人类染色体标本制备及核型分析.ppt

人类染色体标本制备人类染色体标本制备及核型分析及核型分析实验三实验三2021/5/2711、掌握人类外周血细胞常规核型的标本制备、掌握人类外周血细胞常规核型的标本制备 方法；方法；2、掌握胰酶法、掌握胰酶法G显带的技术；显带的技术；3、掌握、掌握G显带核型分析的基本过程和技术；显带核型分析的基本过程和技术；4、熟悉快速线条图的绘制；、熟悉快速线条图的绘制；5、了解染色体自动分析系统的原理和使用方法。、了解染色体自动分析系统的原理和使用方法。一、目的与要求一、目的与要求 2021/5/272二、基本原理二、基本原理（一）染色体标本制备（一）染色体标本制备 外外周周血血中中的的淋淋巴巴细细胞胞几几乎乎都都是是处处在在G G0 0期期或或G G1 1期期，一一般般情情况况下是不分裂的。下是不分裂的。当当在在培培养养基基中中加加入入植植物物血血凝凝素素（phytohemagglutinin,phytohemagglutinin,PHAPHA）时时，这这种种小小淋淋巴巴细细胞胞受受到到刺刺激激后后转转化化为为淋淋巴巴母母细细胞胞，并开始进行有丝分裂。并开始进行有丝分裂。经经过过短短期期培培养养后后，用用秋秋水水仙仙素素处处理理、低低渗渗、固固定定、滴滴片片和和染染色色，就就可可获获得得大大量量中中期期分分裂裂相相的的细细胞胞，制制片片后后可可以以清楚地对染色体进行观察。清楚地对染色体进行观察。2021/5/273n染色体标本制作技术有下述四大发现：染色体标本制作技术有下述四大发现：一、美籍华人徐道觉一、美籍华人徐道觉(1952)从助手工作中的失误发从助手工作中的失误发现采用蒸馏水低渗处理分裂细胞可使染色体展开；现采用蒸馏水低渗处理分裂细胞可使染色体展开；二、二、Tjio(1956)发现秋水仙素可使分裂的细胞停止发现秋水仙素可使分裂的细胞停止在中期；在中期；三、三、LiJG发现发现PHA(phytohemagglutin)(植物植物血球凝集素血球凝集素)可使淋巴细胞转化为淋巴母细胞，呈可使淋巴细胞转化为淋巴母细胞，呈分裂状态；分裂状态；四、标本的空气干燥法使细胞和染色体展平。四、标本的空气干燥法使细胞和染色体展平。2021/5/274n这种培养方法是这种培养方法是MoorheadMoorhead于于19601960年建立的。年建立的。n在在人人类类遗遗传传分分析析中中普普遍遍采采用用外外周周血血培培养养的的方方法法获获取取分分裂裂的的细细胞胞，进进而而开开展展临临床床和和基基础础遗遗传传学学的研究。的研究。n这这对对于于遗遗传传疾疾病病的的检检出出以以及及遗遗传传咨咨询询等等工工作作发发挥了重要作用。挥了重要作用。2021/5/275（二）染色体显带（二）染色体显带人们将用各种不同的方法，以及用不同的染人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术显带技术（banding technique）。）。2021/5/276研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、Na0H、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的深浅交替的横纹，这就是染色体的G带。每带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以以G显带后，可以较为准确的识别每条染色显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。2021/5/277关于G显带的机理目前有多种说法，较常见的有1、Lee等（等（1973）认为染色体上与）认为染色体上与DNA结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后这些区段成为浅带，而那些组蛋白和色后这些区段成为浅带，而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带。结合牢固的区段可被染成深带。2021/5/2782、有人认为，染色体显带现象是染色、有人认为，染色体显带现象是染色体本身存在着带的结构。比如用相差显微体本身存在着带的结构。比如用相差显微镜观察未染色的染色体时，就能直接观察镜观察未染色的染色体时，就能直接观察到带的存在。用特殊方法处理后，再用染到带的存在。用特殊方法处理后，再用染料染色，则带更加清楚，随显带方法不同，料染色，则带更加清楚，随显带方法不同，显出来的带特点也不一样，说明带的出现显出来的带特点也不一样，说明带的出现又与染料特异结合有关。又与染料特异结合有关。2021/5/279一般认为，易着色的阳性带为含有一般认为，易着色的阳性带为含有AT多的染色体节段，相反，含多的染色体节段，相反，含GC多多的染色体段则不易着色。总的来说，的染色体段则不易着色。总的来说，G显带的机理还未搞清。显带的机理还未搞清。2021/5/2710三、内容与操作一、染色体一、染色体G显带标本的制备显带标本的制备 1.采血：采血过程中严格执行无菌操作。采血：采血过程中严格执行无菌操作。2接种：超净工作台内接种：超净工作台内 0.30.5ml 轻轻水平摇动混匀。轻轻水平摇动混匀。培养：培养：5%CO2，375恒温箱培养恒温箱培养64-65小小时；卡介苗注射器时；卡介苗注射器(5号针头号针头)向培养瓶中加入向培养瓶中加入20g/ml秋水仙素（秋水仙素（0.01%）一滴，轻轻摇匀，放）一滴，轻轻摇匀，放回温箱继续培养至回温箱继续培养至68小时。小时。2021/5/2711n4、离心：、离心：10分钟（分钟（1500转分），弃上清液，留转分），弃上清液，留下沉淀物。下沉淀物。n5、低渗：、低渗：68m1预温预温37的的0.075M KCl溶液，溶液，沉淀细胞沉淀细胞重重重重冲散，冲散，37水浴箱水浴箱30-35分钟。分钟。n6、预固定：、预固定：1ml新配制的固定剂，新配制的固定剂，轻轻轻轻冲打，冲打，37水浴箱中静置水浴箱中静置5分钟。分钟。n7、离心：、离心：1500转分离心转分离心10分钟，弃上清液。分钟，弃上清液。n6第一次固定：固定液第一次固定：固定液68m1，沉淀物，沉淀物轻轻轻轻冲打冲打均匀，均匀，37水浴箱中静置固定水浴箱中静置固定10分钟。分钟。n7、第一次离心、第一次离心10分钟分钟(1500转分转分)，弃上清液。，弃上清液。n8、重复第重复第6、7步。步。2021/5/2712n9、制片：留固定液制片：留固定液0.2ml0.4ml，轻轻轻轻冲冲打制成细胞悬液。冰冻载波片，滴管口距打制成细胞悬液。冰冻载波片，滴管口距离载玻片离载玻片1015cm，每片，每片23滴。滴。n10、烤片：、烤片：75烤箱烤烤箱烤3小时。自然冷却。小时。自然冷却。2021/5/2713n11、胰酶预温：立式染色缸中磷酸缓冲液、胰酶预温：立式染色缸中磷酸缓冲液100ml（115M NaH2PO4 80.8 ml，KH2PO4 19.2ml)，2.5的胰蛋白酶原液的胰蛋白酶原液1ml配成配成0.025的工作液。的工作液。37的恒温水浴箱内预温。的恒温水浴箱内预温。n12、显带：不断轻轻摆动，使胰酶作用均匀，处、显带：不断轻轻摆动，使胰酶作用均匀，处理时间理时间2590秒钟左右（较陈旧标本时间适当延秒钟左右（较陈旧标本时间适当延长，随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰长，随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间逐渐延长，精确的时间自行摸索）。酶作用时间逐渐延长，精确的时间自行摸索）。取出标本片，立即用取出标本片，立即用37预温的生理盐水轻轻漂预温的生理盐水轻轻漂洗两次，去除片子上的胰酶溶液。洗两次，去除片子上的胰酶溶液。2021/5/2714n13、染色：、染色：37预温的预温的Giemsa工作液染色工作液染色12分钟，自来水冲洗，气干。分钟，自来水冲洗，气干。n14、镜检：低倍镜下选择分散良好的长度适、镜检：低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相转换油镜观察，若染色体未出现中的分裂相转换油镜观察，若染色体未出现带纹，则为显带不足；若染色体边缘发毛为带纹，则为显带不足；若染色体边缘发毛为显带过头，此时应根据具体情况增减胰蛋白显带过头，此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本。酶处理时间重新处理一张标本。2021/5/2715注意事项n玻片完全干后，才可置油镜下进行观察。n每次显带均应做予实验处理，以决定正确的显带时间，不可盲目处理所有玻片。n显带效果的判断，应多观察几个长度适中的分裂相,不能仅凭1、2个分裂相的显带效果决定下一步显带时间。2021/5/2716二、二、G显带标本的核型分析显带标本的核型分析 一秃二蛇三蝶飞，四象鞭炮五黑腰。一秃二蛇三蝶飞，四象鞭炮五黑腰。六号短臂小白脸，七上八下九苗条。六号短臂小白脸，七上八下九苗条。十号长臂三条带，十一低来十二高，十号长臂三条带，十一低来十二高，十三十四十五号，三个一样一二一。十三十四十五号，三个一样一二一。十六长臂近点深，十七远端带脚镣。十六长臂近点深，十七远端带脚镣。十八人小肚皮大，十九中间一点腰。十八人小肚皮大，十九中间一点腰。二十头重脚底轻，二十一象葫芦瓢。二十头重脚底轻，二十一象葫芦瓢。二十二一点二十二一点Y黑腰，黑腰，X pq 一肩挑。一肩挑。2021/5/27171号染色体中央着丝粒和次缢痕染色深。号染色体中央着丝粒和次缢痕染色深。短臂：短臂：近侧段和中段各有一条深带，其中段深带稍宽，在处理较好的标本上，远侧段可显出2-3条淡染的深带。此臂分为3个区，近侧的深带为2区1号带，中段深带为3区1号带。长臂：长臂：次溢痕紧贴着丝粒，染色浓。其远侧为一宽的浅带，中段和远侧段各有两条深带，以中段第2深带染色较浓，中段两条深带稍靠近。此臂分为4个区，次溢痕远侧的浅带为2区1号带，中段第2深带为3区1号带，远侧段第3深带为4区1号带。一秃一秃2021/5/2718n2号染色体 短臂：短臂：可见4条深带，中段的两条深带稍靠近。此臂分为2个区，中段第2、3深带之间的浅带为2区1号带。长臂：长臂：可见6-7条深带，此臂分为3个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1号带，第4和第5深带之间的浅带为3区1号带。二蛇二蛇2021/5/2719n3号染色体着丝粒染色浓。在短臂和长臂的中短各有一条明显而宽阔的浅带。短臂：短臂：一般在近侧段可见两条深带，远侧段可见3条深带，其中远侧近端部的一条较窄，且着色较淡，这是区别3号染色体短臂的显著特征。此臂分为2个区，中段浅带为2区1号带。长臂：长臂：一般在近侧段和远侧段各有一条较宽的深带。在处理较好的标本上，近侧段的深带可分为3条深带，此臂分为2个区，中段浅带为2区1号带。三蝶飞三蝶飞2021/5/2720n4号染色体 短臂：短臂：可见1-2条深带，短臂只有1个区。长臂：长臂：可见均匀分布的4条深带，在处理较好的标本上，在2、3深带间还可显出一条较窄的深带。此臂分为3个区，近侧段第1、2深带间的浅带为2区1号带；远侧段第3、4深带间的浅带为3区1号带。四象鞭炮四象鞭炮2021/5/2721n5号染色体 短臂：短臂：可见1-2条深带，其远侧的深带宽而且色浓。此臂只有1个区。长臂：长臂：近侧段有一条深带，染色较淡；中段可见3条深带，染色较浓；远侧段可见1-2条深带，近末段的一条着色较浓。此臂分为3个区，中段第2深带为2区1号带；中段第3深带与远侧段第1深带之间宽阔的浅带为3区1号带。五黑腰五黑腰2021/5/2722n6号染色体着丝粒染色浓。短臂：短臂：中段有一条明显而宽阔的浅带，近侧段和远侧段各有一条深带，近侧段的深带紧贴着丝粒。在处理较好的标本上，远侧段的深带可分为2条深带。此臂分为2个区，中段的明显而宽阔的浅带为2区1号带。n 长臂：长臂：可见5条深带，近侧的一条紧贴着丝粒。远侧段末段的一条深带窄而且着色较淡。此臂分为2个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1号带。六号短臂小白脸六号短臂小白脸2021/5/2723n7号染色体着丝粒染色浓。短臂：短臂：有3条深带，中间的一条深带窄而且着色极淡，有时不明显，远侧近末段的深带着色浓而稍宽，宛如“瓶盖”，这常常是辨别7号染色体的明显特征。此臂分为2个区，远侧深带为2区1号带。长臂：长臂：有3条明显的深带，远侧近末段的一条深带着色较淡，第2和第3深带稍接近。此臂分为3个区，近侧第1深带为2区1号带；中段的第2深带为3区1号带。七上七上2021/5/2724n8号染色体 短臂：短臂：有2条深带，其间有一条较明显的浅带，这是与10号染色体相区别的主要特征。此臂分为2个区，中段浅带为2区1号带。长臂：长臂：近侧段可见2-3条分界不明显的深带，远侧段有一明显而恒定的深带。此臂分为2个区，中段深带为2区1号带。八下八下2021/5/2725n9号染色体着丝粒染色浓。短臂：短臂：远侧段可见两条深带，在有的标本上融合成一条深带。此臂分为2个区，近侧的第1深带为2区1号带。长臂：长臂：可见两条明显的深带，次溢痕一般不着色，在有些标本上呈现特有的狭长“颈部区”。此臂分为3个区，近中段的一深带为2区1号带，远侧段的一深带为3区1号带。九苗条九苗条2021/5/2726n10号染色体着丝粒染色浓。短臂：短臂：近中段有一条深带。此臂只有1个区。长臂：长臂：可见明显的3条深带，近侧的一条着色最浓。该长臂上的这3条明显的深带是与8号染色体相区别的一个主要特征。此臂分为2个区，近侧段的第1深带为2区1号带。十号长臂三条带十号长臂三条带2021/5/2727n11号染色体着丝粒染色浓。短臂：短臂：近中段可见一条宽的深带，在处理较好的标本上，这条深带可分为两条较窄的深带。此臂只有1个区。长臂：长臂：近侧有一条深带，紧贴着丝粒，近中段可见一条明显的较宽的深带，在这条深带与近侧深带之间有一条宽阔的浅带。在处理较好的标本上，近中段的这条较宽的深带可分成两条较窄的深带，两深带之间有一条很窄的浅带，后者虽常不明显，但却是分区上的一个界标。在有些标本上近末端处尚可见一条窄的浅色的深带。此臂分为2个区，界标即2区1号带为上述近中段两深带之间的那条很窄的浅带。十一低来十一低来2021/5/2728n12号染色体着丝粒染色浓。短臂：短臂：中段可见一条深带，此臂只有一个区。长臂：长臂：近侧有一条深带紧贴着丝粒。中段有一条宽的深带，这条深带与近侧深带之间有一条明显的浅带，但与11号染色体比较，这条浅带较窄，这是鉴别11号与12号染色体的一个主要的特征。在处理较好的标本上，中段这条较宽的深带可显出3条较窄的深带，且正中一条着色较浓。在有些标本上，远侧段还可见1-2条窄的染色较淡的深带。此臂分为2个区，中段正中着色较浓的深带为2区1号带。十二高十二高2021/5/2729n13号染色体着丝粒和短臂染色浓。长臂：长臂：可见4条深带，第1和第4深带较窄、染色较淡；第2和第3深带较宽、染色较浓。此臂分为3个区，第2深带为2区1号带，第3深带为3区1号带。十三十四十五号，十三十四十五号，三个一样一二一三个一样一二一2021/5/2730n14号染色体着丝粒和短臂染色深。长臂：长臂：近中段和远侧段各有一条较明显的深带。在处理较好的标本上其近侧可显出一条深带，其中段可显出一条着色较淡的深带。此臂分为3个区，近侧第2条深带为2区1号带，远侧第4深带为3区1号带。2021/5/2731n15号染色体着丝粒和短臂染色浓。长臂：中段有一条明显的深带，染色较浓。在有的标本上其近侧段可见1-2条淡染的深带。此臂分为2个区，中段深带为2区1号带。2021/5/2732n16号染色体中央着丝粒和次缢痕染色浓。短臂：短臂：中段有一条着色较淡的深带，在有的标本上可见两条深带。此臂只有一个区。长臂：长臂：除次缢痕外有两条深带，远侧段的一条有时不明显。此臂分为2个区，中段深带为2区1号带。十六长臂近点深十六长臂近点深2021/5/2733n17号染色体着丝粒染色浓。短臂：短臂：中段有一条深带。此臂只有一个区。长臂：长臂：远侧段可见一条深带，这条深带与着丝粒相连的深带之间为一明显而宽的浅带。此臂分为2个区，上述浅带为2区1号带。十七远端带脚镣十七远端带脚镣2021/5/2734n18号染色体 短臂：短臂：一般为浅带。此臂只有一个区。长臂：长臂：近侧和远侧各有一条明显的深带。此臂分为2个区，两条带之间的浅带为2区1号带。十八人小肚皮大十八人小肚皮大2021/5/2735n19号染色体着丝粒及其周围为深带，其余均为浅带。在有的标本上其长臂近中部可显出一条着色极淡的深带。短臂和长臂均只有一个区。十九中间一点腰十九中间一点腰2021/5/2736n20号染色体着丝粒染色浓。短臂：短臂：中部有一条明显而浓染的深带。此臂只有一个区。长臂：长臂：在远侧段可见1-2条染色较淡的深带，但有时不明显。此臂只有一个区。二十头重脚底轻二十头重脚底轻2021/5/2737n21号染色体着丝粒染色浓。比22号染色体短，其长臂近着丝粒处有一明显而宽的深带。此臂分为2个区，其深带为2区1号带。二十一象葫芦瓢二十一象葫芦瓢2021/5/2738n22号染色体着丝粒染色浓。比21号染色体长，在长臂上可见2条深带，近侧的一条着色浓而且紧贴着丝粒，呈点状，近中段的一条着色淡，在有的标本上不显现，此臂只有一个区。二十二一点二十二一点2021/5/2739nX染色体其长度介于7号和8号染色体之间。着丝粒有时染色淡。短臂：短臂：中段有一条明显的深带，宛如“竹节状”。在有些标本上其远侧还可见一条窄的、着色淡的深带。此臂分为2个区，中段的深带为2区1号带。长臂：长臂：可见4条深带，近侧一条最明显。此臂分为2个区，近侧的这条最明显的深带为2区1号带。X pq 一肩挑。一肩挑。2021/5/2740nY染色体长度变化较大，有时整个长臂被染成深带，在处理较好的标本上可见2条深带。此臂只有一个区。Y黑腰黑腰2021/5/2741【作业与思考题作业与思考题】分析染色体制作不良的可能影响因素绘制1个G显带染色体核型的快速线条图，并注明染色体号数。3使用染色体自动分析系统分析G显带染色体核型2021/5/2742