基因重组与分子生物学技术.ppt

第八章第八章 基因重组与分子生物学技术基因重组与分子生物学技术 1编辑ppt一、基因重组技术一、基因重组技术1基因重组技术的概念基因重组技术的概念2基因重组技术基本原理基因重组技术基本原理3基因重组技术与医学的关系基因重组技术与医学的关系二、分子生物学常用技术二、分子生物学常用技术1.1.核酸分子杂交与探针技术核酸分子杂交与探针技术 2.2.分子印迹技术分子印迹技术 3.3.聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术 4.DNA4.DNA序列分析技术序列分析技术 学习要点：学习要点：2编辑ppt第一节第一节 基因基因重组技术重组技术 n重重 组组 DNA技技 术术 又又 称称 为为 基基基基 因因因因 工工工工 程程程程（genetic engineering）或）或分子克隆分子克隆分子克隆分子克隆 (molecular cloning)。3编辑pptn n基因重组基因重组基因重组基因重组 (gene recombination):DNA片片段段在在细细胞胞内内、细细胞胞间间，甚甚至至在在不不同同物物种种之之间间进进行行交交换换，交交换换后后的的片片段段仍仍然然具具有有复制和表达的功能。复制和表达的功能。n n基因工程基因工程基因工程基因工程 (genetic engineering）:采采用用人人工工方方法法将将不不同同来来源源的的DNA进进行行重重组组，并并将将重重组组后后的的DNA引引入入宿宿主主细细胞胞中中进进行行增增殖殖或或表达的过程。表达的过程。4编辑ppt相关实验：相关实验：1964 1964年年GurdonGurdon等进行的非洲爪蟾实验等进行的非洲爪蟾实验 1970 1970年年StewardSteward等用悬浮培养的胡萝卜单个等用悬浮培养的胡萝卜单个 细胞培养成可育的胡萝卜植株。细胞培养成可育的胡萝卜植株。1997 1997年英国学者克隆出年英国学者克隆出“多莉多莉”羊羊 5编辑ppt一、基因重组基本过程一、基因重组基本过程 载体和目的基因的载体和目的基因的分分分分离；离；载体和目的基因的载体和目的基因的切切切切断；断；载体和目的基因的重组载体和目的基因的重组(接接接接)；重组重组DNA的的转转转转化和扩增；化和扩增；重组重组DNA的的筛筛筛筛选和鉴定。选和鉴定。6编辑pptVector TargetDNARecombinantplasmid/DNAClone7编辑ppt8编辑ppt (一一)DNA)DNA重组技术中最常用的工具酶重组技术中最常用的工具酶酶类酶类主要用途主要用途限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别识别DNADNA特定序列，切断特定序列，切断DNADNA链链DNADNA聚合酶聚合酶I I 缺口平移制作标记缺口平移制作标记DNADNA探针探针 合成合成cDNAcDNA的第二链的第二链填补双链填补双链DNA3DNA3末端末端DNADNA序列分析序列分析 耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶（Taq DNApolTaq DNApol等）等）聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）DNADNA连接酶连接酶连接两个连接两个DNADNA分子或片段分子或片段二、工具酶二、工具酶9编辑ppt（二）限制性核酸内切酶作用特点（二）限制性核酸内切酶作用特点（二）限制性核酸内切酶作用特点（二）限制性核酸内切酶作用特点产生产生5突出粘性末端突出粘性末端(cohesiveend):以以EcoR I为例：为例：5GAATTC35G-pTTAAC33CTTAAG53CTTAAp-OHG510编辑ppt产生产生3突出的粘性末端：突出的粘性末端：以以Pst为例：为例：5CTGCAG35CTGCAOH-pG33GACGTC53Gp-OHACGTC511编辑ppt产生平末端产生平末端(bluntend):Nru 为例：为例：5GTTAAC35GTTOH-pAAC33CAATTG53CAAp-OHTTG512编辑ppt限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)在重组DNA技术中有重要地位13编辑ppt限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近近1800多种，可根据它们对多种，可根据它们对DNA有不同的识有不同的识别序列和切割特征选用，从而为基因工程提别序列和切割特征选用，从而为基因工程提供有力工具。供有力工具。14编辑ppt配伍末端：配伍末端：识别序列不同，但切割识别序列不同，但切割DNA后产生相同后产生相同类型的粘性末端。类型的粘性末端。15编辑ppt 三、载体三、载体 基因工程中常用的载体基因工程中常用的载体(vector)主要包括主要包括质粒质粒质粒质粒(plasmid)、噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体(phage)和和病毒病毒病毒病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。标志基因、单一的限制酶切点等。16编辑ppt1 1质粒质粒质粒质粒n是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的色体之外的双链环状双链环状DNA，具有，具有独立复制独立复制的的能力，通常带有细菌的能力，通常带有细菌的抗药基因抗药基因抗药基因抗药基因。n最最早早使使用用的的质质粒粒DNA是是人人工工构构建建的的pBR322，该该质质粒粒分分子子大大小小为为4.3kb，带带有有抗抗四四环环素素和和抗抗氨氨苄苄青青霉霉素素基基因因，含含EcoR，BamH，Hind等单一的限制酶切点。等单一的限制酶切点。17编辑ppt质粒质粒pUC19的分子结构的分子结构18编辑ppt2噬菌体噬菌体n可可 通通 过过 转转 染染 方方 式式 将将 其其DNA送送入入细细菌菌体体内内进进行行增增殖殖。常常用用的的为为人人工工构构建建的的噬噬菌菌体体载载体体。噬噬菌菌体体两两端端的的片片段段对对于于其其包包装装是是必必需需的的，因因而而应应予予保保留留；而而其其中中间间部部分分则则可可进进行行改改造造或或置置换换，使使之之具具有有某某种种单单一一的的限限制制酶酶切切点点。目目的的基基因因与与噬噬菌菌体体DNA进进行行重重组组时时，可可采采用用插插入入重重组组方方式式，也也可可采采用用置置换换重重组组方式方式。19编辑ppt3病毒病毒n常用的为常用的为SV40，通过感染方式将其，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。用相对较少。20编辑ppt理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。有较高的自主复制能力。容易进入宿主细胞，而且进入效率越高容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。越好。容易插入外来核酸片段，插入后不影响容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。其进入宿主细胞和在细胞中的复制。容易从宿主细胞中分离纯化出来。容易从宿主细胞中分离纯化出来。有容易被识别筛选的标志。有容易被识别筛选的标志。21编辑ppt第二节第二节 基因工程操作步骤基因工程操作步骤 22编辑ppt 一、目的基因的获得一、目的基因的获得目目的的基基因因的的筛筛选选和和分分离离可可采采用用以以下下方方法法进进行：行：1直接从染色体直接从染色体DNA中分离：中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。23编辑ppt2人工合成人工合成n根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。合成。适应于编码小分子多肽的基因。24编辑ppt3.从从mRNA合合成成cDNAn采采用用一一定定的的方方法法钓钓取取 特特 定定 基基 因因 的的mRNA，再再通通过过逆逆转转录录酶酶催催化化合合成成其其互互补补DNA（cDNA），除除去去RNA链链后后，再再用用DNA聚聚合合酶酶合合成成其其互互补补DNA链链，从从而而得得到到双双链链DNA。这这一一方方法法通通常常可可得得到到可可表表达达的的完完整整基基因。因。25编辑ppt4从基因文库中筛选从基因文库中筛选n将将某某一一种种基基因因DNA用用适适当当的的限限制制酶酶切切断断后后，与与载载体体DNA重重组组，再再全全部部转转化化宿宿主主细细胞胞，得得到到含含全全部部基基因因组组DNA的的种种群群，称为称为G文库文库(genomic DNA library)。n将将某某种种细细胞胞的的全全部部mRNA通通过过逆逆转转合合成成cDNA，然然后后转转化化宿宿主主细细胞胞，得得到到含含全全部部表表达达基基因因的的种种群群，称称为为C-文文库库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。文库具有组织细胞特异性。26编辑ppt基因组文库的制作基因组文库的制作27编辑ppt5利用利用PCR合成合成n如如已已知知目目的的基基因因两两端端的的序序列列，则则可可采采用用 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应（polymerase chain reaction,PCR）技技术术，在在体体外外合合成成目目的的基基因因。但但此此法法可可能能会会造造成成克克隆隆的的目目的的基基因因碱碱基基序序列列的的改变。改变。28编辑ppt二、载体和目的基因的切断（切）二、载体和目的基因的切断（切）n通通 常常 采采 用用 限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶(restriction endonuclease)，简简称称限限制制酶酶，分分别别对对载载体体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。和目的基因进行切断，以便于重组。n限限制制酶酶目目前前已已经经发发现现400多多种种，所所识识别别的的顺顺序序往往为往往为4-8个碱基对，且有个碱基对，且有回文结构回文结构。n由由限限制制酶酶切切断断后后的的末末端端可可形形成成平平端端、3-突突出出粘粘性性末末端端和和5-突突出出粘粘性性末末端端三三种种情情况况。形形成成粘粘性性末末端端(cohesive end)者者较较有有利利于于载载体体DNA和和目的基因的重组。目的基因的重组。29编辑ppt三、载体和目的基因的重组（接）三、载体和目的基因的重组（接）n即即将将带带有有切切口口的的载载体体与与所所获获得得的的目目的的基基因因连连接接起来，得到重新组合后的起来，得到重新组合后的DNA分子。分子。（一）黏性末端连接法：（一）黏性末端连接法：n当当载载体体DNA和和目目的的基基因因均均用用同同一一种种限限制制酶酶进进行行切切断断时时，二二者者即即可可带带有有相相同同的的粘粘性性末末端端。如如将将载载体体与与目目的的基基因因混混合合在在一一起起，二二者者即即可可通通过过粘粘性性末末端端进进行行互互补补粘粘合合，再再加加入入DNA连连接接酶酶，即即可封闭其缺口，得到重组体。可封闭其缺口，得到重组体。n较较少少的的情情况况下下，对对产产生生的的平平端端也也可可直直接接进进行行连连接。接。30编辑ppt载体载体DNA与目的基因的连接与目的基因的连接31编辑ppt（二）人工接尾法（二）人工接尾法n即即同同聚聚物物加加尾尾连连接接法法。当当载载体体和和目目的的基基因因无无法法采采用用同同一一种种限限制制酶酶进进行行切切断断，无无法法得得到到相相同同得得黏性末端时，可采用此方法。黏性末端时，可采用此方法。n此此法法首首先先使使用用单单链链核核酸酸酶酶将将粘粘性性末末端端切切平平，再再在在末末端端核核苷苷酸酸转转移移酶酶的的催催化化下下，将将脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸添添加加于于载载体体或或目目的的基基因因的的3-端端，如如载载体体上上添添加加一一段段polyG，则则可可在在目目的的基基因因上上添添加加一一段段polyC，故故二二者者即即可可通通过过碱碱基基互互补补进进行行黏黏合合，再由再由DNA连接酶连接。连接酶连接。32编辑ppt（三）人工接头法（三）人工接头法n将人工连接器（即一段含有多种限制酶将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的切点的DNA片段）连接到载体和目的基片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补体和目的基因进行切断，得到可以互补的黏性末端。的黏性末端。33编辑ppt四、重组四、重组DNA的转化和扩增（转）的转化和扩增（转）n重重组组DNA需需导导入入宿宿主主细细胞胞才才能能进进行行增增殖殖或或表表达达。重重组组质质粒粒可可通通过过转转化化（transformation）方方式式导导入入宿宿主主细细胞胞，即即将将大大肠肠杆杆菌菌用用CaCl2处处理理，增增加加细细菌菌细细胞胞壁壁的的通通透透性性，再再与与重重组组质质粒粒DNA短短暂暂温温育育，质质粒粒DNA即即可可导导入宿主细胞。入宿主细胞。34编辑pptn如如果果是是用用噬噬菌菌体体作作为为载载体体的的重重组组体体，则则需需要要用用外外壳壳蛋蛋白白进进行行包包装装，使使之之成成为为具具有有感感染染能能力力的的噬噬菌菌体体，再再通通过过转转染染(transfection)方方式式将将重重组组噬噬菌菌体体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。导入大肠杆菌等宿主细胞。n重重组组DNA导导入入宿宿主主细细胞胞后后，即即可可在在适适当当的的培培养养条条件件下下进进行行培培养养以以扩扩增增宿宿主主细细胞胞。对对于于质质粒粒DNA，还还可可通通过过在在培培养养基基中中加加入入氯氯霉霉素素，抑抑制制细细菌菌蛋蛋白白质质合合成成及及染染色色体体DNA的的复复制制，以以单单独独扩扩增增细细胞胞中中的的质质粒粒DNA。35编辑ppt五、重组五、重组DNA的筛选和鉴定（筛）的筛选和鉴定（筛）n由由于于重重组组体体导导入入宿宿主主细细胞胞的的比比例例通通常常较较低低，因因此此需需要要对对含含有有重重组组体体的的宿宿主主细细胞胞进进行行筛筛选选并并作作鉴鉴定定。可采用以下方法进行：可采用以下方法进行：（一）根据重组体的表型进行筛选（一）根据重组体的表型进行筛选：n对对于于带带有有抗抗药药基基因因的的质质粒粒重重组组体体，可可采采用用插插入入灭灭活活法法进进行行筛筛选选。如如pBR322中中带带有有抗抗氨氨苄苄青青霉霉素素和和抗抗四四环环素素基基因因，当当将将目目的的基基因因插插入入抗抗四四环环素素基基因因后后，就就可可引引起起该该基基因因失失活活，细细菌菌对对氨氨苄苄青青霉霉素素耐耐药药，而而对对四四环环素素敏敏感感。在在含含氨氨苄苄青青霉霉素素的的培培养养基基上上能能够够生生长长，而而在在含含四四环环素素的的培培养养基基上上不不能能生生长的细菌即为带重组体的细菌。长的细菌即为带重组体的细菌。36编辑ppt插插入入灭灭活活法法筛筛选选重重组组体体37编辑ppt（二）根据标志互补进行筛选（二）根据标志互补进行筛选n当宿主细胞存在某种基因及其表达产物当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。达产物，则说明该细胞中带有重组体。38编辑ppt（三）根据（三）根据DNA限制酶谱进行分析限制酶谱进行分析n经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。泳带即证明重组体中带有目的基因。39编辑ppt（四）用核酸杂交法进行分析鉴定（四）用核酸杂交法进行分析鉴定n为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。的基因。40编辑pptn获得带目的基因的细菌后，可将其不断获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。表达合成蛋白质。41编辑ppt1.什么是基因重组技术？它包含那些内容？2.列举常用的基因工程工具酶的特性和用途。3.叙述常用的基因工程载体的种类、特点和用途。4.怎样获得目的基因或核酸序列的克隆？有那些方法？要经过那些基本步骤？5.怎样能在大肠杆菌中获得真核基因的表达产物？42编辑ppt第三节第三节 分子生物学常用技术分子生物学常用技术 43编辑ppt一、分子杂交与探针技术一、分子杂交与探针技术（一）分子杂交（一）分子杂交n不不同同来来源源的的单单链链核核酸酸（DNA或或RNA），只只要要它它们们具具有有大大致致相相同同的的碱碱基基序序列列，经经过过退退火火处处理理，就就能能重重新新形形成成杂杂种种双双螺螺旋旋，这这一一现现象象称称为为分分子子杂交杂交（molecular hybridization）。）。n利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组组DNA分子中的同源基因或同源序列。分子中的同源基因或同源序列。44编辑ppt（二）探针技术（二）探针技术n将将已已知知序序列列的的核核酸酸片片段段用用放放射射性性同同位位素素、生生物物素素或或荧荧光光染染料料进进行行标标记记，然然后后用用于于分分子子杂杂交交，杂杂交交后后通通过过放放射射自自显显影影、荧荧光光检检测测或或显显色色技技术术，使使杂杂交交区区带带显显现现出出来。来。45编辑ppt 二、分子印迹二、分子印迹技术技术n印印迹迹技技术术的的原原理理首首先先由由Edwen Southern在在1975年年提提出出。其其基基本本操操作作过过程程是是：将将DNA片片段段在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中电电泳泳分分离离后后，置置NaOH液液中中浸浸泡泡，从从而而将将凝凝胶胶中中的的DNA变变性性为为单单链链；然然后后将将一一张张硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜铺铺在在凝凝胶胶上上，上上面面放放上上大大量量吸吸水水纸纸巾巾，利利用用吸吸水水纸纸巾巾的的毛毛细细作作用用，将将单单链链DNA从从凝凝胶胶中中转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，再再将将膜膜置置80烘烘干干并并使使单单链链DNA分分子子固固定定在在膜膜上上，再再用用于于分分子子杂杂交交分分析析。因因此此，用用于于DNA印印迹迹的的技技术术又又称称为为Southern Blotting或或Southern 杂交。杂交。46编辑ppt 分子印迹技术的种类分子印迹技术的种类（一）（一）DNA印迹技术：印迹技术：n又称为又称为Southern杂交，即杂交，即DNA-DNA杂交分析。杂交分析。（二）（二）RNA印迹技术：印迹技术：n又称为又称为Northern杂交，即杂交，即RNA-DNA杂交分析。杂交分析。（三）蛋白质印迹技术：（三）蛋白质印迹技术：n又又称称为为Western杂杂交交，或或免免疫疫印印迹迹技技术术，即即利利用用抗抗原原-抗抗体体反反应应，检检测测转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上的的特特异性蛋白质。异性蛋白质。47编辑pptSouthern Blotting48编辑ppt三、三、PCR技术技术（一）（一）PCR的概念的概念nPCR(polymerase chain reaction)即即聚聚合合酶酶链链反反应应技技术术，是是指指利利用用耐耐热热DNA聚聚合合酶酶的的反反复复作作用用，通通过过变变性性-延延伸伸-复复性性的的循循环环操操作作，在在体体外外迅迅速速将将DNA模模板板扩增数百万倍的一种操作技术。扩增数百万倍的一种操作技术。n理论上可在理论上可在2小时内将一个小时内将一个DNA分子扩增分子扩增到到106109倍，从而大大提高了对其进倍，从而大大提高了对其进行分析研究的速度。行分析研究的速度。49编辑ppt（二）（二）PCR反应系统的组成反应系统的组成 PCR反应系统应包括：反应系统应包括：1耐耐热热DNA聚聚合合酶酶（Taq酶酶）这这是是由由耐耐热热细细菌菌体体内内提提取取的的一一种种DNA聚聚合合酶酶，可可保保证证在在950C，30分钟以上不会变性失活。分钟以上不会变性失活。2模模板板DNA 即即待待分分析析的的目目的的DNA，其其长长度度不不宜大于宜大于10kb。3两两种种引引物物 为为了了保保证证DNA聚聚合合酶酶能能够够对对两两条条互互补补链链均均能能进进行行延延伸伸，需需要要两两种种引引物物，分分别别位位于两条互补模板于两条互补模板DNA链的链的3-端。端。50编辑ppt4四四种种脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸 用用作作底底物物的的dNTPS。5缓缓冲冲溶溶液液 保保证证DNA聚聚合合酶酶催催化化时时所所需的适当的溶液需的适当的溶液pH值。值。51编辑ppt（三）（三）PCR的反应原理的反应原理 PCR反反应应时时，一一般般采采用用变变性性-复复性性-延延伸伸三三步循环，也可采用步循环，也可采用变性变性-延伸延伸两步循环。两步循环。1变变性性 通通常常采采用用加加热热变变性性，即即将将模模板板DNA或或延延伸伸后后的的双双链链DNA加加热热到到95，使双螺旋使双螺旋DNA解开成为单链。解开成为单链。52编辑ppt2复复性性 通通过过降降低低反反应应温温度度至至55，使使两两种种引引物物能能与与两两条条解解开开的的DNA互互补补链链的的3端端黏黏合合，以以提提供供DNA聚聚合合酶酶催催化化聚聚合合所所需的需的3-OH。3延延伸伸 将将反反应应温温度度提提高高到到约约70，在在耐耐热热DNA聚聚合合酶酶的的催催化化下下，根根据据模模板板DNA提提供供的的碱碱基基顺顺序序，合合成成两两条条互互补补链链，从从而使模板而使模板DNA扩增一倍。扩增一倍。n按按照照上上述述步步骤骤重重复复操操作作约约30次次，即即可可将将模板模板DNA扩增数百万倍。扩增数百万倍。53编辑pptPCR的的反反应应原原理理54编辑ppt（四）（四）PCR的主要用途的主要用途 1.目的基因的克隆目的基因的克隆 PCR技技术术是是迅迅速速获获得得一一定定量量的的目目的的基基因因以以用用于于基基因因克克隆隆的的有有效效方方法法之之一一。主主要要采采用用的的方方法法有有：利利用用特特异异性性引引物物以以cDNA或或基基因因组组DNA为为模模板板，获获得得已已知知的的目目的的基基因因；利利用用简简并并引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中获获得得具具有有同同源源性性的的DNA片片段段；利利用用随随机机引引物物从从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。文库或基因组文库中随机获得目的基因。55编辑ppt2.基因的体外突变基因的体外突变 n采采用用随随意意设设计计的的引引物物，在在体体外外对对基基因因进进行嵌合、缺失、点突变等改造。行嵌合、缺失、点突变等改造。3.DNA的微量分析的微量分析n由由于于PCR技技术术具具有有高高度度敏敏感感性性，故故可可用用于微量于微量DNA的分析检测。的分析检测。56编辑ppt四、四、DNA序列分析技术序列分析技术 nDNA碱基序列测定即碱基序列测定即DNA一级结构的测一级结构的测定，目前常用的方法为定，目前常用的方法为Maxam-Gilbert建立的建立的化学裂解法化学裂解法和和Sanger建立的建立的双脱双脱氧末端终止法氧末端终止法。57编辑ppt双脱氧末端终止法的主要操作步骤有：双脱氧末端终止法的主要操作步骤有：1获得待测获得待测DNA片段的单链模板片段的单链模板 n一一般般采采用用基基因因工工程程的的方方法法以以获获取取一一定定数数量量的的单单链链待待测测DNA模模板板。可可将将待待测测DNA片片段段与与噬噬菌菌体体M13DNA进进行行重重组组，然然后后将将其其导导入入大大肠肠杆杆菌菌进进行行增增殖殖，M13噬噬菌菌体体一一般般以以单单链链DNA形形式式透透出出细细胞胞再再感感染染新新的细菌，故此可获得单链的细菌，故此可获得单链DNA模板。模板。58编辑ppt2合成寡核苷酸引物合成寡核苷酸引物 n在在待待测测DNA片片段段的的3-端端合合成成一一段段互互补补的的寡寡核核苷苷酸酸引引物物，其其顺顺序序可可为为待待测测DNA片片段段3-端端的的一一段段已已知知顺顺序序，也也可可为为一一段段M13噬噬菌菌体体的的顺顺序序。可可利利用用DNA合合成成仪仪自自动合成。动合成。3模板模板-引物杂交引物杂交 n将将待待测测单单链链DNA模模板板与与寡寡核核苷苷酸酸引引物物混混合合，并并在在适适当当温温度度条条件件下下进进行行保保温温处处理理，使引物与使引物与DNA单链模板的单链模板的3-端进行杂交。端进行杂交。59编辑ppt4互补链的延长和终止互补链的延长和终止 n将将上上述述杂杂交交混混合合液液分分为为四四份份，每每份份混混合合液液中中均均加加入入DNA聚聚合合酶酶，四四种种dNTPS，一一种种带带放放射射性性同同 位位 素素 标标 记记 的的 脱脱 氧氧 核核 糖糖 核核 酸酸（如如-32P-dATP）。此此外外还还需需分分别别加加入入一一种种双双脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或或ddTTP）。然然后后在在适适当当温温度度条条件件下下延延伸伸互互补补链链，就就可可得得到到四四组组分分别别以以A、G、C、T、终终止止的的长长短短不不一一的的互互补补链链的的混混合合物物。因因在在互互补补链链合合成成时时，如如掺掺入入的的是是双双脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸，由由于于缺缺乏乏3-和和2-OH，故可导致互补链合成终止。故可导致互补链合成终止。60编辑ppt5电泳分离电泳分离 n将将四四组组含含有有长长短短不不等等的的反反应应混混合合物物在在同同一一聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶板板上上进进行行电电泳泳，即即可可将将只只相相差差一一个个核核苷苷酸酸的的寡寡核核苷苷酸酸链链分分离离开。开。6放射自显影放射自显影 n将将电电泳泳凝凝胶胶与与X光光胶胶片片压压在在一一起起，于于低低温温下下自自显显影影数数天天，即即可可得得到到放放射射自自显显图图谱谱，通通过过该该图图谱谱即即可可直直接接读读出出核核苷苷酸酸的的排排列列顺序。顺序。61编辑ppt第四节第四节 分子生物学技术进展（略）分子生物学技术进展（略）62编辑ppt第五节第五节 基因工程与医学的关系基因工程与医学的关系 63编辑ppt一、疾病基因的发现与克隆一、疾病基因的发现与克隆二、生物制药二、生物制药三、基因诊断三、基因诊断四、基因治疗四、基因治疗五、遗传病的预防五、遗传病的预防 64编辑ppt