5-2014-工作手册-第四章-第五节-食品添加剂.doc

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食品中环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）测定的标准操作程序
第一法气象色谱法适用于红葡萄酒中甜蜜素的测定，是否适合于葡萄酒及果酒。
第一法检出限问题，按照给出的最低标准系列浓度12.5µg/ml，结合食品的提取方法（固体稀释25倍，饮料骗敲仓旋肃钮钢遭墙臀诬辞章延糠错阮到栓艘嚷榔陕瓶票偿响树北零突鞘奇缕邻把却移逛巫行状定膘洞谎庶侠消仰园御吨林崭司礼苑悸晃剔狗较逸酪晒玉瘦趣必商吟柠挫苍扒寺腹蛰揉剃登壬琳饭群坚逊暇兔喀球牡蒲汕厅撩域妓花旁褥甄逮狞论苑惠坊郧吟蚤栖样宣粤稗佯玛甄醋纵诈膊撤胜朋岗娠航辕氛铂群郎啡疆换苑烟沁易霍檄炼岗跑漾渴阮秒线备似区似半谈稼喊酵驯缸愉涣游娶诅映钮放葡蓬孺再申诽芒众撂军捶背晓续精泊柱岳膳之镶太集柠压通硕痪吕壁正挂厅迷驰枝玫非霹榆吗唱峻逆寿咏韭疙掳览庶掖烩峭彬涎疗旦迎躲羚酉袜爽懊置耪淄罪朽昆穗忻寅腑岳扳遇衬论资锣郧尊凛5-2014-工作手册-第四章-第五节-食品添加剂础嘉计博誓墟泽论攫失蕾莱所洽仪奎抛蚌把肯隐酞泄曝辜碑孤剐乾忻肖腹嘴缚矣瑞掳盖咏咳傀献痉捅叫减蹋隧鲜贷倍歪舜甩碉燃团组馆隅搐卓广瞪闷伤飞警躬盈漆毙英犊彬飘琶尧蛊慢哺擎赴辰帮飘玩啡滋链彭抠盐燥坡责肾辰辰煎镇即忌快肥扮址粮尹凿汗娃凿蔑审尖蜂会牟计唱森桨忧灭卢孔逻缔回照督淳品昼瓦市券蓉艰楔眷脸假观篷凿掠樟埃冗铃搓留志庇揭务嘎喻苞拙隔晰波负羌动绍溯稳渗恰呐重阶陋拜诗牡跋阳酬芝沮钢史敦鸡纬灸疤蛙形恍靡赐裙晴央蓖袄鹃远涨节纠逸寐邓姿务碘鲁弱爸耕吊具滁椭膨敷堕赛隙饶兄贪膏讳龋黎颗氟豁罕颓蒸使赔栖撮逐底烦律省昭律瞄沁他稚汕身
食品添加剂方法需要讨论的问题

1 食品中环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）测定的标准操作程序
1.1 第一法气象色谱法适用于红葡萄酒中甜蜜素的测定，是否适合于葡萄酒及果酒。
1.2 第一法检出限问题，按照给出的最低标准系列浓度12.5µg/ml，结合食品的提取方法（固体稀释25倍，饮料浓缩2倍），固体检出限超过300mg/kg，偏高。
1.3 第二法质谱联用法没有明确的取样量，无法计算检出限。
2 亚硫酸盐
2.1 没有葡萄酒和果酒的方法
2.2 适用范围和后面的说明中不符，后面加标回收试验中提到各类食品，但前面没有提到。
2.3 第一法，没有定容体积，如何确定检测限。
3 合成着色剂方法
3.1 试样准备中，明确说明是配制酒类，是否可延伸至酒类，包括葡萄酒、果酒。
3.2 试样准备中，5.1.1.2，5.1.3.2用到的氨水、盐酸、乙酸是纯试剂还是溶液（试剂中还没有加上乙酸）。
3.3 手册方法中肉制品着色剂的提取，来源于GB9695.6-2008，该方法适用于肉制品中胭脂红的测定，是否适用于肉制品中各种着色剂的测定（从样品处理方法看，至少不适合赤藓红）。
3.4 净化后的待测液，有的调节pH，有的没有调节，是否需要调节。
4 硝酸盐、亚硝酸盐方法
4.1 没有咸菜的方法。
4.2 检出限的计算。
5 脱氢乙酸方法
没有葡萄酒和果酒的方法。5009.121气象色谱适用于果汁、腐乳、酱菜。23377适用于黄油、酱菜、发酵豆制品、面包、糕点、焙烤食品馅料、复合调味料、果蔬汁（其他食品可参照执行）。
6 共性问题
6.1 多个方法的试样准备中，取样量是一个范围，导致检出限不统一，方法中类似的情况是否有必要统一。
6.2 建议每个方法在限定进样量的前提下，明确仪器的最低检出浓度，以便于检出限的计算，并利于各地了解所用仪器的灵敏度。

第五节食品添加剂
1 食品中山梨酸、苯甲酸测定的标准操作程序
食品中山梨酸、苯甲酸的测定方法包括气相色谱法和液相色谱法，具体的标准操作程序如下：
A 气相色谱法
1 适用范围
本程序规定了食品中山梨酸、苯甲酸的气相色谱测定方法。
本程序适用于食品中山梨酸、苯甲酸的测定。
苯甲酸、山梨酸的仪器检出浓度均为0.1μg/mL。当液体取样量为2.5g时，苯甲酸、山梨酸的检出限为0.4mg/kg，定量限为1.2mg/kg；当固体取样量为10g时，苯甲酸、山梨酸的检出限为2mg/kg，定量限均为6mg/kg。
2 原理
试样酸化后，用乙醚提取山梨酸、苯甲酸，用附氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，与标准系列比较定量。
3试剂
实验用水均为去离子水，所用试剂除注明外均为分析纯。
3.1 乙醚：不含过氧化物。
3.2 石油醚：沸程30～60℃。
3.3 盐酸。
3.4 无水硫酸钠。
3.5 盐酸（1＋1）：取100mL盐酸，加水稀释至200mL。
3.6 氯化钠酸性溶液（40g/L）：取无水硫酸钠40g，加水稀释至1000mL，再加1mL盐酸（1＋1）酸化。
3.7 山梨酸、苯甲酸标准
山梨酸、苯甲酸标准物质应从具有资质的单位购买（如中国计量科学研究院），严格按要求保存使用。
3.8 山梨酸、苯甲酸标准储备液：准确称取山梨酸、苯甲酸各0.2000g，分别置于100mL容量瓶中，用石油醚－乙醚（3+1）混合溶剂溶解后并稀释至刻度。此溶液山梨酸或苯甲酸的浓度为2mg/mL。上述两种标准储备液，应保存于4℃。
3.9 山梨酸、苯甲酸混合标准使用液
吸取25.0mL的山梨酸、苯甲酸标准溶液于100mL容量瓶中，以石油醚－乙醚（3+1）混合溶剂稀释至刻度。此溶液山梨酸和苯甲酸的浓度均为500μg/mL。在4℃冰箱中保存，可稳定3个月。
3.10标准系列的配制
用山梨酸、苯甲酸混合标准使用液配制标准系列，浓度分别为0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、1.6μg/mL，标准系列临用前现配。
4 仪器与耗材
4.1 气相色谱仪：具有氢火焰离子化检测器。
4.2 水浴锅。
4.3 离心机。
4.4 旋涡振荡仪。
5 操作步骤
5.1 试样的制备
液体试样：酱油、果酱、饮料搅匀。
固体试样：取可食部位打碎、混匀。
5.2 试样的提取
液体试样直接称取2.50g置于30mL带盖的玻璃离心管中。固体试样称取10.00g置于100mL容量瓶中，加水60mL，超声振荡1小时，用水定容至刻度，从中取5.00mL于30mL带盖的琉璃离心管中。
向30mL带盖的玻璃离心管中加1.0mL盐酸（1+1）酸化，分别用15mL、10mL乙醚提取两次，每次旋涡振摇1分钟，以3000转/min离心5min，将上层乙醚提取液吸入25mL带塞的比色管中，合并乙醚提取液。用3mL氯化钠酸性溶液（40g/L）洗涤两次，静止15分钟，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入另一个25mL比色管中，加乙醚至刻度，混匀。准确吸取5mL乙醚提取液于5mL带塞刻度试管中，置于35℃水浴上用氮气吹干，加入2mL石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂溶解残渣，备气相色谱检测用。
5.3 仪器参考条件
根据仪器及色谱柱性能选择最佳条件，调试使之处于最佳状态。可参考以下条件。
色谱柱：DB-WAX 0.25mm×0.25μm×30m。
氮气：114kPa；氢气：32mL/min；空气：294mL/min（氮气、空气和氢气之比按各仪器型号不同选择各自的最佳比例条件）。
温度：进样口280℃；检测器300℃；柱温230℃。
进样体积：1.0μL。
5.4 标准曲线的制备
分别吸取0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、1.6μg/mL浓度的山梨酸、苯甲酸钠混合标准系列各1.0μL注入气相色谱仪，测其峰面积，制备标准曲线。
5.5 样品测定
吸取样液1.0μL注入气相色谱仪，根据保留时间定性，根据峰面积得到样液中山梨酸、苯甲酸钠的浓度。
6 计算
试样中山梨酸、苯甲酸含量按式（1）进行计算。
………………………………（1）
式中：X——试样中山梨酸或苯甲酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
A——测定用试样液中山梨酸或苯甲酸的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——加入石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂的体积，单位为毫升（mL）；
m——试样的质量，单位为克（g）；
5——测定时吸取乙醚提取液的体积，单位为毫升（mL）；
25——试样乙醚提取液的总体积，单位为毫升（mL）。
由测得苯甲酸的量乘以1.18，即为试样中苯甲酸钠的含量。
由测得山梨酸的量乘以1.34，即为试样中山梨酸钾的含量。
7精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的相对相差。食品中山梨酸、苯甲酸的相对相差参考值＜10%。
8 说明
8.1 食品中的杂质一般不产生干扰。若有干扰无法确定，建议降低柱温或载气的流速，使目标色谱峰的保留时间增加，更好的分离杂质。
8.2 所使用的标准曲线吸光度值与浓度的相关系数应≥0.995。
8.3 利用标准曲线测定样品浓度时，样品浓度必须在标准曲线的浓度范围内，否则要稀释，不得将标准曲线任意外延。
8.4 每测定20～30个样品应测定标准溶液，若测定的标准溶液结果落在给定范围以内，说明仪器是稳定的，样品检测结果准确可靠。若测定的标准溶液结果落在给定范围之外，应立即中断实验，之前所测样品结果视为无效，必须重新测定。
8.5 更换色谱柱会改变灵敏度，因此，每次更换色谱柱时须重新进行控制校正，并重新制备标准曲线。
8.6 无水乙醚中过氧化物检查方法：用5mL乙醚加lmLl0%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉溶液，水层呈蓝色。
8.7 山梨酸、苯甲酸的加标回收率参考值85%～115%。
B 液相色谱法
1适用范围
本程序规定了食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的液相色谱法测定方法。
本程序适用于食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的测定。
苯甲酸、山梨酸、糖精钠的检出限均为0.3μg/mL。当汽水饮料取样量为5ｇ，酱油、果汁、果酱取样量为20g，进样50μL时，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的检出限为0.3mg/kg，定量限为1mg/kg；当配制酒类取样量为10g，进样50μL时，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的检出限为0.15mg/kg，定量限为0.5mg/kg；当糕点、饼干、蜜饯、油脂类取样量为5g，进样50μL时，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的检出限为1.2mg/kg，定量限为4mg/kg。
2原理
试样中山梨酸、苯甲酸、糖精钠提取后经反相高效色谱C18柱分离，根据保留时间定性、峰面积定量。
3试剂
除色谱用水为色谱级外，其余实验用水均为去离子水，所用试剂除注明外均为分析纯。
3.1 甲醇：色谱纯。
3.2氨水（1+1）：氨水加水等体积混合。
3.3 0.02mol/L乙酸铵溶液：称取1.54g乙酸铵，以去离子水溶解稀释到1000mL。
3.4碳酸氢钠溶液（20g/L）：称取2g碳酸氢钠（优级纯），加水至100mL，振摇溶解。
3.5 0.5mol/L盐酸溶液：量取45mL盐酸加入适量水，稀释到1000mL。
3.6 0.02mol/L氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠，以去离子水溶解稀释到1000mL。
3.7乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3mL乙酸,加水溶解至100mL。
3.8亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解至100mL。
3.9乙醚：分析纯。
3.10山梨酸、苯甲酸、糖精钠标准
山梨酸、苯甲酸、糖精钠标准物质应从具有资质的单位购买（如中国计量科学研究院），严格按要求保存使用。
3.11山梨酸、苯甲酸、糖精钠标准储备液：精密称取山梨酸标准品0.1000g，加入碳酸氢钠溶液（20g/L）5mL，加热溶解后，移入100mL容量瓶中，并加水定容，成浓度为1.00mg/mL的标准储备液。苯甲酸、糖精钠标准储备液配制同上。上述三种标准储备液，应保存于4℃。
3.12 山梨酸、苯甲酸、糖精钠混合标准使用液
吸取1.00mg/mL的山梨酸、苯甲酸、糖精钠标准储备液各10.0mL，用去离子水定容到100mL，成为浓度为0.100mg/mL的混合标准使用液。在4℃冰箱中保存，可稳定3个月。
3.13 标准系列的配制
分别吸取混合标准使用液0.50mL、2.50mL、5.00mL、10.00mL、25.00mL于50mL容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的山梨酸、苯甲酸、糖精钠混合标准系列。标准系列临用前现配。
4仪器与耗材
4.1 高效液相色谱仪，附紫外检测器。
4.2 超声清洗仪（样品提取及溶剂脱气用）。
5操作步骤
5.1 样品处理
5.1.1汽水饮料
称取试样5.00g，加热去除二氧化碳，用氨水（1+1）调pH≈7，置于25mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀后，通过微孔滤膜过滤，滤液待用。
5.1.2酱油、果汁、果酱
称取试样20.0g置于100mL容量瓶里，用氨水（1+1）调pH≈7，加水至刻度，摇匀后，通过微孔滤膜过滤，滤液待用。
5.1.3配制酒类
称取试样10.00g左右，加热去除乙醇，用氨水（1+1）调pH≈7，放入25mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀后，通过微孔滤膜过滤，滤液待用。
5.1.4糕点、饼干、蜜饯类
固体样品去除非可食部位后粉碎、混匀，称取5.0g，放入100mL烧杯中，加水30mL，摇匀后，超声30min，加入乙酸锌溶液、亚铁氰化钾溶液各2mL，摇匀后，静置，取上清液，经滤纸过滤于100mL容量瓶中，加水至刻度，通过微孔滤膜过滤，滤液待用。
5.1.5油脂类
称取5.0g试样，置于100mL烧杯中，加0.02mol/L氢氧化钠溶液30mL，摇匀后，超声30min，转移于125mL分液漏斗中，放入乙醚20mL，震荡，静置15min，取下层溶液于100mL容量瓶中，0.5mol/L盐酸溶液调至pH≈7，加水至刻度，摇匀后，通过微孔滤膜过滤，滤液待用。
5.2 仪器参考条件
根据仪器及色谱柱性能选择最佳条件，调试使之处于最佳状态。可参考以下条件。
色谱柱：DiamonsiL C18色谱柱（150×4.6mm，5µm）。
流动相：甲醇+0.02moL/L乙酸铵溶液（3+97，V/V）。
流速：1mL/min。
柱温：35℃。
紫外检测波长：230nm。
分析时间：19.0min。
进样体积：10μL。
色谱图如图1所示，出峰顺序依次为苯甲酸、山梨酸、糖精钠。

图1苯甲酸、山梨酸和糖精钠的标准色谱图
5.3 标准曲线制备
分别吸取1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL浓度的山梨酸、苯甲酸、糖精钠混合标准系列各10μL注入液相色谱仪，测其峰面积，制备标准曲线。
5.4 样品测定
吸取样液10μL注入液相色谱仪，根据保留时间定性，根据峰面积得到样液中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的浓度。
6 计算
试样中山梨酸、苯甲酸、糖精钠含量按式（2）进行计算。
………………………………（2）
式中：X——试样中山梨酸、苯甲酸或糖精钠的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
A——测定用试样液中山梨酸或苯甲酸、糖精钠的质量，单位为纳克（ng）；
V1——提取液的总体积，单位为毫升（mL）；
V2——测定时进样的体积，单位为微升（μL）；
m——试样的质量，单位为克（g）。
由测得苯甲酸的量乘以1.18，即为试样中苯甲酸钠的含量。
由测得山梨酸的量乘以1.34，即为试样中山梨酸钾的含量。
7 精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的相对相差。食品中山梨酸、苯甲酸钠、糖精钠的相对相差参考值＜10%。
8 说明
8.1 食品中的杂质一般不产生干扰。若有干扰无法确定，建议使用二极管阵列检测器，对疑问峰的波谱进行扫描判定。有干扰时可降低甲醇的比例，使目标色谱峰的保留时间增加，更好的分离杂质。也可以用乙酸调节流动相的pH为4.0，再进行检测，此时山梨酸、苯甲酸钠、糖精钠出峰顺序发生变化。
8.2 国家标准物质研究中心可提供苯甲酸标准储备液（1.00mg/mL±1%）、糖精钠标准储备液（1.00mg/mL±1%）。
8.3 所使用的标准曲线吸光度值与浓度的相关系数应≥0.995。
8.4 利用标准曲线测定样品浓度时，样品浓度必须在标准曲线的浓度范围内，否则要稀释，不得将标准曲线任意外延。
8.5 每测定20～30个样品后最好应测定标准溶液，若测定的标准溶液结果落在给定范围以内，说明仪器是稳定的，样品检测结果准确可靠。若测定的标准溶液结果落在给定范围之外，应立即中断实验，之前所测样品结果视为无效，必须重新测定。
8.6 液相色谱测定食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠时，由于基质复杂，建议使用保护柱。
8.7 更换色谱柱会改变灵敏度，每次更换色谱柱时须重新进行控制校正，并重新制备标准曲线。
8.8 新购买的甲醇，最好要做验收实验，波谱扫描结果符合色谱级要求。
8.9 山梨酸、苯甲酸、糖精钠的加标回收率参考值85%～115%。

2 食品中山梨酸、苯甲酸、安赛蜜、阿斯巴甜、糖精钠测定的标准操作程序
食品中山梨酸、苯甲酸、安赛蜜、阿斯巴甜、糖精钠测定的高效液相色谱法标准操作程序如下：
1 适用范围
本程序规定了普通蛋糕、酱菜、酒类、饮料、乳与乳制品中山梨酸、苯甲酸、安赛蜜、阿斯巴甜、糖精钠的高效液相色谱测定方法。
本程序适用于普通蛋糕、酱菜、酒类、饮料、乳与乳制品中山梨酸、苯甲酸、安赛蜜、阿斯巴甜、糖精钠的高效液相色谱法测定。
方法检出限和定量限如表1所示。
表1 方法的检出限和定量限（mg/kg）
样品类型
检出限
定量限
固态样品（糕点、酱菜）、固体乳制品
8
24
液态样品（饮料、酒类）
5
15
液态乳
4
12
2 原理
样品中山梨酸、苯甲酸、安赛蜜、阿斯巴甜、糖精钠经提取后，液相色谱测定，根据保留时间及特征光谱定性，外标法定量。
3试剂
3.1 乙腈（色谱纯）
3.2 磷酸二氢钾（分析纯）
3.3 冰乙酸（优级纯）
3.4 超纯水
3.5 20mmol/L磷酸二氢钾溶液：1.36g无水磷酸二氢钾，用水定容至500mL。
3.6标准储备液
用10%的甲醇-水溶液，分别称取一定量的山梨酸、苯甲酸、安赛蜜、阿斯巴甜、糖精钠固体标准品，配制成1.0mg/mL的标准储备液。标准储备液可密闭冷藏（4℃）保存1个月。
3.7混合标准使用液
准确吸取储备液各5.0mL于50.0mL容量瓶中，用10%的甲醇-水溶液稀释定容至50mL。此混合标准溶液中各种物质的浓度均为100μg/mL。混合标准使用液可冷藏（4℃）保存2周。
3.8标准系列的配制
将混合标准使用液用纯水稀释配制标准系列。浓度系列为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL。此标准系列现用现配。
4 仪器与耗材
4.1 高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器。
4.2 涡旋振荡器
4.3 高速离心机
5 操作步骤
5.1 样品处理
5.1.1固态样品（普通蛋糕、酱菜）
将样品粉碎均匀，准确称取5.00g样品于50mL离心管中，加入40.0mL水，涡旋振荡1min后超声提取15min，以5000rpm离心10min，取上清液（应避免液面的油脂）0.45μm滤膜过滤，上机测定。
5.1.2液态样品（饮料、酒类）
准确称取2.00g样品于15mL离心管中，加水至10mL，混匀后过0.45μm滤膜，上机测定。
5.1.3乳与乳制品
5.1.3.1 称取液态乳制品10.00g于50mL离心管中，加入50μL冰乙酸，加水至40mL，涡旋振荡1min后超声提取15min，以5000rpm离心10min，取上清液过0.45μm滤膜，上机测定。
5.1.3.2 固体乳制品准确称取5.00g于50mL离心管中，用40.0mL水溶解样品，加入100μL冰乙酸，涡旋振荡后超声15min，以5000rpm离心10min，取上清液过0.45μm滤膜，上机测定。
5.2 仪器参考条件
5.2.1色谱柱： Inertsil ODS-3 （250 mm´4.6mm，5µm）
或迪马钻石（II） C18 色谱柱（250 mm´4.6mm，5µm）
或Shim-pack VP-ODS（150 mm´4.6mm，4.6µm）
5.2.2流动相：A：乙腈；B：20mmol/L磷酸二氢钾
5.2.3检测波长：山梨酸、苯甲酸、安赛蜜检测波长为225nm，阿斯巴甜、糖精钠检测波长为205nm。
5.2.4流速：1.0mL/min
5.2.5柱温：40℃
5.2.6进样体积：10µL
5.2.7梯度洗脱，如表2所示。
表2 梯度洗脱条件
流动相组分
比例（%）
0min
8min
9min
11min
12min
20min
乙腈
10
45
70
70
10
10
水-磷酸二氢钾溶液
90
55
30
30
90
90
6 计算

7精密度
在正常使用状态下，上述食品添加剂在重复性条件下获得的两次独立测定结果相对差值不得超过10%。
8 说明
8.1 如发现样品中有与待测定物质同时出峰，且该物质峰形在光谱扫描图上与标准谱图有差别的可采用改变流动相的成分或比例进行分离测定。
8.2 本标准操作程序不适用于同时含有苯甲酸、咖啡因的样品，如可口可乐等，建议对该类样品进行苯甲酸、糖精钠检测时采用GB/T 5009.28-2003和GB/T 5009.29-2003的方法。
8.2 回收率范围85%～110%。

3食品中环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）测定的标准操作程序
食品中环己基氨基磺酸钠测定方法包括气相色谱法和液相色谱质谱联用法，具体的标准操作程序如下：
A气相色谱法
1 适用范围
本程序规定了饮料（可口可乐、雪碧、冰红茶、冰绿茶、鲜橙多等）、红葡萄酒和凉果（话梅干、杏脯、乌梅、九制陈皮、无花果、芒果干等）等食品中环己基氨基磺酸钠的测定方法。
本程序适用于饮料（可口可乐、雪碧、冰红茶、冰绿茶、鲜橙多等）、红葡萄酒和凉果（话梅干、杏脯、乌梅、九制陈皮、无花果、芒果干等）等食品中环己基氨基磺酸钠的测定。
本方法的检出限为1mg/kg，定量限为3.5mg/kg。
2 原理
在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠反应，生成环己醇亚硝酸酯，气相色谱分离，保留时间定性，外标法定量。
3 试剂
以下试剂除特别说明外均为分析纯。
3.1 10%硫酸溶液(v/v)
3.2 10%亚硝酸钠溶液：现用现配。
3.3 1mol/L氢氧化钠溶液
3.4 正己烷
3.5 标准物质
甜蜜素标准物质：DIMA TECHNOLOGY INC.，＞99.0%，或者中国计量科学研究院产品GBW(E)100066，纯度99.3%，或其他等同产品。
3.6标准溶液的配制
3.6.1标准储备溶液：准确称取甜蜜素标准品0.5000g，纯水定容至100mL，浓度为5.00mg/mL，冰箱冷藏保存2周。
3.6.2 标准系列的配制
按表1分别吸取一定量的标准储备液（3.6.1）于50mL比色管，加水至20mL。
表 1标准系列配制
管号
1
2
3
4
5
6
7
标准储备液体积，mL
0.05
0.10
0.20
0.40
1.00
2.00
4.00
所含甜蜜素质量，mg
0.25
0.50
1.0
2.0
5.0
10.0
20.0
4 仪器与耗材
4.1 气相色谱仪：带氢火焰离子化检测器。
4.2 超声波振荡器
4.3 离心机
5 样品处理
5.1 饮料（可口可乐、雪碧、冰红茶、冰绿茶、鲜橙多等）：无需处理，直接称取样品20.0g于50mL比色管。
5.2 红葡萄酒：准确称取10.0g样品于50mL比色管，用1mol/L氢氧化钠调至碱性，沸水浴30min，加水至20mL。
5.3 固态样品：取样品可食部分切碎至1mm～2mm颗粒，准确称取2.0g于100mL容量瓶中，用纯水定容，浸泡过夜。混匀，取20.0mL于50mL比色管。
6 衍生
向盛有标准系列或样品溶液的比色管中加入10%亚硝酸钠溶液2.5mL和10%硫酸溶液3.5mL，摇匀，加盖（注意放气），在冰水浴中超声30min，加入正己烷10.00mL，振摇100次，正己烷层供气相色谱分析。
7仪器参考条件
7.1 色谱柱：OV‐101 30m×0.32mm×0.2μm，(或其它非极性二甲基聚硅氧烷高性能通用色谱柱，如DB 1、DB 5、Rtx 1、Rtx 5 等)。
7.2 柱温：80℃；进样口温度：150℃；检测室温度：200℃。
7.3 载气（氮气）流速：2.6mL/min；氢气流速：30mL/min；空气流速：30mL/min；尾吹气（补充气，氮气）流速：200mL/min；
7.4分流比：10:1；
7.5进样体积：1.0μL。
8测定
参照仪器参考条件，将气相色谱仪调节至最佳测定状态，测定标准系列及样品，以保留时间定性，以测得的峰面积对甜蜜素质量(mg)绘制标准曲线。标准色谱图如图1，按A、B两峰之和进行计算。

图1 甜蜜素标准色谱图
9计算
9.1 液体试样中甜蜜素含量按式（1）进行计算。
………………………………（1）
式中：

X
-
样品中甜蜜素的含量，单位为克每千克（g/kg）；
m1
-
测定用试样中甜蜜素的质量，单位为毫克（mg）；
m
-
取样量，单位为克（g）。
9.2 固体试样中甜蜜素含量按式（2）进行计算。
………………………………（2）
式中：

X
-
样品中甜蜜素的含量，单位为克每千克（g/kg）；
m1
-
测定用试样中甜蜜素的质量，单位为毫克（mg）；
m
-
取样量，单位为克（g）
V
-
定容体积，单位为毫升（mL）；
V1
-
取样体积，单位为毫升（mL）。
10精密度
于不同样品中分别进行不同浓度的加标回收试验，液体样品回收率为90%～110%，RSD≤5%，固体样品回收率为85%～115%，RSD≤10%。
11说明
11.1 样品衍生
11.1.1 乳化：用正己烷提取后多数样品有乳化现象，一般静置15min即有好转，不必特殊处理。但部分样品，如红葡萄酒的取样量在1g至20g之间均乳化且静置无效，对于此类样品，4000rpm离心10min即可。离心前可以将玻璃比色管中的液体振摇后迅速倒入聚乙烯离心管，用聚乙烯离心管离心，但衍生反应不能在聚乙烯离心管中进行，否则响应值会降低。对于严重乳化的样品，必须立即离心破乳，如果仅从乳化层上部吸出少量正己烷测定，回收率降低；如果离心时间延长，回收率会升高。
11.1.2 试剂用量：原标准方法采用100g/L硫酸，配制时较不易掌握，故改用10%（v/v）硫酸溶液。本法甜蜜素的衍生产物有多种，在谱图中有4个峰与甜蜜素浓度呈正相关，挑选其中最高的峰作为定性依据。为了尽可能提高并稳定该物质的产率，对硫酸和亚硝酸钠用量进行2因素4水平正交试验，结果表明，增加硫酸用量可以显著降低其余3个峰的产率，并可减轻乳化现象；10%亚硝酸钠的用量在1.5mL～3.0mL对衍生无显著影响，但超过3mL则正己烷层明显变黄。因此，确定衍生试剂用量为10%硫酸溶液3.5mL，10%亚硝酸钠溶液2.5mL。
11.1.3 氯化钠：氯化钠的加入与否对测定结果未见显著影响。
11.1.4 除醇：红葡萄酒样品必须除醇，否则回收率会降低15%。除醇前需加入1mol/L氢氧化钠，使红葡萄酒变为绿色（此时pH=8左右）。
11.1.5 为减少沸点较低的待测物质挥发损失，建议在尽可能低的温度下进行衍生。
11.2 仪器测定
11.2.1 进样针清洗溶剂：直接采用正己烷作为洗针溶剂很容易将进样针粘塞，造成其损坏，改为丙酮较好。
11.2.2 正己烷提取液粘度较大造成进样精密度较差，可以将自动进样器“粘度补偿时间（即进样针在样品溶液中的停留时间）”设置为2秒左右予以补偿。手工进样时同样处理即可。
11.2.3 提取溶剂的选择：各种类似极性的溶剂均可使用，例如正己烷、环己烷、正庚烷或三氯甲烷，建议使用正己烷。
11.2.4 样品的正己烷提取液须马上测定，并在尽短的时间内测定完毕。随时间延长，环己醇峰逐渐提高。
11.2.5 蜜饯类和凉果类中甜蜜素的现行卫生标准限值分别为1g/kg和8g/kg，目前在此类样品中常出现含量过高的样品，超出标准曲线范围，故建议标准曲线范围选择卫生标准最高限值的0.5～5倍。文中所列的标准储备液浓度和标准系列浓度均可根据实际情况进行修改，以满足不同样品的需要。
11.2.6 气相色谱载气通常用氮气，分析时间约为8min，若采用氦气，在其它色谱条件不变的情况下分析时间不超过4min，对缩短分析时间和提高检出限有利。如果条件许可，建议采用高纯氦为载气。
B 液相色谱质谱联用法
1 适用范围
本程序规定了饮料、酒类、凉果和罐头等食品中环已基氨基磺酸钠含量的液相色谱质谱联用测定方法。
本程序适用于饮料、酒类、凉果和罐头等食品中环已基氨基磺酸钠含量的测定。
本方法校正曲线浓度范围为50ng/mL-5000ng/mL。方法的检测限2.6ng/mL，测定限8ng/mL。
2 原理
试样提取后，利用内标法，用液相色谱质谱联用法进行分离，与标准系列比较定量。
3 试剂及材料
3.1 Tris：分析纯。
3.2 甲酸：分析纯。
3.3 三乙胺：分析纯。
3.4 二丁基胺：分析纯。
3.5 甜蜜素：标准品，纯度≥99%。
3.6 硫普罗宁(Tiopronin)：内标，纯度≥99%。
3.7 内标储备液：称取硫普罗宁10.0mg转移至100mL容量瓶中，用水定容，作为内标储备液。保存在-40℃，用时取出。
3.8 标准储备液：称取10.0mg甜蜜素转移至10mL容量瓶中，用水定容，作为标准储备液。保存在-40℃，用时取出。
3.9 标准系列工作液，配制50ng/mL-5000ng/mL的甜蜜素标准系列，并使每个标准系列中内标的浓度为60ng/mL。保存在-40℃，用时取出。
4 仪器
4.1 LC-MS：电喷雾(ESI)电离源和四级杆质量分析器。
4.2 高速低温离心机。
4.3 旋涡混合仪。
5 操作步骤
5.1 试样处理
5.1.1低含水量样品，加入定量的水后捣碎，加入内标液(注意维持在最终的样品液中内标浓度为60ng/mL)，样品在超声波水浴中提取20min，12000r/min、4℃下离心10min，上清液过0.45μm滤膜。
5.1.2固液混合样品(如水果罐头)，在匀浆机中捣碎，其余同上。
5.1.3液体样品加入内标后过滤。
5.2 测定条件
5.2.1色谱柱：Johnson Spherigel C8色谱柱，150mm×4.6mm，5μm。
5.2.2流动相：含5mMTris的甲酸水溶液(pH 4.5)。
5.2.3柱温：30℃。
5.2.4流速：1.0mL/min，每个样品分析完后需用甲醇冲洗色谱柱5min，用流动相平衡色谱柱10min。
5.2.5负离子模式[M-H]—采集质谱数据，m/z采集范围为70-350。硫普罗宁、甜蜜素的准分子离子峰[M-H]—分别为162.3、178。
5.2.6脱溶剂气和锥孔气流速分别为200L/h、50L/h。
5.2.7源温度和脱溶剂温度分别为120℃、300℃。
5.2.8毛细管电压和锥孔电压分别为4.5kV、50V。
5.2.9萃取电压为5V。
5.2.10 RF透镜电压为0.5V。
5.3 谱图

6 计算
按式（1）用内标法计算样品中甜蜜素的含量。
………………………………（1）
式中：X——试样中甜蜜素含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
A——试样色谱峰与内标色谱峰的峰面积比值对应的甜蜜素质量，单位为微克（μg）；
f——试样溶液的稀释倍数；
m——试样的取样量，单位为克（g）。
7 精密度
于不同样品中分别进行不同浓度的加标回收试验，样品回收率为92～107％，RSD≤8％。
8 说明
8.1 图谱上可以看到各目标化合物[M-H]—离子的单极质谱峰，各化合物的[M-H]—离子可以作为母离子及内标化合物使用。
8.2 ESI过程比较复杂，溶剂和添加成分的性质，如挥发性、粘度等均会影响离子化程度和信号强度。
8.3 液质电喷雾电离模式下，流动相的选择受到限制，由于要用到极性溶剂和挥发性添加物，因此在配制流动相时要兼顾质谱电离和液相分离各自的效果。
8.4当使用乙腈作为有机相时，分离效果不如甲醇理想。在缓冲溶液-甲醇流动相体系中，加入丙酮可增加甜味剂的ESI响应。这是因为电喷雾电离过程中，一旦初始带电液滴形成，液滴转化为气态离子的能力取决于溶剂的表面张力和挥发性能。丙酮的表面张力和挥发性能分别为23.7mN/m和0.316mPa S (25℃)，远远低于甲醇(45.1 mN/m和0.595 mPa·S (25℃))。加入丙酮，可提高电离效率。
5 食品中亚硫酸盐测定的标准操作程序
食品中亚硫酸盐的测定方法包括离子色谱法和蒸馏法，具体的标准操作程序如下：
A 离子色谱法
1 适用范围
本程序规定了粉丝(条)、腐竹、干制水产品等等食品中亚硫酸盐的测定方法。
本程序适用于粉丝(条)、腐竹、干制水产品等等食品中亚硫酸盐含量的测定。
本程序中离子色谱法测定亚硫酸盐的仪器灵敏度为0.28ng，当取2.5g样品时的检出限为0.5mg/kg。
2 原理
食品中的亚硫酸盐在酸性条件下被蒸馏出来，用碱溶液吸收SO2生成SO32-。溶液中的SO32-等阴离子随淋洗液进入离子交换柱系统，交换剂对阴离子有不同的亲和力而将阴离子分离，流经抑制系统转换成具有高电导的强酸，采用电导检测器检测，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。
3 试剂
使用的试剂除特别说明外均为分析纯，水为去离子水，经0.45µm滤膜过滤后使用。
3.1 亚硫酸钠
3.2 碳酸钠，优级纯
3.3 碳酸氢钠，优级纯
3.4 氢氧化钠
3.5 甲醛，优级纯
3.6 50%（w/w）氢氧化钠溶液：称取一定量氢氧化钠，缓慢加入等量的水，放置至室温后即可使用。
3.7 淋洗液：碳酸氢钠［cNaHCO3=1.7 mmol］-碳酸钠［cNa2CO3=1.8 mmol］溶液：称取0.5712g碳酸氢钠和0.7632g碳酸钠，溶于水中，并用水定容至1000mL。
3.8 SO32-标准储备液：称取0.2653g亚硫酸钠，用少量水溶解，加入0.5mL 37%甲醛，加水定容到100mL，摇匀，即为1000.