杂交瘤技术的实验原理.ppt

杂交瘤技术制备单克隆杂交瘤技术制备单克隆杂交瘤技术制备单克隆杂交瘤技术制备单克隆抗体的实验原理抗体的实验原理抗体的实验原理抗体的实验原理1可编辑版接接接接受受受受抗抗抗抗原原原原刺刺刺刺激激激激后后后后，能能能能分分分分泌泌泌泌针针针针对对对对该该该该抗抗抗抗原原原原的的的的特特特特异异异异性性性性抗体抗体抗体抗体，在体液免疫中具有重要功能。，在体液免疫中具有重要功能。，在体液免疫中具有重要功能。，在体液免疫中具有重要功能。B B淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞本本本本身身身身是是是是一一一一种种种种终终终终末末末末分分分分化化化化细细细细胞胞胞胞，通通通通常常常常不不不不再再再再进进进进行行行行细细细细胞胞胞胞分分分分裂裂裂裂，存存存存活活活活一一一一段段段段时时时时间间间间后后后后便便便便会会会会死死死死亡亡亡亡短短短短命命命命细胞细胞细胞细胞一、杂交瘤技术产生的一、杂交瘤技术产生的3 3个技术关键个技术关键1.B1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞(B lymphocytes)(B lymphocytes)：2可编辑版骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 (myeloma cells):(myeloma cells):恶恶恶恶性性性性增增增增殖殖殖殖的的的的转转转转化化化化细细细细胞胞胞胞，只只只只要要要要营营营营养养养养条条条条件件件件适适适适合合合合可可可可永远分裂和存活永远分裂和存活永远分裂和存活永远分裂和存活长命细胞长命细胞长命细胞长命细胞。经经经经筛筛筛筛选选选选与与与与驯驯驯驯化化化化，现现现现已已已已建建建建立立立立多多多多种种种种骨骨骨骨髓髓髓髓瘤瘤瘤瘤细细细细胞胞胞胞株株株株没有抗体分泌物没有抗体分泌物没有抗体分泌物没有抗体分泌物。3可编辑版2.2.细胞融合技术：细胞融合技术：细胞融合技术：细胞融合技术：脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞(B(B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞长命长命长命长命不分泌抗体不分泌抗体不分泌抗体不分泌抗体分泌抗体分泌抗体分泌抗体分泌抗体短命短命短命短命分泌抗体分泌抗体分泌抗体分泌抗体长命长命长命长命KhlerKhler和和和和Milstein,1975Milstein,19751984年年Nobel医医学学奖奖4可编辑版3.3.杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选 ：脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞(B(B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞/脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞筛选出筛选出筛选出筛选出不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活5可编辑版HATHATHAT培养基筛选培养基筛选培养基筛选培养基筛选培养基筛选培养基筛选H,次黄嘌呤次黄嘌呤;A,氨基喋呤氨基喋呤;T,胸腺嘧啶胸腺嘧啶DNADNA内源性途径内源性途径内源性途径内源性途径(主要途径主要途径主要途径主要途径)谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺 oror单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶AHHT T外源性途径外源性途径外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径旁路途径旁路途径)(HHypoxanthine ypoxanthine g guznine uznine p phosphohosphor ribosyl ibosyl t transferase)ransferase)次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRTHGPRT )胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶 (TK TK)(T Thymidine hymidine k kinase)inase)B B淋巴细胞：淋巴细胞：淋巴细胞：淋巴细胞：HGPRTHGPRT+，TKTK+骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：HGPRTHGPRT-，TKTK-存活存活存活存活死亡死亡死亡死亡外源性途径外源性途径外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径旁路途径旁路途径)6可编辑版二、杂交瘤技术的操作流程二、杂交瘤技术的操作流程1.动物免疫：动物免疫：目的：目的：目的：目的：在在在在细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合后后后后获获获获得得得得尽尽尽尽可可可可能能能能多多多多的的的的分分分分泌泌泌泌针针针针对对对对于于于于该该该该目目目目标标标标抗抗抗抗原原原原的的的的特特特特异异异异性性性性抗抗抗抗体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞.特定特定特定特定目标抗原目标抗原目标抗原目标抗原动物动物动物动物免疫免疫免疫免疫脾脏中脾脏中脾脏中脾脏中B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞大量增殖大量增殖大量增殖大量增殖刺激刺激刺激刺激能分泌针对于该抗能分泌针对于该抗能分泌针对于该抗能分泌针对于该抗原的原的原的原的特异性抗体特异性抗体特异性抗体特异性抗体7可编辑版常规免疫法常规免疫法常规免疫法常规免疫法脾内一次性免疫法脾内一次性免疫法脾内一次性免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法短程免疫法短程免疫法短程免疫法体外免疫法体外免疫法体外免疫法体外免疫法 常用免疫方法：常用免疫方法：常用免疫方法：常用免疫方法：“稳妥；优势克隆稳妥；优势克隆稳妥；优势克隆稳妥；优势克隆”皮下注射皮下注射皮下注射皮下注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射静脉注射静脉注射静脉注射静脉注射免疫途径：免疫途径：免疫途径：免疫途径：“省时；省抗原省时；省抗原省时；省抗原省时；省抗原”“省时省时省时省时”“操作繁琐操作繁琐操作繁琐操作繁琐”8可编辑版常规免疫法：常规免疫法：常规免疫法：常规免疫法：第第第第1 1次免疫：次免疫：次免疫：次免疫：抗原抗原抗原抗原+福氏完全佐剂福氏完全佐剂福氏完全佐剂福氏完全佐剂第第第第2 2次免疫次免疫次免疫次免疫：抗原抗原抗原抗原+福氏不完全佐剂福氏不完全佐剂福氏不完全佐剂福氏不完全佐剂第第第第3 3次免疫次免疫次免疫次免疫：抗原抗原抗原抗原+不加佐剂不加佐剂不加佐剂不加佐剂第第第第4 4次免疫次免疫次免疫次免疫：抗原抗原抗原抗原+不加佐剂不加佐剂不加佐剂不加佐剂(皮下注射或静脉注射皮下注射或静脉注射皮下注射或静脉注射皮下注射或静脉注射)(皮下注射皮下注射皮下注射皮下注射)(皮下注射皮下注射皮下注射皮下注射)(静脉注射静脉注射静脉注射静脉注射)9可编辑版二、细胞融合及二、细胞融合及HAT筛选筛选uu病毒介导的细胞融合病毒介导的细胞融合病毒介导的细胞融合病毒介导的细胞融合uuPEGPEG介导细胞融合介导细胞融合介导细胞融合介导细胞融合uu电激融合电激融合电激融合电激融合1 1、细胞融合方法：、细胞融合方法：10可编辑版细胞悬液的制备与融合细胞悬液的制备与融合细胞悬液的制备与融合细胞悬液的制备与融合 (1)(1)脾细胞悬液的制备：脾细胞悬液的制备：脾细胞悬液的制备：脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第最后一次免疫后第最后一次免疫后第最后一次免疫后第3 3天制备天制备天制备天制备 (2)(2)骨髓瘤细胞悬液的制备：骨髓瘤细胞悬液的制备：骨髓瘤细胞悬液的制备：骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备于对数生长期制备于对数生长期制备于对数生长期制备 (3)(3)细胞融合：细胞融合：细胞融合：细胞融合：50%PEG(10004000),pH8.0,3850%PEG(10004000),pH8.0,38o oC,1minC,1min11可编辑版2 2、HATHAT培养基的筛选培养基的筛选培养基的筛选培养基的筛选融合后细胞混合液融合后细胞混合液融合后细胞混合液融合后细胞混合液HATHAT培养基培养基培养基培养基2 weeks later2 weeks laterHTHT培养基培养基培养基培养基正常培养基正常培养基正常培养基正常培养基1 week later1 week later12可编辑版三、抗体的检测三、抗体的检测要求：要求：要求：要求：简便、快速、敏感简便、快速、敏感简便、快速、敏感简便、快速、敏感;在短时间内能检测大量样品在短时间内能检测大量样品在短时间内能检测大量样品在短时间内能检测大量样品常用方法：常用方法：常用方法：常用方法：pp酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)pp间接免疫荧光法间接免疫荧光法间接免疫荧光法间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence,IFA)(Indirect immunofluorescence,IFA)pp放射免疫法放射免疫法放射免疫法放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)(radioimmunoassay,RIA)pp双相扩散法双相扩散法双相扩散法双相扩散法13可编辑版酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法(ELISA)(ELISA)抗原抗原抗原抗原第第第第1 1抗体抗体抗体抗体酶酶酶酶第第第第2 2抗体抗体抗体抗体待检杂交瘤培养上清液待检杂交瘤培养上清液待检杂交瘤培养上清液待检杂交瘤培养上清液底物底物底物底物有色产物有色产物有色产物有色产物酶标仪检测酶标仪检测酶标仪检测酶标仪检测技术原理：技术原理：技术原理：技术原理：14可编辑版四、克隆化四、克隆化常用克隆化方法：常用克隆化方法：常用克隆化方法：常用克隆化方法：常用克隆化方法：常用克隆化方法：有限稀释法有限稀释法有限稀释法有限稀释法软琼脂平板法软琼脂平板法软琼脂平板法软琼脂平板法显微操作法显微操作法显微操作法显微操作法uu8080个细胞个细胞个细胞个细胞/96/96孔孔孔孔uu饲养细胞饲养细胞饲养细胞饲养细胞(feeder cells)(feeder cells)ELISAELISA法法法法检检检检测测测测单单单单克克克克隆隆隆隆杂杂杂杂交交交交瘤瘤瘤瘤细细细细胞胞胞胞的的的的培培培培养养养养上上上上清清清清，选选选选出出出出分分分分泌泌泌泌特特特特异异异异性性性性抗抗抗抗体体体体的的的的阳阳阳阳性性性性孔孔孔孔，所所所所分分分分泌泌泌泌抗抗抗抗体体体体即即即即为为为为单克隆抗体。单克隆抗体。单克隆抗体。单克隆抗体。15可编辑版由由由由单单单单一一一一克克克克隆隆隆隆的的的的杂杂杂杂交交交交瘤瘤瘤瘤细细细细胞胞胞胞分分分分泌泌泌泌的的的的抗抗抗抗体体体体，只只只只针针针针对对对对于于于于一一一一个个个个抗抗抗抗原原原原决决决决定定定定簇簇簇簇单单单单克克克克隆隆隆隆抗抗抗抗体体体体(monoclonal(monoclonal antibody,MAb)antibody,MAb)单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)(monoclonal antibody,MAb)(monoclonal antibody,MAb)单克隆抗体优点：单克隆抗体优点：单克隆抗体优点：单克隆抗体优点：高度纯一高度纯一高度纯一高度纯一 高度专一高度专一高度专一高度专一应用：应用：应用：应用：疾病的论断和治疗疾病的论断和治疗疾病的论断和治疗疾病的论断和治疗(生物导弹生物导弹生物导弹生物导弹)生物大分子的鉴定、定位和分离纯化生物大分子的鉴定、定位和分离纯化生物大分子的鉴定、定位和分离纯化生物大分子的鉴定、定位和分离纯化细胞器的鉴定、定位和分离细胞器的鉴定、定位和分离细胞器的鉴定、定位和分离细胞器的鉴定、定位和分离特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离16可编辑版五、大规模培养五、大规模培养批量生产单克隆抗体批量生产单克隆抗体批量生产单克隆抗体批量生产单克隆抗体常用的大规模培养方法：常用的大规模培养方法：常用的大规模培养方法：常用的大规模培养方法：常用的大规模培养方法：常用的大规模培养方法：动物接种法动物接种法动物接种法动物接种法转瓶培养法转瓶培养法转瓶培养法转瓶培养法细胞培养罐法细胞培养罐法细胞培养罐法细胞培养罐法17可编辑版培养上清中培养上清中培养上清中培养上清中X X X X抗体的检测抗体的检测抗体的检测抗体的检测克隆化培养克隆化培养克隆化培养克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中X X X X抗体的检测抗体的检测抗体的检测抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养规模化培养规模化培养规模化培养获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体动物免疫动物免疫动物免疫动物免疫 细胞融合细胞融合细胞融合细胞融合混合细胞的混合细胞的混合细胞的混合细胞的HATHATHATHAT筛选筛选筛选筛选)分泌分泌分泌分泌X X X X抗体抗体抗体抗体B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞X X X X抗原抗原抗原抗原B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞瘤的突变株瘤的突变株瘤的突变株瘤的突变株培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡 无限生长细胞无限生长细胞无限生长细胞无限生长细胞 分泌分泌分泌分泌X X X X抗体抗体抗体抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/cBALB/c杂交瘤技术操作流程图解杂交瘤技术操作流程图解杂交瘤技术操作流程图解杂交瘤技术操作流程图解18可编辑版抗体纯化抗体纯化抗体纯化抗体纯化洗脱液洗脱液洗脱液洗脱液支持物支持物支持物支持物被分离物质被分离物质被分离物质被分离物质被分离物质被分离物质被分离物的抗体被分离物的抗体被分离物的抗体被分离物的抗体其它物质其它物质其它物质其它物质亲亲亲亲合合合合层层层层析析析析原原原原理理理理图图图图解解解解19可编辑版