红藻源新型抗氧化剂己糖氧化酶的异源表达优化及酶学特性表征.pdf

红藻源新型抗氧化剂己糖氧化酶的异源表达优化及酶学特性表征马卫林袁包怡袁陆跃乐袁朱林江*袁陈小龙渊浙江工业大学生物工程学院杭州 310014冤摘要天然抗氧化功能的活性多肽和食品酶具有绿色尧安全及可靠的特点袁广受欢迎遥 己糖氧化酶是一种底物谱广且具有除氧尧酸化尧提高蛋白交联等功能的氧化酶袁可作为一种新型绿色多功能的食品添加剂遥为了提高己糖氧化酶在毕赤酵母中的过量表达袁系统比较不同基因型的宿主菌株尧表达方式以及多拷贝数转化子等因素对己糖氧化酶异源表达的影响遥 应用新建立的 3 步筛选法获得不同基因型的转化子并比较其发酵酶活袁结果表明袁甲醇代谢缓慢的 Muts型宿主有利于己糖氧化酶的表达曰而甲醇诱导表达方式优于组成型表达方式曰较高的己糖氧化酶基因拷贝数表达相对更高的酶活遥然而袁优化以上表达因素袁己糖氧化酶表达水平仍不高袁最高摇瓶发酵酶活为 4.92伊10-2U/mL遥 重组酶的纯化研究表明存在 3 种蛋白袁分子质量分别为 62袁40 ku 和 29 ku袁即己糖氧化酶的原酶和经蛋白酶切割而成的 2 个二聚体亚基袁其中原酶的活性较低且占比最高袁可能是表达活性偏低的原因之一遥 酶学特性研究表明袁重组酶的最适条件为 5060 益尧pH 4.0袁且常温条件渊20 益冤下可维持 50%的活性遥 低温条件渊2060 益冤和酸性条件渊pH 3.06.0冤袁己糖氧化酶酶活较为稳定袁说明其是一种耐酸性较好的抗氧化酶袁适用于酸性食品的保鲜和抗氧化应用遥关键词己糖氧化酶曰 毕赤酵母曰 食品用酶曰 天然抗氧化剂文章编号1009-7848渊2023冤08-0041-09DOI院 10.16429/j.1009-7848.2023.08.005收稿日期院 2022-08-18基金项目院 浙江省重点研发计划项目渊2019C02088冤第一作者院 马卫林袁男袁硕士生通信作者院 朱林江E-mail院 食品保鲜剂和抗氧化剂是食品添加剂的一个重要组成部分袁能够防止食品氧化褐变尧褪色尧维生素破坏以及变质产生异味等遥近年来袁随着人们环境保护和食品安全意识的日益提高袁 绿色尧环保尧 多功能且无副作用的食品添加剂受到越来越多的关注遥 与人工合成的食品保鲜剂和抗氧化剂相比袁天然来源且具有抗菌尧抗氧化等功能的活性多肽或食品酶则更加安全可靠袁 越来越受人们的喜欢遥 其中袁 己糖氧化酶 渊Hexose oxidase袁 D-hexose院O21-oxidoreductase袁 EC 1.1.3.5袁 HOX冤具有除氧尧酸化尧提高蛋白交联等功能袁可作为一种潜在的安全尧 无毒尧 功能多样的绿色食品添加剂袁 在食品保鲜和抗氧化方面具有重要的应用价值1遥HOX 最早是由 Ikawa 等2于 1969 年从新英格兰海岸的两种红藻即皱波角叉菜渊Chondrus cris鄄pus冤和克里斯塔海藻渊Euthora cristata冤中发现的遥该酶能够催化多种己糖和二糖的氧化袁 生成相应的内酯并释放出 H2O2袁 包括 D-果糖尧D-葡萄糖尧D-半乳糖尧麦芽糖尧乳糖和纤维二糖等遥 广泛的底物特异性使其区分于葡萄糖氧化酶渊Glucose oxi鄄dase袁 GOD冤袁GOD 一般只特异性催化 D-葡萄糖的氧化遥 HOX 的催化反应消耗 O2并释放 H2O2袁且生成的内酯能够自发水解为相应的醛酸袁 因而作为抗氧化剂尧酸化剂尧面粉改良剂和抑菌剂袁在食品工业和畜牧业等方面应用广泛3-5遥 天然的 HOX大多来源于红藻类6-8袁因含量低尧提取步骤繁琐尧成本高而无法实现工业化生产遥 随着基因工程技术的发展袁 针对 HOX 的异源表达已有相应的研究遥 比如袁皱波角叉菜来源的 HOX 基因已被克隆并分别在大肠杆菌渊Escherichia coli冤9尧酿酒酵母渊Saccharomyces cerevisiae冤10尧 多 形 汉 逊 酵 母渊Hansenula polymorpha冤11和 毕 赤 酵 母 渊Pichiapastoris冤9袁12中实现了表达遥 其中大肠杆菌中不能实现活性表达袁而毕赤酵母中表达活性相对较高遥为了进一步研究毕赤酵母中表达己糖氧化酶袁本研究针对其表达策略进行综合评价遥毕赤酵母表达系统是一种较为成熟的真核表达系统袁不仅具有发酵营养要求低尧操作简单的优点袁而且具有真核细胞表达后修饰的能力袁同时也能表达结构相对复杂的或易形成包涵体的蛋白等13-14遥 其分泌表达目的蛋白袁在胞外蛋白中占比灾燥造援 23 晕燥援 8Aug援 圆 园 2 3允燥怎则灶葬造 燥枣 悦澡蚤灶藻泽藻 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠中 国 食 品 学 报第 23 卷第 8 期圆 园 2 3 年 8 月中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期较高袁简化了下游处理过程遥毕赤酵母表达重组蛋白的水平袁与不同表达策略相关袁包括宿主菌株基因型尧重组表达方式以及多拷贝转化子筛选等14遥其中袁 典型宿主菌株基因型包括甲醇代谢正常Mut+型和甲醇代谢缓慢 Muts型袁 重组表达方式包括甲醇诱导型和组成型等遥 目前并未针对己糖氧化酶在毕赤酵母中过量表达的策略进行分析或综合评价遥 本研究优化己糖氧化酶在毕赤酵母中的表达策略袁 并对重组表达的酶进行纯化和酶学表征袁对其应用具有一定的参考价值遥1材料和方法1.1菌株尧质粒尧培养基和引物大肠杆菌 渊E.coli冤DH5琢 菌株感受态购自上海生工生物工程股份有限公司袁Mut+型的毕赤酵母 GS115 菌株为实验室保藏袁Muts型的毕赤酵母KM71 菌株由本学院孙杰老师赠送袁质粒 pPIC9k尧pPICZ琢A尧pGAPZ琢A尧pUC18 由本实验室保藏遥LLB 培养基院0.5%酵母粉袁1%蛋白胨袁1%Na鄄Cl袁pH 值调至 7.0遥 高压蒸汽灭菌 121 益袁20 min遥配制固体培养基时添加 1.5%的琼脂粉遥 YPD 培养基院酵母粉 1%袁蛋白胨 2%袁葡萄糖 2%遥 配制固体培养基时添加 1.5%的琼脂粉遥 YPDS 培养基院酵母粉 1%袁蛋白胨 2%袁葡萄糖 2%袁山梨醇 1 mol/L遥配制固体培养基时添加 1.5%的琼脂粉遥MD 培养基院无氨基酵母氮源渊YNB冤13.4 g/L袁葡萄糖 20 g/L袁生物素 4伊10-4g/L袁 琼脂糖 20 g/L遥 MMH 培养基院YNB 13.4 g/L袁甲醇 5 g/L袁生物素 4伊10-4g/L袁琼脂粉 20 g/L袁组氨酸 4伊10-2g/L遥0.28 mmol/L 邻联茴香胺渊O-Dianisidine冤溶液的配制方法如下院 取 1.7 mg 邻-联二茴香胺溶于25 mL 磷酸盐缓冲液中遥本试验所用引物如表 1 所示遥引物名称引物序列渊5爷寅3爷冤9kHOX-FTCGAAGGATCCAAGAATTCATGGCTACCTTGCCACAAAAAGAC9kHOX-RGAATTCTTGGATCCTTCGAATAATTAGpiczMCS-FGAAACCATATGCTGCAGTCTAGAGAATTCACGTGGCCCAGCCGGCCGTpiczMCS-RGAATTCTCTAGACTGCAGCATATGGTTTCGAATAATTAGTTGTTTTTTGpiczHOX-FCAACTAATTATTCGAAACCATATGGCTACCTTGCCACAAAAAGACCpiczHOXHis-RCTCAATGATGATGATGATGATGGCATGCCTTAGTCTGTTTTGGTT-SphI-FCATCATCATCATCATCATTGAGTT-BamHI-RGAAGCTATGGTGTGTGGGGGATCCGCACAAACGAAGGTCTCACpgapz-HOX-FGAACAACTATTTCGAAACGAGGAATTCATGGCTACCTTGCCACAAAAAGpgapz-MCS-FCATTGCTGCAGCTATTCGCTAGCGATCGGTACCTCGAGCCGCGGCGGCCGCCApgapz-MCS-RCTAGCGAATAGCTGCAGCAATGTGTGAATTCCTCGTTTCGAAATAGTTGTTCAATTGGap-pUC18-FCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCGap-pUC18-RCGACGGCCAGTGCCAAGCTTTTTAGATAAGGACAGGAGAGATGRT-gap-FGGTCTTTTGAGTGGCGGTCRT-gap-RTTGTCGGTGTCAACGAGGAGRT-HOX-FGGCCAGGTGTGATTGGAAGART-HOX-RAACCAGCATGACCACCCAAA表 1引物名称及序列Table 1Primer names and sequences1.2仪器与设备S1000 PCR 仪尧ChemiDoc MP 凝胶成像仪袁美国 Bio-rad 公司曰Avanti J-26XP 高速冷冻离心机袁美国 Backman 公司曰PB-10 pH 计袁德国 Sarto鄄rius 公司曰LC480 荧光定量 PCR 仪袁 罗氏有限公司曰ND-ONE-W 超微量核酸蛋白测定仪 Nan鄄oDrop ONEC袁赛默飞世尔科技渊中国冤有限公司曰SpectraMax 190 酶标仪袁美国分子仪器渊上海冤有限公司遥1.3重组表达质粒的构建1.3.1pPIC9k-HOX 的构建首 先 将 红 藻 渊C.crispus冤来源的氨基酸序列渊GenBank 数据库登录42第 23 卷 第 8 期号为 AAB49376冤提交至华大青兰生物科技渊无锡冤有限公司进行人工合成密码子优化的 HOX 基因袁并将 HOX 基因插入到 pPIC9k 的 EcoRI/NotI 之间袁 获得含 琢 因子信号肽的原始质粒 pPIC9k-琢-HOX遥 在此基础上删除 琢 因子信号肽构建了重组质 粒 pPIC9k-HOX袁 即 采 用 引 物 9kHOX-F/9kHOX-R 扩增原始质粒后进行一步克隆试剂盒进行自身环化连接遥1.3.2pPICZ-HOX 的 构 建首 先 采 用 引 物piczMCS-F/piczMCS-R 扩增保藏质粒 pPICZ琢A 进行反向 PCR 扩增袁 删除信号肽并引入多克隆位点袁 采用一步克隆试剂盒进行自环化后得到不含信号肽的质粒 pPICZ-NdeI遥接着将 PCR 扩增得到的 HOX 基因渊引物为 piczHOX-F/piczHOXHis-R袁DNA 模板为 pPIC9k-HOX 质粒冤 和终止子 TT 片段渊引物为 TT-SphI-F/TT-BamHI-R袁DNA 模板为质粒 pPIC9k冤 与由 NdeI 和 BamHI 双酶切线性化质粒 pPICZ-NdeI 进行一步克隆连接袁得到重组表达载体 pPICZ-HOX遥1.3.3pGAPZ-HOX 的构建采用引物 pgapz-MCS-F 和 pgapz-MCS-R 扩增保藏质粒 pGAPZ琢鄄A袁删除信号肽并自环化连接得到 pGAPZ-AM 质粒遥 接着将 PCR 扩增得到的 HOX 基因 渊引物为pgapz-HOX-F/piczHOX-R袁DNA 模板为 pPIC9k-HOX 质粒冤和终止子 TT 片段渊引物为 TT-SphI-F/TT-BamHI-R袁DNA 模板为质粒 pPIC9k冤由 EcoRI和 BamHI 双酶切线性化质粒 pGAPZ-AM 进行一步克隆连接袁得到重组表达载体 pPICZ-HOX遥1.4平板显色法筛选多拷贝菌株参照郜赵伟15的试验方法对转化子进行初筛袁具体方法如下院用无菌牙签挑取 YPDS 平板上的 KCXH 菌株袁 用无菌水稀释后分别点到具有编号的 MMH 平板遥 将平板于 30 益培养箱倒置培养48 h 后遥 将显色液倾倒于 MMH 平板上遥 并用无菌水作为阴性对照袁以葡萄糖氧化酶 GOD 试剂做为阳性对照遥1.5实时荧光定量 PCR 验证拷贝数参照宣姚吉等16的方法进行实时荧光定量PCR 验证遥 首先袁以 KM71 菌株基因组为模板袁采用 Gap-pUC18-F/Gap-pUC18-R 引 物 袁 扩 增GAPDH 基因袁并采用一步克隆试剂盒连接至质粒pUC18袁得到标准质粒 pUC18-GAPDH遥 提取各重组菌株的基因组袁作为实时荧光定量 PCR 的检测样品遥根据拷贝数换算公式院 拷贝数=6.023伊1014伊质粒的浓度/渊660伊基因片段长度冤袁计算出每微升标准质粒所含的总拷贝数遥 将质粒稀释至每微升108袁107袁106袁105袁104个拷贝袁 以各浓度质粒为模板袁分别进行实时荧光定量 PCR遥以起始模板中质粒拷贝数的对数作为横坐标袁测得的 Ct 值作为纵坐标袁建立含 GAPDH 基因和 HOX 基因质粒的双标准曲线遥将各菌株测得的 Ct 值分别代入两条标准曲线中袁求出样品中 GAPDH 基因 HOX 的起始拷贝数遥 由于 GAPDH 基因在毕赤酵母基因组中是单拷贝袁 因此样品中 HOX 基因拷贝数=HOX 基因起始拷贝数/GAPDH 基因起始拷贝数遥1.6重组 HOX 的纯化重组菌株的发酵液离心后弃去上清袁 将细胞沉淀重悬于磷酸钾缓冲液中遥 使用高压匀浆机破碎菌液遥收集细胞破碎液袁离心后得到的上清液即为粗酶液遥 将粗酶液通过 Ni 柱进行分离纯化袁用300 mmol/L 咪唑洗脱遥透析和浓缩后备用遥将纯化后的重组 HOX 进行 SDS-PAGE 分析并测定蛋白浓度遥1.7HOX 酶活测定方法在 96 孔板的每孔中分别加入 0.28 mmol/L 邻联茴香胺溶液 120 滋L尧10%葡萄糖溶液 25 滋L尧1U/mL 辣根过氧化物酶溶液 10 滋L袁 加入 20 滋L 待测样品遥 迅速混匀袁置于酶标仪中遥 设定温度 35益袁 检测波长 460 nm袁 每隔 1 min 测定一次吸光值袁连续测定 20 min袁计算每分钟吸光度增加值的平均值遥1.8重组 HOX 酶学特性分析1.8.1最适反应温度的测定将未添加酶液的反应体系分别在 20袁30袁40袁50袁60袁70 益及 80 益条件下保温 5 min袁 然后加入重组 HOX 酶液进行反应袁并测定各温度条件下HOX 的酶活力遥1.8.2最适反应 pH 值的测定分别用 50 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液 渊pH 3.05.0冤尧50 mmol/L 磷酸钾缓冲液渊pH 6.08.0冤尧50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液渊pH 9.0冤配制邻联茴香胺溶液袁然后加入重红藻源新型抗氧化剂己糖氧化酶的异源表达优化及酶学特性表征43中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期图 1构建不同类型的重组毕赤酵母菌株的示意图Fig.1Schematic diagram for the construction of different types of recombinant Pichia strains组 HOX 酶液进行反应袁于 35 益测定各 pH 值条件下 HOX 的酶活力遥1.8.3热稳定性的测定将酶液分别于 20袁30袁40袁50袁60袁70 益及 80 益条件下保温 1 h袁 然后于35 益条件下测定 HOX 的剩余酶活力遥1.8.4底物催化活性的测定不同糖类底物催化活性的测定遥 根据上述 HOX 活性测定方法袁在最适反应温度和 pH 值下袁分别以葡萄糖尧果糖尧麦芽糖尧乳糖尧半乳糖尧蔗糖和纤维二糖作为反应底物进行酶活测定遥 将最适底物的酶活设为 100%袁计算催化其它底物时的相对酶活遥2结果与讨论2.1表达 HOX 的重组质粒构建根据前期研究发现袁 构建含有 琢 因子信号肽的重组表达质粒袁 难以检测到重组己糖氧化酶的活性袁 所以本研究主要构建不含信号肽的重组表达菌株遥 为了优化 HOX 的过量表达策略袁选择 2种基因型的毕赤酵母菌株和 3 种基因组整合型的表达质粒袁如图 1 所示遥毕赤酵母菌株包括甲醇代谢正常型 Mut+的 GS115 菌株和甲醇代谢缓慢型Muts的 KM71 菌株遥 构建的重组质粒如图 1 所示袁包括 pPIC9k-HOX尧pPICZ-HOX尧pGAPZ-HOX遥 由甲醇诱导表达的重组质粒 pPIC9k-HOX 线性化后转化至 GS115 菌株袁筛选获得 Mut+型菌株袁记为GKX 菌株遥 由甲醇诱导表达的重组质粒 pPICZ-HOX 线性化后转化至 KM71 菌株袁筛选 Muts型菌株袁 记为 KCX 菌株遥 组成型表达的重组质粒pGAPZ-HOX 线性化后转化至 KM71 菌株袁 筛选Muts型菌株袁记为 KPX 菌株遥2.2基于平板显色的高通量筛选方法的建立建立基于酶活的高通量筛选方法袁 有助于筛选高活性的重组毕赤酵母转化子遥 结合之前报道的用于筛选葡萄糖氧化酶的方法15袁利用己糖氧化酶能够氧化葡萄糖生成 H2O2的特性袁在辣根过氧化物酶辅助下袁可与邻联茴香胺进行显色反应袁即平板显色法遥 采用 3 步法袁如图 2a 所示袁首先通过高抗性平板筛选出具有耐受较高抗生素浓度的菌落曰 将菌落接种至两块一致并进行序列标记的MM 平板渊GKX 菌株冤或 MMH 平板渊KCX 菌株冤或MDH 平板渊KPX 菌株冤曰培养后将显色剂倒入其中一块平板进行显色反应遥 若表达己糖氧化酶的阳性菌落则会显现棕色袁如图 2c 所示遥以商品化的葡萄糖氧化酶为对照袁 检验该方法的灵敏度袁结果如图 2b 所示遥 5 号格为以超纯水作为阴性对照袁6尧7尧10尧11尧12 号格代表的 GOD活性分别为院0.01袁0.05袁0.1袁0.2袁0.5 U/mL袁 结果表明在酶活仅为 0.01 U/mL 时即可显色袁具有较高的显色灵敏度遥 将平板显色筛选方法用于高活性重组毕赤酵母菌株的筛选袁如图 2c 所示遥44第 23 卷 第 8 期渊a冤基于酶活分析的高通量筛选方法示意图渊b冤葡萄糖氧化酶试剂作为显色对照渊c冤不同转化子的显色结果图图 2基于己糖氧化酶活性的平板筛选方法Fig.2Plate screening method basedon hexose oxidase activity2.3不同重组表达策略的比较通过高抗平板初筛尧 平板显色复筛和三角瓶发酵验证袁 最终筛选得到 6 株 Mut+型的甲醇诱导表达的 GKX 菌株尧10 株 Muts型的甲醇诱导表达的 KCX 菌株和 6 株 Muts型的组成型表达的 KPX菌株袁 如表 2 所示遥 其中表达酶活最高的菌株为KCX56 菌株袁发酵酶活为 4.92伊10-2U/mL遥采用之前报道的基于双标准曲线的实时荧光定量 PCR 法16袁对筛选得到的重组菌株的 HOX 基因拷贝数进行了测定遥 将 GAPDH 基因克隆至pUC18 质粒上获得的重组质粒和含 HOX 基因的重组质粒为标准样袁制作标准曲线袁用于定量分析每一个重组菌株的基因组上的 HOX 基因的拷贝数袁结果如表 2 所示遥 重组菌株的 HOX 基因拷贝数在 16 个拷贝之间袁其中 KCX56 菌株含有 6 个拷贝遥比较 Mut+型的 GKX 菌株和 Muts型的 KCX菌株发现袁 在相同拷贝数的情况下袁KCX 菌株具有较高的酶活遥 相较于 GS115 菌株袁KM71 菌株衍生的重组菌有利于己糖氧化酶的表达遥 此外袁GS115 菌株衍生的重组菌袁在上罐发酵过程中袁由于其甲醇代谢旺盛袁溶氧需求大袁很难控制其在高密度发酵时的溶氧需求遥 因此袁Muts型菌株有利于己糖氧化酶的发酵制备遥比较甲醇诱导表达的 KCX 菌株和组成型表达的 KPX 菌株袁这些菌株均由 Muts型的 KM71 菌株衍生而来袁在相同拷贝数的情况下袁KCX 菌株表现出更高的己糖氧化酶的活性袁 提示甲醇诱导表达策略更有利于己糖氧化酶的表达遥拷贝数对重组毕赤酵母菌株的蛋白表达具有显著影响袁随着拷贝数增加袁已糖氧化酶的表达水平上升遥GKX 菌株中袁GKX35 具有最高的酶活袁即为 1.53伊10-2U/mL袁 该菌株具有 4 个 HOX 基因的拷贝遥 表达酶活最高的 KCX 菌株是 KCX56 菌株袁含有 6 个 HOX 基因的拷贝遥 KPX 菌株中袁筛选得到最高拷贝数为 3袁 即 KPX30袁 其表达酶活为1.92伊10-2U/mL遥 分子质量相对较小的重组表达质粒 pPICZ-HOX 有利于高拷贝数菌株的构建遥虽然宿主菌株的甲醇代谢能力尧HOX 基因的表达策略尧HOX 基因拷贝数等因素对重组毕赤酵母菌株表达己糖氧化酶的活性有一定影响袁 但是优化这些基因表达元件后对己糖氧化酶表达水平并未获得较大提升袁 这些重组表达菌株的表达水平仍处于较低水平遥 在毕赤酵母菌株中高效表达己糖氧化酶仍需进一步研究潜在的关键因素遥2.4重组己糖氧化酶的酶学性质为了进一步认识重组表达的己糖氧化酶的应用特性袁对其纯化并进行酶学特性特性研究袁结果如图 3 所示遥 将 KCX56 菌株诱导表达后袁经高压匀浆破碎尧镍柱纯化得到纯酶袁检测蛋白质浓度为270 滋g/mL遥通过 SDS-PAGE 验证如图 3a 所示袁预测的重组 HOX 蛋白大小为 62 ku遥此外袁根据之前研究表明12袁己糖氧化酶具有被蛋白酶切割并成熟化的功能袁 形成 2 个分子质量分别为 40 ku 和29 ku 的亚基遥 SDS-PAGE 图谱中显示袁 纯化的HOX 蛋白主要为完整肽链的 62 ku 蛋白袁40 ku 和29 ku 的成熟化亚基的含量较少遥 由于完成切割的 HOX 蛋白的活性较高9袁而在重组表达的蛋白中袁经过成熟化 HOX 的比例较低袁这可能是重组表达的己糖氧化酶活性偏低的原因之一遥如图 3b 所示袁重组己糖氧化酶的最适反应温红藻源新型抗氧化剂己糖氧化酶的异源表达优化及酶学特性表征45中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期菌株名称宿主菌株质粒拷贝数摇瓶酶活/10-2U 窑 mL-1GKX07GS115pPIC9k10.65 依 0.07GKX0931.08 依 0.15GKX1520.87 依 0.08GKX2520.51 依 0.09GKX3541.53 依 0.21GKX7941.32 依 0.12KCX11KM71pPICZA12.10 依 0.17KCX1821.34 依 0.19KCX1921.90 依 0.21KCX2121.00 依 0.17KCX2621.20 依 0.2KCX4343.81 依 0.15KCX5112.20 依 0.18KCX5233.51 依 0.0011KCX5533.23 依 0.0023KCX5664.92 依 0.0027KPX01KM71pGAPZA10.13 依 0.06KPX0610.42 依 0.09KPX1621.51 依 0.23KPX2120.69 依 0.05KPX3031.92 依 0.31KPX4010.31 依 0.09表 2筛选得到的不同基因型的重组菌株Table 2Screened recombinant strains of different genotypes度为 5060 益遥 在反应温度为 50 益时袁酶活性达到最高遥 在小于 50 益时袁酶活随着反应温度的升高而不断升高遥 当反应温度大于 60 益袁酶活逐渐降低袁但仍能保持在 80%以上遥 在温度为 20 益袁仍表现出 50%的相对酶活袁 表明重组己糖氧化酶在常温条件下能保持一定的活性遥 如图 3c 所示袁重组己糖氧化酶的最适反应 pH 为 4.0袁即酸性条件下表现出最高的酶活袁 适用于酸性食品的保鲜和抗氧化遥纯化的重组己糖氧化酶的热稳定性如图 3d所示袁在温度为 2060 益之间袁酶活较为稳定袁保温 1 h 后仍能维持在 70%90%之间的活性遥 当温度超过 60 益袁酶活力迅速下降遥 在 70 益时袁酶活损失约 80%遥当温度达到 80 益时袁酶完全失活遥该红藻来源的重组己糖氧化酶不能耐受高温条件遥重组己糖氧化酶的 pH 稳定性如图 3e 所示袁 将纯酶置于不同 pH 值的缓冲液及最适反应温度 50益条件下放置 5h袁测定残留酶活遥当酶置于 pH 3.06.0 之间环境下时袁酶活十分稳定袁保持 90%左右的活性袁表明该酶具有很强的耐受酸性环境能力袁进一步证实己糖氧化酶适用于偏酸性食品的除氧保鲜和抗氧化保护遥 当置于中性或偏碱性环境中时袁酶活难以维持袁活性下降较快袁在 pH 9.0 环境中袁5 h 内残留 60%的活性遥己糖氧化酶是一种底物谱广泛的氧化还原酶袁本研究选择了葡萄糖尧果糖尧半乳糖尧纤维二糖尧麦芽糖和乳糖作为底物袁比较重组 HOX 的底物催化活性袁 结果如图 3f 所示遥 在最适温度渊50益冤和 pH 值渊4.0冤条件下袁进行重组 HOX 氧化反应遥 以酶的最适底物对应的酶活设为 100%袁计算与其它底物反应时的相对酶活袁 结果表明重组HOX 对以上 6 种糖均具有不同程度的催化活性袁其中葡萄糖是 HOX 的最适底物袁对乳糖和麦芽糖也具有较高的活性袁 证实己糖氧化酶可用于不含葡萄糖而富含二糖的食品的保鲜和抗氧化保护袁如富含麦芽糖的面制品和富含乳糖的乳制品等遥46第 23 卷 第 8 期反应温度Reaction temperature/益反应 pH 值Reaction pH value孵育温度Incubation temperature/益孵育 pH 值Incubation pH value底物Substrate渊a冤纯化的己糖氧化酶的SDS-PAGE 分析图谱渊b冤最适作用温度渊c冤最适作用 pH 值渊d冤温度稳定性渊e冤pH 值稳定性渊f冤底物谱分析图 3重组己糖氧化酶的酶学性质Fig.3Enzymatic properties of recombinant hexose oxidase3结论作为新型保鲜和抗氧化添加剂袁 红藻来源的己糖氧化酶的制备是限制其推广应用的瓶颈之一遥 本研究综合评价了己糖氧化酶在毕赤酵母中过量表达的不同策略袁 并表征了重组表达的己糖氧化酶的特性遥应用 3 步法筛选袁获得了 6 株 Mut+型甲醇诱导表达重组菌株尧10 株 Muts型甲醇诱导表达重组菌株和 6 株 Muts型组成型表达重组菌株遥 比较这些重组菌株的发酵酶活袁结果表明甲醇代谢缓慢的 Muts型毕赤酵母酵母菌株有利于己糖氧化酶的表达和发酵曰相比于组成型表达策略袁甲醇诱导型表达方式获得更高的活性曰HOX 基因拷贝数的增加袁有助于酶活的提高遥 虽然优化了以上表达策略袁 但是己糖氧化酶在毕赤酵母菌种的表达水平并不高袁最高摇瓶发酵酶活为 4.92伊10-2U/mL袁 其高效表达的限制性因素仍需进一步研究遥针对纯化的重组己糖氧化酶的酶学特性研究表明袁其最适底物为葡萄糖袁对麦芽糖尧乳糖尧果糖等均具有催化活性遥 最适温度为 5060 益袁在 20 益时仍维持 50%的活性遥 最适反应 pH 值为 4.0袁即适用于酸性环境遥 在低温条件和低 pH 值条件袁其稳定性较好遥 综上袁该重组己糖氧化酶可用于一些葡萄糖含量少而其它糖类含量高如麦芽糖 渊面制品冤和乳糖渊乳制品冤等且偏酸性的相关食品袁用于常温条件下保鲜和抗氧化遥参考文献1包怡袁 胡友明袁 朱林江袁 等.己糖氧化酶的研究进展J.食品与发酵工业袁 2021袁 47渊3冤院 218-223.BAO Y袁 HU Y M袁 ZHU L J袁 et al.Researchprogress on hexose oxidaseJ.Food and FermentationIndustries袁 2021袁 47渊3冤院 218-223.红藻源新型抗氧化剂己糖氧化酶的异源表达优化及酶学特性表征47中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期2IKAWA M袁 MA D S袁 MEEKER G B袁 et al.Use ofChlorella in mycotoxin and phycotoxin research J.Journal of Agricultural and Food Chemistry袁 1969袁17渊3冤院 425-429.3S覫E J B袁 PETERSEN L W袁 SOEE J B.Method ofreducing or preventing Maillard reactions in potatowith hexose oxidase院 US6872412B2P.2005-03-292022-02-18.4JR RAND A G.Direct enzymatic conversion of lac鄄tose to acid院 Glucose oxidase and hexose oxidaseJ.Journal of Food Science袁 1972袁 37渊5冤院 698-701.5ALMEIDA E L袁 CHANG Y K.Effect of the addi鄄tion of enzymes on the quality of frozen pre-bakedFrench bread substituted with whole wheat flourJ.LWT-Food Science and Technology袁 2012袁 49渊1冤院 64-72.6BEAN R袁 HASSID W.Carbohydrate oxidase from ared alga袁 Iridophycus flaccidumJ.Journal of Bi鄄ological Chemistry袁 1956袁 218渊1冤院 425-436.7JR SULLIVAN J D袁 IKAWA M.Purification andcharacterization of hexose oxidase from the red algaChondrus crispus J.Biochim Biophys Acta袁 1973袁309渊1冤院 11-22.8OGASAWARA K袁 YAMADA K袁 HATSUGAI N袁 etal.Hexose oxidase-mediated hydrogen peroxide as amechanism for the antibacterial activity in the redseaweed Ptilophora subcostataJ.PLoS One袁 2016袁11渊2冤院 e0149084.9WOLFF A M袁 HANSEN O C袁 POULSEN U袁 et al.Optimization of the production of Chondrus crispushexose oxidase in Pichia pastorisJ.Protein Expres鄄sion and Purification袁 2001袁 22渊2冤院 189-199.10STOUGAARD P袁 HANSEN O C.Hexose oxidase-encodingDNAsandmethodsofusethereof院US7745599B1P.2010-06-292022-02-18.11COOK M W袁 THYGESEN H V.Safety evaluation ofa hexose oxidase expressed in Hansenula polymorphaJ.Food and Chemical Toxicology袁 2003袁 41院 523-529.12HANSEN O C袁 STOUGAARD P.Hexose oxidasefrom theredalgaChondruscrispus院Purfication袁molecular cloning and expression in Pichia pastorisJ.JournalofBiologicalChemistry袁1997袁272渊17冤院 11581-11587.13CREGG J M袁 CEREGHINO J L袁 SHI J袁 et al.Recombinant protein expression in Pichia pastorisJ.Molecular Biotechnology袁 2000袁 16渊1冤院 23-52.14YANG Z L袁 ZHANG Z S.Engineering strategies forenhanced production of protein and bio-products inPichia pastoris院 A reviewJ.Biotechnol Adv袁 2018袁36渊1冤院 182-195.15郜赵伟.葡萄糖氧化酶基因密码子优化及其在毕赤酵母中的高效表达D.重庆院 西南大学袁 2010.GAO Z W.Codon optimization and high level ex鄄pression in Pichia pastorisof glucose oxidase D.Chongqin院 Southwest University袁 2010.16宣姚吉袁 周祥山袁 张元兴.实时荧光定量 PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数J.中国生物制品学杂志袁 2009袁 22渊12冤院 1236-1243.XUAN Y J袁 ZHOU X S袁 ZHANG Y X.Determina鄄tion of copy number of foreign gene in genome ofPichia pastoris by real-time fluorescent quantitativePCRJ.Chinese Journal of Biologicals袁 2009袁 22渊12冤院 1236-1243.Optimization of Heterologous Expression of Novel Antioxidant Hexose Oxidasefrom Red Alga and Its Enzymatic PropertiesMa Weilin袁Bao Yi袁Lu Yuele袁Zhu Linjiang*袁Chen Xiaolong渊College of Biotechnology and Bioengineering袁 Zhejiang University of Technology袁 Hangzhou 310014冤AbstractActive peptides or food enzymes with natural antioxidant function are green袁 safe and reliable袁 and have at鄄tracted wide interest as green and multifunctional food additives.Hexose oxidase渊HOX冤袁 a D-hexose院O21-oxidoreduc鄄tase袁 and has the functions of deoxygenation袁 acidification and improving protein crosslinking.In order to optimize theexpression strategies of hexose oxidase in Pichia pastoris袁 different genotype host strains袁 different gene expression modesand different gene copy number in transformants were systematically compared.The transformants with different genotypeswere obtained by the newly established three-step screening method袁 and their enzyme activities by fermentation were48第 23 卷 第 8 期compared.The results showed that Mutshost with slow methanol metabolism