原蛋白的主要成分，是胶原蛋白的特征性氨基酸，其含量变化反映胶原含量的变化13。1.3.3.1 羟脯胺酸标准曲线 分别取 4 mL 浓度为 0.5 g/mL、1.0 g/mL、1.5 g/mL、2.0 g/mL的羟脯氨酸标准溶液于比色管中，以蒸馏水作空白对照，加 2.0 mL 氯胺 T，静置 20 min，加入2.0 mL 显色剂，封盖，60 水浴 20 min 后冷却 5 min，取出，放置 30 min。在 560 nm 波长下测定吸光度。以羟脯胺酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。羟脯胺酸标准曲线的回归方程为 y=0.236x+0.003，R2=0.999。1.3.3.2 胶原蛋白得率测定 参照 AOAC 方法14，测定样品的羟脯胺酸含量，胶原蛋白得率可根据转换系数计算得出。胶原蛋白得率计算公式 如下：胶原蛋白得率（%）=100%CVKNM式中：C羟脯氨酸质量浓度，g/L；V上清液体积，L；K稀释倍数；M黑木耳质量，g；N换算系数 9.75。1.3.4 黑木耳胶原蛋白的分离纯化采用碱性蛋白酶法，在最优提取条件下获得黑木耳胶原蛋白，对黑木耳胶原蛋白进行盐析，分别考察不同浓度、温度及时间对盐析效果的影响；选用 DEAE-（cellulose）52 弱碱性阴离子交换树脂进行层析分离，确定最佳层析条件（洗脱时间、洗脱盐浓度、上样量以及上样 pH）；再经 Sephadex G-75 葡聚糖凝胶过滤层析，得到纯度较高的黑木耳胶原蛋白。1.3.4.1 盐析条件的优化 采用氯化钠进行盐析，该方法更加符合食品卫生领域的应用，可以将水相与有机相分离，促进目标分析物与有机相的融合，获得较高提取率并减少样品中杂质的析出15。在黑木耳胶原蛋白提取液中加入一定量的氯化钠，将其浓度调至 0.9 mol/L，以胶原蛋白回收率为评价指标，固定盐析条件为：NaCl 浓度 3 mol/L、温度 20、时间 24 h，研究 NaCl 浓度（1、2、3、4、5 mol/L）、盐析时间（8、16、24、32、40 h）及盐析温度（4、12、20、28、36）三个因素对胶原蛋白盐析效果的影响。胶原蛋白回收率计算公式如下：%100M%NKVC）胶原蛋白得率（%100%含量盐析前上清液胶原蛋白含量盐析后上清液胶原蛋白）胶原蛋白回收率（592023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究1.3.4.2 DEAE-52 层析分离 采用湿法装柱（20 mm600 mm），装柱时确保填料在柱中缓慢均匀下落，以避免产生气泡，完成后用蒸馏水平衡 24 h，备用；取黑木耳胶原蛋白溶液 10 mL，缓慢上样，并打开恒流泵；以 NaCl 为洗脱液，设置流速为 0.5 mL/min，在 220 nm 下测定吸收峰，根据洗脱曲线图接收样品，并将收集的样品溶液冻干16。在洗脱过程中，分别控制上样胶原蛋白浓度 300 g/mL、上样量 10 mL、洗脱时间 120 min、上样 pH7.2、洗脱盐浓度 0.3 mol/L，分别考察洗脱盐浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）、样品浓度（100、200、300、400、500 g/mL）、pH（5.6、6.4、7.2、8.0、8.8）以及洗脱时间（20200 min，每 20 min 测定一次）对黑木耳胶原蛋白回收率及纯度的影响。胶原蛋白纯度计算公式 如下：%100%胶原蛋白质量溶液体积胶原蛋白浓度）胶原蛋白纯度（1.3.4.3 Sephadex G-75 凝胶过滤层析 样品制备：称取一定量 1.3.4.2 中冻干后的黑木耳胶原蛋白样品加入适量蒸馏水溶解，4 保存备用；预处理：取 50 g 葡聚糖凝胶，加 5 倍蒸馏水充分混匀，置于沸水浴下 3 h，溶胀后冷却，再用蒸馏水水洗以除去杂胶，备用；装柱：进行湿法装柱17 （层析柱：2.6 cm20 cm），缓慢填入凝胶，待其完全沉降，当横截面明显时开泵，用蒸馏水洗脱 24 h 平衡；进样与洗脱：将一定浓度的样品缓慢倒入层析柱（上样量 1 mL），注意不要破坏柱体，开启恒流泵后进行梯度洗脱（洗脱流速 40 mL/h）；检测与接样：测量 220 nm 处的紫外吸收峰，通过吸收峰图变化趋势收集样品，冷冻干燥后，得到分离纯化的黑木耳胶原蛋白；凝胶的再生与保存：将用过的凝胶用蒸馏水反复冲洗，在100 水浴中浸泡 2 h，加入蒸馏水使其溶胀，弃去上清液，洗至无漂浮物，平衡 24 h。1.4 数据处理以上所有实验均重复测定三次，实验结果以三次数据的平均值 标准差（SD）表示。利用SPSS 24.0 进行显著性分析，并通过 Excel 2010 和 OriginPro 9.0 软件进行实验数据处理及绘图。2 结果与分析2.1 黑木耳胶原蛋白提取工艺的单因素实验2.1.1 酶添加量对黑木耳胶原蛋白得率的影响如图 1 所示，随着酶添加量的增长，黑木耳胶原蛋白得率呈先上升后下降趋势，在酶添加量为 7%时，胶原蛋白得率达到最高值。可能是因为随着酶量的增加，其与胶原蛋白的作用程度逐渐增强，水解度提高，使得二者反应逐渐趋向饱和；而当酶添加量继续加大，蛋白酶会抑制酶的催化能力，使底物反应受到抑制18，反而影响胶原蛋白得率，故选取 7%作为碱性蛋白酶的最适添加量。456789100.360.380.400.420.44得率/%酶添加量/%图 1 酶添加量对胶原蛋白得率的影响Figure 1 Effect of enzyme amount on the collagen yield2.1.2 料液比对黑木耳胶原蛋白得率的影响如图 2 所示，当料液比为 160 时，黑木耳胶原蛋白得率达到最大值 0.54%，随料液比的提高，其得率逐渐下降。可能存在两方面原因，一是当料液比从 140 到 160 时，酶能够充分与底物接触，使分子间溶胀效果增强，从而使黑木耳胶原蛋白得率增加，而随溶剂体积的增大，体系中的酶被过度稀释，不能与底物充分结合，胶原蛋白含量不足达到溶胀效果；二可能是由于黑木耳蛋白之间分子距离加大，降低了反应接触面积，导致得率下降。这与廖涛等19对鱼皮胶原蛋白的研究结果相似。602023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究1:301:401:501:601:701:801:900.400.450.500.55得率/%料液比/(g/mL)图 2 料液比对胶原蛋白得率的影响Figure 2 Effect of solid-liquid ratio on the collagen yield2.1.3 酶解时间对黑木耳胶原蛋白得率的影响 由图 3 可知，胶原蛋白得率与酶解时间呈正相关，在酶解 1-2 h 期间，胶原蛋白得率显著提高，酶解 2 h 之后得率上升缓慢。这是由于适当的延长酶解时间能够使酶的功能特性得到充分发挥，使胶原蛋白有效析出；而处理时间越久，得率变化幅度并不明显，可能出现逆反应或是由于2 h 后酶解反应基本结束20，时间的增加并不能有效提高得率。因此，考虑到节能高效的提取原则，确定 2 h 为最适酶解时间。0.51.01.52.02.53.03.50.350.400.450.50酶解时间/h得率/%图 3 酶解时间对胶原蛋白得率的影响Figure 3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the collagen yield2.2 黑木耳胶原蛋白提取工艺的响应面优化2.2.1 响应面优化试验结果在单因素实验结果的基础上，以胶原蛋白得率为响应值，以料液比（A）、酶解时间（B）、酶添加量（C）为自变量，进行三因素三水平的优化试验设计，各组试验方案及结果如表 2 所示。表 2 响应面优化试验设计及结果Table 2 Response surface design and the results试验号ABC胶原蛋白得率 Y/%10000.6821010.563-10-10.5141100.6150-1-10.53610-10.5570000.67801-10.5891-100.6010-1010.57110110.59120000.68130000.68140000.6715-1100.6216-1-100.56170-110.612.2.2 回归模型方差分析通过 Design-Expert 8.0 软件对表 2 中的数据进多元回归拟合分析，胶原蛋白得率回归方程为：Y=0.08A+0.52B+1.60C-3AB-3AC-0.037BC-4A2-0.025B2-0.291C2-97.92方差分析如表 3 所示，模型的 F 值为 95.40，P 值小于 0.0001，说明模型表现为极显著；失拟项的 P=0.25750.05，表明差异不显著，模拟程度良好。回归模型中，A、B、C、AC、AB、BC的影响均显著，三个因素对响应值影响的顺序依次为：CBA，即酶添加量酶解时间料液比，A2、B2、C2对黑木耳胶原蛋白得率影响极显著（P0.001）。决定系数 R2=0.9919，校正决定系数 R2adj=0.9815，表明响应值变化的 98.1%可用于解释该模型，且能较好反映各因素与响应值的关系，因此，该模型可对黑木耳胶原蛋白得率进行预测。612023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究表 3 回归方程系数及显著性检验Table 3 Regression equation coefficients and significance tests模型来源SSdfMSF 值P 值显著性模型0.04790.00526195.400.0001*A0.000364510.00036456.610.0370*B0.00117610.00117621.330.0024*C0.00241510.00241543.790.0003*AB0.000930210.000930216.870.0045*AC0.000552210.000552210.010.0158*BC0.00136910.00136924.820.0016*A20.01210.012221.80 0.000 1*B20.00255810.00255846.390.0003*C20.02210.022402.96 0.0001*残差0.000386070.00005515失拟项0.000231230.000077081.990.2575不显著纯误差0.000154840.00003870总离差0.04816注：*代表 0.05 水平显著；*代表 0.01 水平显著；*代表0.001 水平极显著。2.2.3 各因素交互作用分析各因素之间的交互作用可以用响应面的缓陡情况及等高线的椭圆程度显现21。响应面图坡度越陡，说明该因素对试验结果的影响越显著；反之，坡度越平缓，则说明该因素对结果的影响越小。等高线的形状可反映各交互项的强弱，等高线偏向椭圆表示交互作用较强22-24。各因素交互作用对黑木耳胶原蛋白得率影响的响应面及等高线如图 4 所示。由图 4 可知，各交互项响应面图均呈凸起，说明因素 A（料液比）、B（酶添加量）、C（酶解时间）两两之间交互时，均对黑木耳胶原蛋白得率存在一定影响。与 AB 和 AC 相比，BC 交互作用的响应曲面图坡度最陡，等高线接近椭圆的程度最明显，由此说明 BC 交互作用对胶原蛋白得率的影响最显著（P0.05），上述结果与方差分析结果一致。0.7（A）（B）（C）0.650.60.550.50.70.650.60.550.50.70.650.60.550.57.508.007.006.506.007.508.007.006.506.001:501:551:601:651:701:501:551:601:651:708.006.507.007.506.001.501.701.902.102.302.501.501.701.902.102.30C：酶解时间/hC：酶解时间/hC：酶解时间/hA：料液比/(g/mL)A：料液比/(g/mL)A：料液比/(g/mL)A：料液比/(g/mL)得率/%得率/%得率/%得率/%得率/%得率/%C：酶解时间/hB：酶添加量/%B：酶添加量/%B：酶添加量/%B：酶添加量/%2.501.501:501:551:601:651:706.006.507.007.508.001:501:551:605550.660.640.640.620.620.620.60.650.60.650.60.60.60.550.550.581:651:701.701.902.102.302.501.501.701.902.102.302.50（A）料液比与酶添加量的交互作用 （B）酶添加量与酶解时间的交互作用 （C）料液比与酶解时间的交互作用图 4 各因素交互作用的响应曲面图及等高线图Figure 4 The 3D contour plot of interactions among each factor622023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究2.2.4 最优提取工艺确定及验证实验经响应面优化分析后，得到黑木耳胶原蛋白最佳提取工艺参数为：料液比 167.65 g/mL、酶添加量 6.99%、酶解时间 2.03 h，理论最佳结果为0.65%。根据实验的可控性及预测实验条件的准确性，将黑木耳胶原蛋白的最佳提取条件修正为：168 g/mL、酶添加量 7%、酶解时间 2.0 h。为了检验响应面法得到的黑木耳胶原蛋白最佳提取工艺的可行性，在此最佳提取条件下进行三次平行实验，取平均值。黑木耳胶原蛋白实际得率为0.65%，与理论值吻合，由于实验系统误差的原因略小于响应面实验中的黑木耳胶原蛋白得率的最高值 0.68%，说明该模型拟合度较高，对黑木耳胶原蛋白提取具有一定实际应用价值。2.3 黑木耳胶原蛋白分离纯化结果分析2.3.1 NaCl 盐析条件的单因素实验2.3.1.1 盐析时间的确定 由图 5 可知，黑木耳胶原蛋白回收率随盐析时间的延长呈先上升后趋于稳定。盐析时间在 16-24 h 期间，胶原蛋白回收率大幅度增加，盐析时间超过 24 h 后，回收率变化迟缓。原因可能是氯化钠与胶原溶胀液接触时，胶原迅速析出并包裹氯化钠，且析出的胶原呈聚集状，当盐析时间较短时，反应向正方向进行；随盐析时间不断延长逐渐变成絮状，当胶原蛋白回收率升高至一定程度后，溶液中大部分胶原蛋白的浓度减少25，继续延长盐析时间对胶原蛋白回收率的提高无显著效果。因此，选取 24 h为最佳盐析时间。1020304030405060胶原蛋白回收率/%时间/h图 5 盐析时间的确定Figure 5 Determination of the salting out time2.3.1.2 盐浓度的确定 由图 6 可知，随 NaCl 浓度的增加，黑木耳胶原蛋白回收率呈先上升后下降的趋势。当 NaCl 浓度低于 4 mol/L 时回收率快速升高，NaCl 浓度为 4 mol/L 时回收率达到最高，随后开始下降。这是由于胶原的溶解度与溶液中离子强度密切相关，当 NaCl 浓度较低时，盐离子浓度也相对较小，胶原更容易析出，反应处于正方向；而 NaCl 浓度增加，盐离子浓度也随之升高，胶原析出缓慢，过高的盐离子浓度会在提取液中达到饱和26，不利于胶原蛋白的回收。同时，回收率达到最值，说明已有大部分胶原蛋白被析出，由此可知，NaCl 在 4 mol/L 时已经达到饱和，所以选取 4 mol/L 为最佳盐浓度。012345630354045505560657075胶原蛋白回收率/%盐浓度/(mol/L)图 6 盐浓度的确定Figure 6 Determination of the salt concentration2.3.1.3 盐析温度的确定 由图 7 可知，盐析温度低于 15 时，黑木耳胶原蛋白回收率不断升高，但上升趋势相对较慢，盐析温度 15 时回收率达到最高，之后随温度升高而呈现下降趋势，且下降程度较大。这是因为温度过高或过低均会影响酶活性及反应速率，Muyonga J H 等2705101520253040455055606570胶原蛋白回收率/%温度/图 7 盐析温度的确定Figure 7 Determination of the salting out temperature632023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究研究发现，低温环境下，胶原蛋白羟脯氨酸含量低，热稳定性差；而在盐析过程中，较高的温度会导致胶原蛋白结构发生变化，进而使其结构中的-肽链被切断，产生多肽28，使胶原蛋白发生变性，回收率下降。因此，确定 15 为最适盐析温度。2.3.2 DEAE-52 层析分离2.3.2.1 洗脱时间的确定 图 8 为洗脱时间对黑木耳胶原蛋白回收率及纯度的影响。由图可知，随着洗脱时间的延长，胶原蛋白回收率逐渐升高，在 160 min 后回收率基本稳定，可能由于此时一定体积内的胶原蛋白大部分被洗脱出，逐渐接近饱和状态；但胶原蛋白纯度随洗脱时间的增加呈先上升后下降趋势。相关研究指出，胶原蛋白等电点在 pH 6-9 之间，说明其在微酸性和碱性体系中溶解度相对较大29，当时间超过 140 min 时，胶原蛋白在酸性环境中复溶于提取液，导致目标蛋白在层析过程中流失，从而使胶原蛋白纯度降低。综合考虑，选择 160 min 为最佳洗脱时间。020 40 60 80 100120140160180200220203040506070 回收率纯度洗脱时间/min回收率/%纯度/%203040506070图 8 洗脱时间的确定Figure 8 Determination of the elution time2.3.2.2 上样浓度的确定 由图 9 可知，胶原蛋白回收率随其浓度的增加逐渐提高，最高达到 69.5%，说明胶原蛋白回收率与其浓度呈正相关。当黑木耳胶原蛋白浓度为 300 g/mL 时，其纯度达到最高，且之后随浓度加大纯度则呈下降趋势。这是由于此时对杂蛋白的吸附作用已经接近饱和效果，基本上不吸附目标蛋白，因此，回收率增长较为缓慢且纯度降低。综合考虑，选择300 g/mL 为最佳上样浓度。100200300400500505560657075 回收率 纯度胶原蛋白浓度/(g/mL)回收率/%505560657075纯度/%图 9 上样浓度的确定Figure 9 Determination of the loading concentration2.3.2.3 上样缓冲溶液 pH 的确定 由图 10 可知，不同缓冲液 pH 对胶原蛋白回收率及纯度影响的变化趋势显著。随着 pH 的升高，胶原蛋白回收率及纯度均呈现先升高后降低趋势，当 pH为 7.2 时，回收率达到最高 62.7%，纯度达到最高 66.6%。这是由于缓冲溶液 pH 值对胶原蛋白与阳离子螯合反应的平衡常数和自身酸碱性存在一定影响，进而决定胶原蛋白的吸附效果，缓冲液 pH 过低，酸对胶原内部三螺旋结构的降解作用增强，导致胶原肽链降解，损失增大；缓冲液pH 过高，酸的破坏力减弱30。因此，pH 过高或过低均不利于胶原的释放，影响胶原蛋白回收率和纯度，而合适的 pH 条件能够促进胶原结构的进一步降解，释放足够的胶原分子，故确定最佳缓冲溶液 pH 值为 7.2。5.5 6.0 6.5 7.07.5 8.0 8.5 9.056586062646668回收率/%回收率 纯度pH56586062646668 纯度/%图 10 上样缓冲溶液 pH 的确定Figure 10 Determination of the loading buffer pH 2.3.2.4 洗脱盐浓度的确定 按照上述条件进行洗脱（黑木耳胶原蛋白浓度 300 g/mL、缓冲溶液 pH 值 7.2、洗脱时间 160 min），加入不同浓度的氯化钠溶液，筛选其对黑木耳胶原蛋白的影响，642023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究共得到以下组分，绘制 DEAE-52 离子交换层析洗脱盐浓度曲线，管数、吸光度分别作 X 轴、Y轴，如图 11 所示。0-20 管以蒸馏水洗脱，20-40管 以 0.2 mol/L NaCl 为 洗 脱 液，40-60 管 以 0.4 mol/L NaCl 为洗脱液，60-80 管以 0.6 mol/L 为洗脱液。由图可以看出，随着 NaCl 浓度的增加，洗脱峰主要出现在 0.2 mol/L 的 NaCl 洗脱液中，且峰值最高，说明此时黑木耳胶原蛋白分离纯化效果较好，故选择 0.2 mol/L NaCl 作为最佳洗脱液。010203040506070800.00.20.40.60.81.01.20.00.20.40.60.81.01.2 NaCl浓度 吸光度管数图 11 DEAE-52 洗脱盐浓度曲线Figure 11 DEAE-52 wash desalting concentration curve2.3.3 Sephadex G-75 凝胶过滤层析黑木耳胶原蛋白在盐析、DEAE-52 离子交换层析后，经 Sephadex G-75 层析分离的紫外吸收曲线如图 12 所示。从图中可看出，采用 0.2 mol/L NaCl 作 为 洗 脱 液，经 Sephadex G-75 分离，在 7-37 管出现明显紫外吸收峰，峰的宽度较宽，峰形尖锐、较为对称，说明组分均一。收集样品，经冷冻干燥后，测定黑木耳胶原蛋白纯度为 72.6%，较纯化前提高了 32.2%，胶原蛋白回收率为 74.3%。01020304050600.00.20.40.60.81.01.2吸光度管数图 12 Sephadex G-75 层析紫外吸收曲线Figure 12 UV absorption curve of Sephadex G-75 chromatography3 结论以碱性蛋白酶法提取黑木耳胶原蛋白，在酶解温度 55、pH 8.5 的条件下进行单因素实验，并通过响应面法优化提取工艺，得到黑木耳胶原蛋白的最佳提取条件为：酶（2240 IU/mg）添加量 7%、料液比 168 g/mL、酶解时间 2 h，此条件下黑木耳胶原蛋白得率为 0.65%；将该最优条件下提取的黑木耳胶原蛋白先经 4 mol/L NaCl、24 h、15 条件盐析，再于洗脱时间 160 min、上样浓度 300 g/mL、上样 pH 7.2、NaCl 洗脱液浓度 0.2 mol/L 的条件下进行 DEAE-52 离子交换层析，最后经 Sephadex G-75 凝胶过滤层析后，得到的黑木耳胶原蛋白纯度可达到 72.6%，胶原蛋白回收率为 74.3%。综上所述，本研究可为深入了解与开发黑木耳胶原蛋白提供一定的理论基础。参考文献：1刘雅静.黑木耳化学成分及药理活性研究 D.济南：山东轻工业学院，2011.2陈雪凤，韦仕岩，吴圣进，等.不同黑木耳菌株的营养成分分析比较 J.食用菌，2016，38（2）：72-73.3张燕燕，刘新春，王雪，等.黑木耳营养成分及生物活性研究进展 J.南方农业，2018，12（29）：130-134.4周婷，杨恒，王鑫，等.酶解技术提取动物组织中的胶原蛋白及其肽的研究进展 J.食品工业科技，2020，41（15）：332-338.5林洋.黑木耳蛋白质的提取、分离纯化及特性研究 D.哈尔滨：东北林业大学，2016.6周丹，沈艳琴，武海良，等.胶原蛋白的应用研究现状 J.合成纤维，2022，51（8）：5-8.7Lin S T，Hu X，Li L H，et al.Preparation，purification and identification of iron-chelating peptides derived from tilapia（Oreochromis niloticus）skin collagen and characterization of the peptide-iron compl