汗液中葡萄糖的SERS快检.pdf

第34卷第3期2023年9 月【文章编号】2096-2835(2023)03-0389-08中国计量大学学报Journal of China University of MetrologyVol.34 No.3Sep.2023DOI:10.3969/j.issn.2096-2835.2023.03.009汗液中葡萄糖的SERS快检冯笛，张凡利，金尚忠（中国计量大学光学与电子科技学院，浙江杭州310 0 18）【摘要】目的：为了无损检测体内葡萄糖的摩尔浓度，开发了一种汗液中葡萄糖的SERS快检方法。方法：基于葡萄糖和葡萄糖氧化酶之间的酶化反应产生H2O2可以刻蚀修饰有信号分子4-MBA的银立方体，以观测4-MBA的SERS信号来间接检测葡萄糖的摩尔浓度。结果：葡萄糖水溶液的检测限为0.1mmol/L，并在优化的条件下得到汗液稀释4倍时是最佳的前处理方式，且得到汗液中的葡萄糖检测限为0.5mmol/L。结论：整个SERS检测时间可在7 min左右完成，为无损且快速检测糖尿病患者体内的葡萄糖含量提供了一种新的方法。【关键词】表面增强拉曼光谱；葡萄糖；汗液【中图分类号】0 6 57.37,0 433.4【文献标志码】ASERS rapid test for glucose in sweatFENG Di,ZHANG Fanli,JIN Shangzhong(College of Optical and Electronic Technology,China Jiliang University,Hangzhou 310018,China)Abstract Aims:This paper aims to study the non-destructive test of the concentration of glucose in sweatby SERS.Methods:Based on the enzymatic reaction between glucose and glucose oxidase to produce H,O2,the Ag cube particles with the signal molecule 4-MBA can be etched;and the SERS signal of 4-MBA can beobserved to indirectly detect the molar concentration of glucose.Results:The LOD of glucose in aqueoussolution was O.1 mmol/L.The optimal pretreatment was obtained when sweat was diluted 4-fold underoptimized conditions;and the LOD of glucose in sweat was O.5 mmol/L.Conclusions:The entire SERSdetection time can be completed in about 7 min,which provides a new method for the non-destructive and rapiddetection of glucose levels in diabetics.KeywordsSERS;glucose;sweat葡萄糖是自然界分布最广且最重要的一种单糖，也是活细胞的直接能量来源。人体中葡萄糖含量不足会导致低血糖，严重时或致记忆力衰退、【收稿日期】2023-04-03【基金项目】国家自然科学基金项目（No.22104135），浙江省省级重点研发计划项目（No.2020C03095）【通信作者】1金尚忠（196 3-），男，教授，博士，主要研究方向为光谱分析与仪器。E-mail:诱发癫痫、影响大脑活动致使昏迷等，但可通过改善饮食条件在短期内获得补充。而葡萄糖含量过多则会引发糖尿病及其并发症等。据国际糖尿病中国计量大学学报网址：390联盟（IDF）统计，2 0 2 1年全球糖尿病人数约为5.37亿（2 0 7 9岁），其中中国就有约1.4亿。糖尿病可引起约10 0 多种并发症，如心肌梗死、视网膜病变、糖尿病足等。据统计,近年来死于糖尿病及其并发症的人数已超过死于艾滋病、结核病和症疾等人数的总和。而治疗糖尿病最重要的也是第一步便是监测血糖水平，这将极大地提高患者的生活质量，并有助于患者了解自身状况及预防并发症。1葡萄糖检测方法概述1.1酶促方法目前检测葡萄糖的临床方法是血糖检测，血液样本被提供在含有氧化酶的条带或底物上，一般是血糖试纸，然后通过测量酶底物的电学或光学变化来监测反应通量。这种方法是侵人性的，其不仅造成了生理上的损伤和心理负担，而且血检可能造成疾病传播、保存追溯时效短、需要专业的医护人员操作等。尿糖检测虽然无损，但可能会造成假阳性和假阴性的结果。目前家用式自测血糖仪的成熟使得血糖监测更加方便，但也存在一些缺点，如修饰有氧化酶的试纸寿命一般为两年，环境压力、温度、氧化等会导致其寿命进一步缩短，且不洗手操作会进一步降低测量准确性。另外，在自行测试规范且试纸质量没问题的情况下，大量不符合标准的血糖仪被生产出来并投入使用导致检测结果的精度很差。1.2非酶促方法基于酶促反应的葡萄糖检测虽然对葡萄糖是特异性的，但是需要定期更换底物和酶等原料。非酶促葡萄糖检测也是研究的焦点，因为它们增加了检测的稳定性和检测精度并降低了维护成本1-3,并有可能无创地检测葡萄糖4。非酶促葡萄糖检测可分为两种：基于人工酶的电化学检测和物理检测。人工酶与电化学检测相结合类似于酶促方法，但使用专门的电极表面来代替酶，主要是通过葡萄糖分子和电极之间的电子转移的直流电测量来检测葡萄糖浓度4-6 。物理检测葡萄糖是基于检测葡萄糖分子的特定性质，通常是用频率分辨技术和光谱学来完成的。频率分辨技术如阻抗和太赫兹光谱等，这些技术监测样品对调制电场的响应7。光谱学方法包括红外、荧光和拉中国计量大学学报曼光谱。光谱学检测是由于光与分子的相互作用对其化学结构非常特定，入射到样品上的光可能被吸收、透射、反射或散射。1.3光谱学方法荧光光谱是通过光激发分子来监测可见光的发射，然而葡萄糖分子不具有荧光特性，因此须和荧光分子结合来检测。在和葡萄糖的相互作用下荧光分子的发射波长会改变，通过信号的变化检测葡萄糖的浓度8-10 。红外光谱研究分子振动对红外波段范围内辐射的吸收，分子吸收的波长对应于分子化学键特定振动和旋转的能量。葡萄糖的红外光谱检测具有一些困难和挑战，因为水的吸收峰掩盖了葡萄糖分子的信号7.1-12。拉曼光谱是通过用激光激发样品并检测拉曼散射光来完成的。虽然拉曼信号比红外弱，但水在拉曼光谱中没有突出的特征，红外是在透射中进行的,需要在红外波长范围内透明的基底，而拉曼光谱测量散射光，因此可以在任何表面上进行，这就使得可以使用增强拉曼信号的专用基底，也就是表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectrosco-Py，SER S)技术。SERS在此所用到的增强机理主要是表面等离激元共振(SPR)131，它的解释是处于贵金属纳米粒子之间的局域光电场中（即“热点”)的物质，其拉曼信号会被增强约10 510 倍。1.4SERS检测葡萄糖的方案SERS由于其高灵敏和指纹识别的特点，在克服了拉曼光谱缺陷的基础上已被广泛应用在生物医学14-15、食品安全16-17 、环境监测18-19 等领域。基于SERS检测葡萄糖总体来说有四种方案，已有众多科研工作者做出了努力。第一，制备增强因子很高的基底，使得葡萄糖分子的振动信息可直接被极大增强，所测信号也是葡萄糖分子本身的SERS信号2 0 。第二，增加葡萄糖分子与基底结合的亲和力2 17。这两种方案都是针对葡萄糖分子拉曼散射截面小而做出的应对方法，虽然也取得了一定的成果，但在实际应用中依然存在局限性。第三，应用基于硼酸的识别分子功能化表面，葡萄糖可逆地形成硼酸酯，并被捕获在表面上。这样，硼酸分子既可以用作葡萄糖识别结构，也可以用作拉曼活性分子2 2 。第四，基于信号分子的酶促反应2 3-2 5,葡萄糖与葡萄糖氧化酶(GO.)反应产生的H,O2会刻蚀修饰有信号分子第34卷第3期的银纳米粒子，进而导致信号分子的SERS信号降低，葡萄糖的摩尔浓度与信号分子的SERS信号呈现反比。这种方案也是目前基于SERS检测葡萄糖的主流方案，本文也基于此开发了一种银立方体（Ag cube)基底和酶促反应相结合的汗液中葡萄糖快检的方法，检测时间约为7 min，检测限为 0.5 mmol/L。2材料与方法2.1材料人工汗液购自上海源叶生物科技有限公司；GO.购自北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖、PVP(55000）、1,5-戊二醇、CuCl2、A g NO；购自中国国药集团化学试剂有限公司；去离子水（18.2 5M2:cm)。2.2Ag cube的合成溶液a:CuCl溶液，称取18 mg的 CuCl溶于50 mL的1,5-戊二醇；溶液b：A g NO：溶液，称取0.4g的AgNO：溶于含1mL溶液a和9 mL的1,5-戊二醇中；溶液c:PVP溶液，称取0.2 g的PVP(Mw=55000）溶于10 mL的戊二醇中。溶液b和溶液c需要在冰浴中超声溶解4h以上，直至完全溶解，超声过程中保持冰浴，每隔15min取出搅拌一下。其中溶液a可配于离心管中,溶液b和c用2 5mL锥形瓶配制。Agcube制备：首先取干净烘干的圆底烧瓶加人2 0 mL的1,5-戊二醇，在19 3中恒温10min;然后取两只10 mL注射器，吸人适量的溶液b和溶液c,套上2 0 0 L枪头和聚四氟管，放在双通道注射泵上；以50 0 L/min的速率开始向恒温好的戊二醇中滴加溶液b和c；观察到溶液颜色由无色淡黄深黄暗红红色上面出现灰绿色，根据灰绿色占液面总面积来判断粒径大小（本文平均粒径为9 8 nm左右），到所需粒径大小后，取出反应瓶，冰浴使反应迅速停止，整个滴加过程需要计时。2.3Agcube上修饰信号分子4-MBA取2 0 0 LAgcube胶体并加人8 0 0 L无水乙醇，超声使其分散均匀，然后6 0 0 0 r/min离心8min；吸取上层清液，并加入10 0 0 L无水乙醇如此离心清洗2 次，然后用无水乙醇重新定容至1000L;加人10 0 L浓度为1 mmol/L的4-冯笛等：汗液中葡萄糖的SERS快检MBA（4-M BA 配制在无水乙醇中），放置在金属轮盘上旋转孵育12 h；孵育结束后，6 0 0 0 r/min离心8 min，吸取上层清液，然后用10 0 0 L去离子水清洗一次，并再次用水定容至10 0 0 L,放置到4备用。2.4仪器使用了日立电子扫描显微镜（SEM，H I T A-CHI S-4800，Ja p a n）和便携式拉曼光谱仪（NTR785 RP2)。2.5葡萄糖检测原理基于SERS结合酶促反应检测葡萄糖的原理见图1，图中立方体代表Agcube，其上修饰有信号分子4-MBA（4-琉基苯甲酸，CH.O,S）。Agcube的棱角较多，粒子之间产生的热点多，当Agcube胶体与含有葡萄糖的溶液混合并有GOx加入时，会有式（1)所示的反应发生，葡萄糖在GO的作用下产生葡萄糖酸和H2O2，随后会发生式（2）所示的反应，H,O2刻蚀Ag cube产生Ag。使得棱角分明的Ag cube会在H,O2的刻蚀下变得相对圆滑甚至H,O2足够多的情况下，Agcube会完全消失。这意味着Agcube上修饰的4-MBA的SERS信号也会因为热点变少而减弱。也即当GO足量时，葡萄糖越多，4-MBA的SERS信号越低，二者呈反比，可通过4-MBA的信号间接反映葡萄糖的含量。4-MBA 的 SERS特征峰为10 7 7 cm-1（与芳香环呼吸、对称C一H面内弯曲和CS拉伸有关)和158 7 cm-1（由环C一C拉伸和不对称C一H面内弯曲引起)2 6 。glucose+O,+H,0glucose acid+H,O2,(1)2Ag+H,0,2Ag+20H-。(2)LaserAgcube图1基于SERS快速检测葡萄糖的示意图Figure 1 Schematic diagram of rapid glucose detectionbasedon SERS391GO元金膜3922.6葡萄糖溶液的配制首先配制10 0 mmol/L的葡萄糖水溶液，然后继续用水逐级稀释至10、5、2.5、1、0.5、0.2 5、0.1、0.0 5m m o l/L备用。用人工汗液稀释10 0mmol/L的葡萄糖水溶液得到10 mmol/L的葡萄糖溶液，然后继续用人工汗液逐级稀释至5、2.5、1、0.5、0.2 5、0.1、0.0 5m m o l/L备用。3结果和讨论3.1预实验基于检测葡萄糖的原理，需证明上述等式的成立，即4-MBA的SERS信号的降低是由葡萄糖和GO，之间反应而产生H,Oz刻蚀Ag cube所引起的。设计了对照实验：空白1是2 0 0 L水加人30 L的 Ag cube胶体和50 L的1 mg/mL的GO，空白2 是2 0 0 L的10 mmol/L的葡萄糖溶液加人30 L的Agcube胶体和50 L的水。而对照实验是2 0 0 L的10 mmol/L的葡萄糖溶液加人30 L的Agcube胶体和50 L的1mg/mL的GO。分别在40 min内每隔10 min观察4-MBA的158 7 cm-1处峰面积的变化，如图2（所有峰面积均通过积分获得）。空白1和2 在40min内没有发生较大变化，而对照实验其SERS信号在不断降低。说明4-MBA的SERS信号的降低是由葡萄糖和GO，的同时存在并发生反应产生H,O刻蚀Ag cube引起的。另外，对被刻蚀前后的 Ag cube 的形貌进行了 SEM表征，如图3，反应后的Ag cube确实有被明显刻蚀的现象。2520151050图2 葡萄糖和GO，是否发生反应的验证实验Figure 2Validation experiment for glucose and GOrreaction中国计量大学学报200nm(a)刻蚀前200nm(b)刻蚀后图3Agcube被刻蚀前后的SEM图Figure3SEM diagram of theAg cubebefore and after it is etched3.2检测条件优化在预实验中，葡萄糖和GO，之间反应的持续时间较长，因为这是一种需要酶参与的酶促反应，所以考虑加快此反应，使其在短时间内反应完全。加快式（1)所示的反应可从GO，的作用条件出发,因为 GO的氧化能力是通过活性单位U来定义的,1U代表在37，pH=5.7的条件下，1min形成1 mol H,Oz所需的酶量。首先考虑高浓度GO是否可加快反应。其次，从GO的作用条件出发，如温度，pH等。最后，Agcube胶空白1:水+GO体的体积也很重要，体积太大，式（1）产生的空白2：葡萄糖+水对照：葡萄糖+GOx010第34卷H,O2不足以引起4-MBA信号的明显变化，体积太小，采集光谱时又需增加过多的积分时间。首先，探究了GO，浓度增加时体系反应至稳定所需的时间，因为减少其浓度时必定需要更多的时间。在预实验中，所用GO，的浓度为1mg/mL,反应至40 min时4-MBA的SERS信号基本稳定不变。而GO的浓度增加至5mg/mL时，2030t/min40反应稳定的时间减少至10 min，如图4（a）（所有与图4对应的光谱图如图5），表明增加浓度可以加快反应，但在考虑成本的情况下并没有继续探究更高浓度GO，的情况。第3期冯笛等：汗液中葡萄糖的SERS快检2118151296300(a)高浓度GOx时的反应稳定时间8空白10mmol/L420107739318空白10 mmol/L151296301020t/min4.25(c)溶液pH的探究Figure 4Optimize detection conditions158705.000cps10203040305.87pH图4优化检测条件10775000cps408不加热温度(b)温度的探究18空白1510 mmol/L122.216962.2153012.5(d)Agcube体积的优化1587加热-10 mmol/L加热-空白不加热-10 mmol/L不加热-空白M37加热1.7072.28525VAcbe/uL50100900107730 000cps9001200拉曼位移/cm(c)图5与图4相对应的SERS光谱图Figure 5SERS spectrum corresponding to Figure 41200拉曼位移/cm(a)15874.2-空白4.2-10mmol/L5.0-空白5.0-10mmol/L5.8-空白5.8-10mmol/L7.0-空白7.0-10mmol/L8.0-空白8.0-10mmol/L1500180015001800900107730000cps9001200拉曼位移/cm(d)1200拉曼位移/cm(b)158712.5-空白12.5-10mmol/L25-空白25-10mmol/L50-空白50-10mmol/L100-空白100-10mmol/L1500180015001800394其次，验证了将温度加热至37 时和不加热时的区别。虽然GO，在37 50 时都具有热稳定性，但最佳温度是37，且此温度与人体的体温最接近，所以没有探究其他温度。如图4（b），设计了空白和10 mmol/L葡萄糖溶液分别在室温和37 加热3min下的实验。可以看出，37 加热情况下，4-MBA的SERS信号在3min后明显下降了很多，而不加热的情况下仅有相对较弱的下降，所以后续实验都将采取37 加热。然后探究了体系pH的影响，通过添加缓冲液（柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)调节pH,发现添加缓冲液会造成Ag cube团聚，以致4-MBA的SERS信号不稳定。因为缓冲液中存在很多盐离子，使Agcube的团聚不可控，引起了4-MBA的 SERS信号忽高忽低，毫无规律，如图4（c）。经调研，GO在pH为4.56.5时均可保持相对稳定,所以后续实验不再加人缓冲液调节pH,因为水的pH在6.5左右，也可维持GO，的稳定。最后探究了Agcube的体积。根据以上条件优化中的经验，探索了Ag cube 的体积分别为12.5、2 5、50、10 0 L的情况。如图4（d)，随着Agcube的体积的增加，4-MBA的信号无论是空白还是浓度为10 mmol/L的葡萄糖溶液都是增加的，这是符合规律的，计算空白光谱和10 mmol/L葡萄糖溶液的特征峰面积的比值，比值越大，说明葡萄糖和GO产生的H,O2取得了最佳的刻蚀效果(因为产生的H,Oz量是固定的）。所以，最佳的Agcube体积为2 5L。3.3葡糖糖水溶液的检测限上述优化过程中均采用溶胶法，即直接采集整个反应溶液的SERS光谱，但检测限（LOD)却并不理想。后尝试芯片法进行测试，吸取3L溶胶反应液滴到渡有金膜的硅片（简称芯片）上，但直接采集液滴的SERS光谱与溶胶法一样效果不佳。所以,考虑将3L的液滴烘干，以此规避掉液体的影响。实验证明LOD大大降低，同时也对优化条件进行了微调，微调后的条件及顺序如下：2 0 0 L不同浓度的葡糖糖水溶液、2 0 L的Ag cube、30 L的GO,（5 m g/m L),充分混匀后在金属加热平台中38 加热3min，然后吸取3uL反应溶液滴加到芯片上，将芯片放置到50 加热台上烘干，需要6 min。最后，积分2 s采集中国计量大学学报已烘干芯片的SERS光谱。加上操作步骤需9 10min，为节省时间，尝试不用金属加热平台加热3min,直接混匀便吸取3L滴加到50 加热台上烘干,取得了相同的实验效果，7 min即可完成检测。如图6，误差棒由3次平行实验获得，光谱图右侧为与之相对应的葡萄糖的摩尔浓度，葡萄糖水溶液的 LOD为 0.1 mmol/L。对葡萄糖的对数浓度和10 7 7 cm-1的峰面积做了线性拟合，如图7(小图为葡萄糖原始浓度与10 7 7 cm-1峰面积的浓度曲线）,R为0.95，线性效果良好。107730000cps空白0.05mmol/L0.1 mmol/L0.25 mmol/L0.5 mmol/L1 mmol/L2.5mmol/L5mmol/L10mmol/L9001200拉曼位移/cml(a)SERS光谱90E1077cm80706050403020100Blank0.050.10.250.512.55葡萄糖摩尔浓度/(mmolL-)(b)1077cm峰面积柱状图图6 葡萄糖水溶液的检测限Figure 6LOD for aqueous glucose solutions3.4葡萄糖在人工汗液中的检测限在关于pH优化中便提到，盐类物质会引起Ag cube的团聚不可控，汗液中同样存在大量盐类物质，若不对汗液进行前处理，则无法得到理想的结果。在加热烘干后，金膜上会出现白色析出物，这正是汗液中存在的大量盐类物质。从快速检测的目标出发，汗液的前处理不能是复杂且耗时的，首先想到也是最简单的方法是稀释汗液。第34卷15871500180010第3期80706050403020100图7 葡萄糖水溶液的对数浓度与4-MBA1077cm-1处SERS峰面积的拟合曲线Figure 7Fitting curve of the logarithmic concentra-tion of glucose aqueous solution to theSERS peak area at 1 077 cm=1 of 4-MBA10779001200拉曼位移/cm(a)SERS光谱1401201.361008060402001：1(b)1077cm峰面积柱状图图8 人工汗液的稀释倍数探究Figure 8 Exploration of dilution factor of artificialsweat在此,把加标后葡萄糖浓度为10 mmol/L的汗液和水分别按照1：1、1：2、1：3和1：4的比例进行稀释，按照优化的条件和步骤进行测试，结果如图8，当汗液和水的比例为1：3和1：4时获得了良好效果，不仅误差较小，而且空白光谱和10mmol/L葡萄糖的汗液有较好的区分。但汗液与冯笛等：汗液中葡萄糖的SERS快检水的比例为1：3时是最优的，因为稀释倍数越多,原始汗液中的葡萄糖也被稀释越多，产生的y=-24.89x+28.2H,O，就越少，空白光谱和汗液光谱就越难区分。R=0.95在此基础上，葡萄糖浓度则相应被稀释了480工010葡萄糖摩尔浓度/mM0.1葡萄糖摩尔浓度/mM158730 000 cpsl1:1-空白1:1-10mmol/L1:2-空白1:2-10mmol/L1:3-空白1:3-10mmol/L1:4-空白1:4-10mmol/L15001800空白1 077cm10mmol/L3.134.154.351:21:3汗液：水395倍，但只关注葡萄糖原始浓度。如图9，汗液中葡萄糖的LOD为0.5mmol/L,而葡萄糖水溶液的王LOD为0.1mmol/L,因为汗液中的葡萄糖被稀释至原来的4倍。人体正常的血糖浓度空腹时为1101:43.96.1mmol/L,餐后2 h为4.4 7.8 mmol/L,而糖尿病患者的这一数值要高得多，一般空腹时大于7.1mmol/L，餐后2 h大于11.1mmol/L。而人体汗液中的葡萄糖含量很低，约为血糖浓度的1%2%(对于糖尿病患者,空腹时则大于0.0 7 1 mmol/L,餐后2 h 大于0.1l mmol/L)，或为0.0 6 0.2 mmol/L，两者的差距不大2 7 。本文的方法仅能检测到0.5mmol/L,相差约2.58.3倍,距离汗液中葡萄糖的浓度范围相差不到1个数量级，原因是还有很多条件未优化，如信号分子4-MBA与Ag cube的孵育时间、Ag cube的粒径大小、汗液稀释倍数的详细优化等。107730 000 cps空白0.25 mmol/L0.5 mmol/L1 mmol/L2.5mmol/L5mmol/L10mmol/L9001200拉曼位移/cm(a)SERS光谱1501 077 cml1209060300空白0.2 50.5葡萄糖摩尔浓度/mmolL-)(b)1077cm峰面积柱状图图9葡萄糖在人工汗液中的检测限Figure 9 LOD of glucose detection in artificial sweat15871500180012.55103964结语本文基于SERS并利用葡萄糖和GO_之间的反应产生H,O刻蚀Agcube引起4-MBASERS信号的变化来间接检测汗液中的葡萄糖。首先验证了葡萄糖和GO之间反应的可靠性。其次优化了GO，的浓度、环境温度、体系pH以及Ag cube胶体的体积对测试灵敏度的影响。得到了葡萄糖水溶液的LOD为0.1mmol/L,检测时间为7 min。最后，对汗液进行了稀释操作，汗液中葡萄糖的LOD为0.5mmol/L,距离汗液中葡萄糖浓度还相差不到1个数量级，但糖尿病患者往往汗液中葡萄糖浓度较高，所以此方法是初步成功的。这为糖尿病患者提供了一种快速无损的葡萄糖检测方式。【参考文献】1LEE H,SONG C,HONG Y S,et al.Wearable/disposablesweat-based glucose monitoring device with multistagetransdermal drug delivery module J.Science Advances,2017,3(3):1-8.2MUNJE R D,MUTHUKUMAR S,PRASAD S.Lancet-free and label-free diagnostics of glucose in sweat using ZincOxide based flexible bioelectronicsJJ.Sensors and ActuatorsB-Chemical,2017,238:482-490.3XU X L,QIC Y,HAO Z D,et al.The surface coating ofcommercial LiFePO4 by utilizing ZIF-8 for high electro-chemical performance lithium ion battery J.Nano-MicroLetters,2018,10(1):1-9.PARK S,BOO H,CHUNG T D.Electrochemical non-en-zymatic glucose sensorsJJ.Analytica Chimica 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