过表达Trxyr1基因对里氏木霉合成纤维素酶的影响.pdf

2023 Vol.42 No.858Serial No.378China BrewingResearch Report过表达Trxyr1基因对里氏木霉合成纤维素酶的影响刘文书1-2,王赞丞1-2,高玉杉1-2，莫易1-2,彭念12,冉小琴1-2,李勇昊1.2*（1.重庆科技学院化学化工学院，重庆40 1331;2.重庆科技学院工业发酵微生物重庆市重点实验室，重庆40 1331）摘要：以里氏木霉（Trichoderma reesei)RutC30为出发菌株，利用组成型启动子（PDC1)过表达同源Trxyr1基因，探究阳性转化子T.reeseiOExyr1在不同诱导物及非诱导条件下合成纤维素酶的情况，最后粗酶液被用于水解碱预处理的玉米秸秆以分析其催化性能。结果表明，T.reeseiOExyr1在葡萄糖-二糖混合物诱导下纤维素酶活是野生型菌株的1.2 2 倍；而以纤维素为诱导物，纤维素酶活可提高2.95倍；此外在非诱导条件下T.reeseiOExyr1可合成纤维素酶；但T.reeseiOExyr1所产纤维素酶对玉米秸秆的水解效率与野生型无显著性差异。以上结果说明不同诱导物下Trxyr1基因高表达均可提升纤维素酶产量，尤其对于固体纤维素诱导物，但Trxyr1基因表达量的提高对纤维素酶系影响不大。研究成果对阐明T.reesei合成纤维素酶的分子机制及构建高产纤维素酶菌株提供参考。关键词：里氏木霉；纤维素酶；诱导物；Trxyrl基因；转录因子；玉米秸秆中图分类号：Q81；T S2 10.9引文格式：刘文书，王赞丞，高玉杉，等.过表达Trxyr1基因对里氏木霉合成纤维素酶的影响.中国酿造，2 0 2 342(8)：58-6 4.Effect of overexpression of Trxyrl gene on cellulase synthesis by Trichoderma reeseiLIU Wenshu2,WANG Zancheng2,GAO Yushan,MO Yil2,PENG Nian,RAN Xiaoqin2,LI Yonghaol2*(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Chongqing University of Science and Technology,Chongqing 401331,China;2.Chongqing Key Laboratory of Industrial Fermentation Microorganisms,Chongqing University of Science and Technology,Abstract:Using Trichoderma reesei Rut C30 as the starting strain,and homologous Trxyrl gene was overexpressed by constitutive promoter(PDC1).The synthesis of cellulase by the positive transformer T.reesei OExyrl under different inductors and non-inducible conditions were investigated.Fi-nally,alkali-pretreated corn stalk was hydrolyzed by the crude enzyme liquid to analyze its catalytic performance.The results showed that the cellu-lase activity of T.reesei OExyrl was 1.22 times that of the wild-type strain induced by glucose-bisaccharide mixture.With cellulose as the inducer,cellulase activity increased by 2.95 times.In addition,T.reeseiOExyrl could synthesis cellulase under non-induced conditions.However,the hydrolysisefficiency of cellulase produced by T.reesei OExyrl on corn stalk was not significantly different from that of wild type.These results indicated thathigh expression of Trxyrl gene could increase cellulase production under different inducers,especially for solid cellulose inducers,but the increase ofTrxyrl gene expression had lttle effect on cellulase series.The research results provided reference for elucidating the molecular mechanism of cellu-lase synthesis by T.reesei and constructing high-yielding cellulase strains.Key words:Trichoderma reesei;cellulase;inducer;Trxyrl gene;transcription factors;corn stalk以秸秆为代表的木质纤维素类生物质转化为生物能源或生物基化学品将成为我国实现“双碳”承诺的一个政策着力点。然而，木质纤维素由纤维素、半纤维素和木质素等物质相互交联构成难以被生物降解的天然屏障，其组分与结构的异质性和多样性，使得充分降解依赖高效的纤维素酶2 。里氏木霉（Trichoderma reesei)是目前最重要的工业化生产纤维素酶菌株之一，但其纤维素酶的生物合成需要诱导3-4。前期通过商业-葡萄糖苷酶生物催化葡萄糖制备的葡萄糖-二糖混合物（mixture glucose and-disaccharide,MGD)可高效诱导T.reesei合成纤维素酶，纤维素酶活性收稿日期：2 0 2 2-11-2 2基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（2 18 0 8 0 2 2)；重庆市自然科学基金项目（CSTB2022NSCQ-MSX0544)；重庆科技学院硕士研究生创新计划项目（YKJCX2220502）作者简介：刘文书（1997-)，女，硕士研究生，研究方向为生物能源。*通讯作者：李勇昊（198 6-），男，副教授，博士，研究方向为生物能源。文章编号：0 2 54-50 7 1(2 0 2 3)0 8-0 0 58-0 7修回日期：2 0 2 3-0 3-30doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2023.08.010Chongqing 401331,China)达到90.3IU/mL;利用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)异源生产黑曲霉来源-葡萄糖苷酶并用于制备MGD，诱导T.reesei合成纤维素酶，其酶活性达到9 5.2 3IU/mL；而CHENYM等7 利用MGD诱导表达改造ACE3基因的T.reesei工程菌，其纤维素酶产量高达10 2.6 3IU/mL。研究表明，MGD诱导T.reesei合成纤维素酶的能力强于纤维素，进一步转录组学结果显示,MGD相比于纤维素作为诱导物条件下纤维素酶转录激活因子Trxyr1基因显著性高表达,由此推测Trxyr1基因可能是MGD具有高诱导力的重要原因之一。T.reesei所产纤维素酶是包括几十种水解酶的复合酶系，主要有降解结晶纤维素的外切纤维素酶、在无定形区2023年第42 卷第8 期中国酿造研究报告域切割纤维素链的内切纤维素酶和将纤维二糖转化为葡萄糖的-葡萄糖苷酶9。除此之外,还有纤维素降解辅助蛋白参与木质纤维素的水解，研究表明，纤维素降解辅助蛋白虽然无糖苷水解酶活性，但可破坏木质纤维素致密的高分子结构，降低木质纤维素结晶度从而协同纤维素酶提高催化速率0-1。蛋白质组学研究发现,MGD相比于纤维素诱导物合成纤维素降解辅助蛋白量低，而纤维素酶组分的改变会影响其水解木质纤维素的效率2 。因此需要明确Trxyr1基因表达量是否会改变纤维素酶系组成从而影响纤维素水解效率，为构建高水解效率纤维素酶系提供参考。基于此，本研究在T.reeseiRut C30中利用丙酮酸脱羧酶1启动子高效表达同源Trxyr1基因，重组菌株分别使用MGD和纤维素为诱导物以及无诱导物条件下发酵生产纤维素酶,验证MGD高诱导活性主要原因是否为Trxyr1基因高表达。同时利用纤维素酶水解碱预处理玉米秸秆（alkalipretreated corn straw，A PCS),探讨过表达Trxyr1基因对纤维素酶系的影响。以期为T.reesei在不同诱导物条件下合成纤维素酶的分子机制提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌株、质粒与引物里氏木霉（Trichoderma reeseiRutC30(NRRL11460):惠赠于美国农业研究菌种保藏中心；根瘤农杆菌（Agrobac-terium tumefaciens）A G L-1与大肠杆菌（Escherichia coli)DH5感受态：上海唯地生物技术有限公司；含有丙酮酸脱羧酶1启动子和终止子的T.reesei基因表达载体pPTPDC1由本实验室构建保存12 。本研究使用到的引物见表1。表1引物名和基因序列Table 1Primer names andgene sequences引物名qPCRsar1-FqPCRsarl-RqPCRxyr1-FqPCRxyr1-R1.1.2 主要试剂TSINGKE TSV-S1Trelief?SoSoo Cloning Kit无缝克隆试剂盒、TSINGKETSP501-200高纯度质粒脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA）小量提取试剂盒、TSINGKETSK301S GoldenstarIM RT6互补DNA(complementary DNA,cDNA)Synthesis Kit逆转录酶试剂盒：北京擎科生物科技有限公司；-葡萄糖苷酶（2 37 0.3IU/mL）：夏盛（北京）生物科技开发有限公司限制性内切酶BsiWI：美国NewEngland Biolabs公司;RNAsimple Total RNAKit总核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）提取试剂盒（离心柱型）：天根生化科技（北京）有限公司;PrimeScriptTMRTreagentKitwith总第37 8 期gDNAEraser(PerfectRealTime）酶试剂盒：宝日医生物技术（北京）有限公司。1.1.3 培养基马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基：取2 0 0 g土豆煮30 min后用6 层纱布过滤，滤液中加入2 0 g葡萄糖后使用去离子水定容至1L;溶菌肉汤(lysogenybroth,LB)培养基：5g/L酵母粉，10 g/L胰蛋白陈和10 g/LNaCl;种子培养基：4g/L葡萄糖，10 g/L玉米浆粉；T.reesei生孢培养基：30 g/L麦芽浸粉2 0 g/L琼脂粉；发酵培养基：10 g诱导物或碳源,2 gKH,PO4,1.4g（NH)2 SO 4,1g 蛋白陈,0.3g尿素,0.4 g CaCl2,5 mg Fe2SO4H,O,1.7 mg MnSO4H,O,1.4 mgZnSO47H,0溶于50 0 mL去离子水，50 0 mL0.2mol/L磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液(pH=5)。发酵培养基的碳源分别为葡萄糖-二糖混合物（MGD)、葡萄糖或者纤维素。配制固体培养基需添加2 0 g/L琼脂粉。以上培养基均在115高压蒸汽灭菌2 0 min。葡萄糖-二糖混合物（MGD）配制5：使用0.2 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH=4.8)配制6 0 0 g/L葡萄糖溶液，加入-葡萄糖苷酶2 0 CBU/g葡萄糖，于6 5、150 r/min催化72h后在10 5处理5min失活-葡萄糖苷酶。1.2仪器与设备SPX-250-型生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；SW-CJ-1BU洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；A300基因扩增仪：杭州朗基科学仪器有限公司；ZWYR-2102C恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；THZ-82数显恒温振荡器：常州天瑞仪器有限公司；希尔曼S-10生物传感器分析仪：深圳市西尔曼科技有限公司。1.3实验方法1.3.1碱预处理的玉米秸秆的制备使用2%NaOH溶液在固液比8%玉米秸秆条件下12 1基因序列反应90 min后用蒸馏水冲洗至pH为中性，烘干后得到碱预5-CGTCTTGTCGTCTTTGGGTCT-3处理的玉米秸秆(APCS)，室温保存备用1314。5-GGATAGCAACTCGGTCGTTCTT-31.3.2过表达Trxyrl基因T.reesei工程菌的构建5-CCATCAACCTTCTAGACGAC-3将T.reeseiRutC30孢子接种到50 mL种子培养基中，5-AACCCTGCAGGAGATAGAC-328、150 r/m in 培养2 4h，以8%接种量接入发酵培养基，置摇床2 8、150 r/min培养48 h后取样提取RNA，将RNA反转为cDNA；以cDNA为模板，Xyr1-F/R（含有2 0 bp质粒pPT-PDC1的同源片段）为引物，扩增Trxyrl基因。利用BsiW1限制性内切酶线性化表达载体pPTPDC1,使用无缝克隆方法将线性化载体与Trxyr1基因连接，构建成功的载体命名为pPTPDC1-xyr1通过热激法将连接产物转入E.coliDH5感受态细胞；表达载体构建先后经过聚合酶链式反应(poly-merase chain reaction,PCR）和DNA测序验证。通过根瘤农杆菌介导遗传转化的方法15 将表达载体pPTPDC1-xyr1中含有Trxyr1表达盒的T-DNA整合到T.reeseiRutC30基因组，使用含30 0 g/mL潮霉素B的PDA平板筛592023 Vol.42 No.860Serial No.378选转化子，提取转化子基因组通过PCR和DNA测序验证Trxyr1表达盒是否整合到T.reeseiRutC30基因组并且无碱基突变。将验证正确的转化于命名为T.reeseiOExyrl。1.3.3T.reesei发酵生产纤维素酶RutC30或者重组菌株T.reeseiOExyrl的孢子接种到50mL种子培养基中，置摇床2 8、150 r/min培养2 4h，以8%接种量接种于50 mL发酵培养基，继续在2 8、150 r/min生产纤维素酶。其中发酵培养基分别以10 g/LMGD、葡萄糖或纤维素为碳源，在发酵36 h、48 h 和6 0 h时取发酵液分别测定纤维素酶、外切纤维素酶、内切纤维素酶和-葡萄糖苷酶活性。1.3.4纤维素酶水解碱处理玉米秸秆将1.3.1节制备的的APCS按照固液比5:10 0（g:mL）加入到0.2 mol/L磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液(pH=4.8)中，将1.3.3节制备的纤维素酶按照5FPU/gAPCS和2 37.0 3IU/g-葡萄糖苷酶的量加入到酶解反应体系。水解反应条件为50和150 r/min，每间隔12 h取样直至葡萄糖产量不再提高停止水解反应。1.3.5测定方法(1)酶活分析方法10 :-葡萄糖苷酶的测定：取适当稀释酶液2 0 0 L与2 0 0 L15mmol/L纤维二糖溶液混合置50 反应30 min，然后立即于沸水中反应2 min灭酶活，测定葡萄糖含量。将1mL酶液1min产生1mol葡萄糖定义为1个酶活力单位(IU/mL）。内切纤维素酶的测定：取适当稀释酶液50 0 L与1mL2%的羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose,CMC)溶液混合，置50 水浴锅中反应30 min，然后立即加入2 mL的3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylicacid,DNS）于沸水中10min灭酶活，加入9 mL去离子水，测定波长540 nm处的吸光度值。将1mL酶液1min生产1mol还原糖定义为1个酶活力单位(IU/mL)。外切纤维素酶的测定：取适当稀释酶液10 0 L与50 L1g/L的对硝基苯纤维二糖苷(p-nitrophenol-D-cellobioside,pNPC)溶液混合，置50 水浴锅中反应30 min，然后立即加入150 L10%NazCOs溶液灭酶，测定波长415nm处的吸光度值。将1mL酶液1min生产1molpNP定义为1个酶活力单位(IU/mL)。滤纸酶活测定：取适当稀释酶液50 0 L、1m L乙酸钠缓冲液(0.2 mol/L,pH=4.8)、W h a t m a n No.1滤纸条（6 cmx1cm），置50 水浴锅反应1h，然后立即加入2 mL的DNS于沸水浴10 min灭酶，加入9mL去离子水，测定波长540 nm处吸光度值。将1mL酶液1min生产1mol还原糖定义为1个酶活力单位(IU/mL）。(2)定量聚合酶链反应分析分别将接种后发酵36 h的RutC30和T.reeseiOExyrlChina Brewing菌丝提取RNA后反转录为cDNA用于定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定。所测试基因qPCR引物如表1。采用2-4法计算被测基因的相对定量,sar1基因作为管家基因17-18 。1.3.6数据处理实验均进行3次重复，结果均以“平均值和标准差表示。使用方差分析（analysisofvariance，A NO VA)统计学分析方法，显著性水平设定为P0.05，极显著水平设定为P0.01。2结果与分析2.1过表达Trxyrl基因T.reesei工程菌的构建研究发现，使用cbh1或者xyn3启动子在T.reesei中表达基因会降低相应外切纤维素酶和木聚糖酶活性19-2 0,因此本研究选用丙酮酸脱羧酶1(PDC1)组成型启动子表达内源Trxyr1基因。将筛选出可稳定遗传的阳性转化子命名为T.reeseiOExyrl,验证结果如图1所示。构建的过表达Trxyrl基因的质粒图谱见图1A。由图1A可知，T-DNA中包含Trxyrl基因表达盒和潮霉素B筛选标记。以Bsiwlyz-R和qPCRxyr1-F为引物对T.reesei工程菌进行验证，结果见图1B。由图1B可知，以T.reeseiRutC30基因组为模板无PCR产物，而以T.reeseiOExyrl基因组为模板可以克隆出碱基大小为2 6 0 0 bp左右的DNA片段，且与目标DNA大小一致，说明Trxyr1基因表达盒成功整合到T.reese基因组；进一步对表达盒进行DNA测序验证，结果见图1C。由图1C可知，表达盒中DNA序列与目的序列完全一致,无碱基突变。利用葡萄糖-二糖混合物(MGD)为诱导物分别培养RutC30和T.reeseiOExyrl菌株36 h后提取RNA对Trxyr1基因进行qPCR分析，结果见图1D。由图1D可知，该基因在MGD诱导下均可检测到表达，但是利用PDC1启动子过表达该基因后发现相比于野生型菌株Trxyr1基因表达量提高了2.44倍（P0.01），说明Trxyrl基因表达盒不仅仅整合到了T.reesei Rut C30基因组，而且实现了高表达，可用于后续发酵实验。QPCR-xXr1-RAqPCR-xyr1-FBSIWyz-RBSTWlyz-F750010,000NPT11IHARK2.orIVBMOExyrlRutC30GETACAGGACAAITGTTGTCCAATGGTCTCCGTCGPPTPDC12.500bp1500bp-Fig.1 Plasmid schematic diagram and transformant verification ofoverexpressionTrxyr1vectorResearch Report12,.500PpdcipPTPDCI-xyrlC“*表示差异极显著(P0.01)。下同。图1过表达Trxyr1载体的质粒示意图与转化子验证D1086MOEXrees.resei2023年第42 卷第8 期中国酿造研究报告2.2T.reesei发酵生产纤维素酶T.reesei是生产纤维素酶高产菌株,但纤维素酶的生物合成需要诱导。槐糖是目前已知的最强诱导物，但是纯槐糖价格昂贵2 12 2;通过-葡萄糖苷酶催化葡萄糖制备的MGD由于含有槐糖，所以具有很强的诱导能力5-7 。纤维素是常用的诱导物，虽然诱导外切纤维素酶和内切纤维素酶水平没有MGD强，但其所产纤维素酶组分中含有大量纤维素降解辅助蛋白，从而可能有利于纤维素酶对木质纤维素的水解12 ;已知葡萄糖存在条件下由于碳代谢阻遏作用会抑制纤维素酶基因转录2 3,且转录组学显示MGD相比于纤维素作为诱导物，Trxyr1基因转录水平显著提高8,因此需要探讨Trxyr1基因在不同诱导物条件下对T.reesei合成纤维素酶的影响。以10 g/LMGD为碳源分别诱导野生型菌株T.reeseiRutC30和过表达Trxyr1基因的T.reeseiOExyrl菌株生产纤维素酶，结果如图2 所示。2.5 1 A*ns2.01.51.00.50(.)/学67B*202.52.01.51.00.50总第37 8 期D*0.50.40.30.20.10“*表示差异显著(P0.05)。下同。图2 以MGD为碳源对诱导RutC30和TrichodermareeseiOExyr1生产纤维素酶的影响Fig.2 Effect of MGD as carbon source on cellulase production byRut C30 and Trichoderma reesei OExyr1由图2 可知，在发酵48 h时纤维素酶产量达到最高，此时过表达Trxyrl基因的T.reeseiOExyrl菌株相比于野生型菌株T.reeseiRutC30的滤纸酶活（图2 A)和-葡萄糖苷酶(图2 D)活性分别提高了0.2 2 倍和3.0 5倍（P0.05)。T.reeseiRutC30以10 g/L纤维素为碳源分别诱导野生型菌株T.reeseiT.reeseiOExyrlRutC30和过表达Trxyr1基因的T.reeseiOExyrl菌株生产纤维素酶，结果见图3。由图3可知，过表达Trxyr1基因的T.reeseiOExyrl菌株的滤纸酶活、外切纤维素酶、内切纤维素酶和-葡萄糖苷3648时间/hns3648时间/hCns3661*T.reeseiRutC30T.reeseiOExyrl3648时间/h60酶活性相比于野生型菌株T.reeseiRutC30分别极显著提高了2.95、2.15、2.40 和5.37 倍（P0.01），相比于MGD作为ns诱导物，纤维素酶活性提高更为显著。分析原因主要是以MGD为诱导物本底Trxyr1基因表达量就足够高，这也是最初分析MGD具有高诱导活性的重要原因之一。因此继续过T.reeseiRutC30T.reeseiOExyrl60nsns4860时间/h60表达Trxyr1基因后提高纤维素酶活性有限，而以纤维素作为诱导物，本底Trxyr1基因表达量不足，而XYR1是已知的T.reesei中最重要的纤维素酶转录激活因子，有报道敲除该基因后,所有纤维素酶基因均无转录2 4。因此过表达Trxyr1基因的工程菌利用纤维素作为诱导物会获得更高的纤维素酶产量。51.A*(rTW.nI)/43T.reeseiRutC30T.reeseiOExyrlT.reesei RutC302T.reeseiOExyrl08496108 120 132 144156168时间/h2023 Vol.42 No.862Serial No.378B15*1058496108120 132.144156168时间/h8C*64208496108120132144 156 168时间/h2.07D1.5-1.0-0.5*China Brewing后使得菌株在非诱导条件下合成纤维素酶，与本研究结果一致，然而鉴定过表达Trxyr1基因对菌株在MGD诱导条件下合成纤维素酶的影响文献尚无报道。T.reeseiRutC30T.reeseiOExyrlT.reesei RutC30T.reeseiOExyrl*：*Research Report0.81 A*0.60.40.201.55.B*1.00.50T.reeseiRutC30T.reeseiOExyrl*3648时间/h*3648时间/h1.5*60*60*T.reeseiRutC30T.reeseiOExyrlT.reeseiRutC30T.reeseiOExyrl08496108 120 132 144 156 168图3以纤维素为碳源对诱导RutC30和Trichoderma reeseiOExyr1生产纤维素酶的影响Fig.3 Effect of cellulase as carbon source on cellulase production byRut C30 and Trichoderma reesei OExyr1由于碳阻遏作用导致葡萄糖存在条件下T.reesei生产纤维素酶受到抑制，研究表明，这种抑制主要通过纤维素酶转录抑制因子CRE1调控,而T.reeseiRutC30的cre1基因发生突变，所以其具备在葡萄糖为碳源条件下合成纤维素酶的可能性2 5。以10 g/L葡萄糖为碳源分别诱导野生型菌株T.reeseiRut C30和过表达Trxyr1基因的T.reeseiOExyrl菌株生产纤维素酶，结果如图4所示。由图4可知，过表达Trxyr1基因的T.reeseiOExyrl菌株的滤纸酶活、外切纤维素酶、内切纤维素酶和-葡萄糖苷酶活性相比于野生型菌株T.reeseiRutC30分别提高了1.2 7、1.14、0.45和3.44倍；但与MGD或者纤维素作为诱导物存在时，滤纸酶活分别极显著降低4.42 倍和5.8 6 倍（P0.05)；以纤维素为诱导物所产纤维素酶水解实验结果与图5A结果趋势完全一ns致，这说明Trxyr1作为全局纤维素酶转录调控因子控制几nsnsT.reeseiOExyrl释放葡萄糖量。乎所有纤维素酶基因转录,所以过表达Trxyr1基因对纤维素酶组分影响不大。而图5D显示了在水解初期(12 h),MGDT.reeseiRutC30为诱导物所产纤维素酶水解玉米秸秆的效率要极显著高于纤维素或者葡萄糖为碳源所产纤维素酶(P 0.0 5),这为T.reesei无诱导物发酵生产纤维素酶提供了新的思路。3结论本研究在T.reeseiRutC30中过表达同源纤维素酶转录激活因子Trxyrl基因，阳性转化子T.reeseiOExyr1的Trxyr1基因表达量极显著提高了2.44倍（P0.01）。在葡萄糖-槐糖混合物作为诱导物下T.reeseiOExyr1所产纤维素酶提高有限，而纤维素作为诱导物T.reeseiOExyrl所产纤维素酶均得到显著性提高，而T.reeseiOExyr1在非诱导条件下可以合成纤维素酶。水解玉米秸秆实验证实Trxyr1作为纤维素酶转录全局调控因子，表达量提高后不会改变纤维素酶系从而影响水解效率,研究成果为进一步确定T.reesei合成纤维素酶的分子机制及构建高产纤维素酶菌株提供参考。参考文献：1李德尚玉.政府工作报告解读：从能耗“双控 向碳排放“双控”转变金融如何发力?N.21世纪经济报道，2 0 2 2-0 3-10(0 0 5)2 HIMMEL M E,BAYER E A.Lignocellulose conversion to biofuels:cur-rent challenges,global perspectivesJJ.Curr Opin Biotechnol,2009,20(3):316-317.3 FANG H,LI C F,ZHAO J J,et al.Biotechnological advances and trendsin engineering Trichoderma reesei towards cellulase hyperproducer J.Biotechnol Bioprocess Eng,2021,26:517-528.4 PETERSON R,NEVALAINEN H.Trichoderma reesei RUT-C30-thirtyyears of strain improvementJJ.Microbiology,2012,158(1):58-68.5 LIY H,LIU CG,BAIF W,et al.Overproduction of cellulase by Trichoder-ma reesei RUT C30 through batch-feeding of synthesized low-cost 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