基于CRISPR_Cas12a系统的比色检测方法探究.pdf

982023年8月上 第15期 总第411期工艺设计改造及检测检修China Science&Technology Overview0 引言分子诊断技术与公共卫生息息相关，它可以用于食品检测、水质监察、微生物分析等方面，而且能够用于癌症筛查、疾病诊断等临床操作1-4。目前的分析实验室和检测机构中通常依赖的实时荧光定量 PCR 技术、基因测序等方法较为复杂繁琐，亟须发展通用的、简单的检测技术和手段来进行分子诊断。近年来，CRISPR系统的发现与探究为科研学者打开了一扇新的大门。序列的特异性识别功能使得CRISPR 系统被应用在越来越多的领域。最早被发现的是 Cas9 蛋白，后来陆续发现 Cas12a 蛋白、Cas13a 蛋白、Cas14 蛋白等5-7。一旦Cas蛋白复合物识别出它们的目标DNA或RNA后，活性被激活，其中单链DNA（ssDNA）或RNA（ssRNA）底物以非特异性的方式被切割降解，这种行为被称作反式切割。本研究开发出一种基于 CRISPR 系统和 AuNPs-DNA 探针的比色检测方法，开发的比色检测方法在 CRISPR 系统的识别辅助下具有较高特异性及简便性。1 材料与方法1.1 主要材料与试剂所用核酸序列由上海生工公司合成；用于蛋白表达和纯化的试剂与耗材由广州莱博瑞公司提供；用于表达AsCas12a的6His-MBP-TEV-huAsCpf1质粒由美国麻省理工学院张峰赠送(Addgene质粒#90095，RRID:Addgene_90095)；所用化学试剂均为分析纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司；实验中使用超纯水(18.25m)。实验所用序列如表 1 所示。1.2 主要仪器与设备多功能酶标仪：美国 MD 公司的 SpectraMax iD5 多功能酶标仪；恒温水浴锅：常州国华电器有限公司的 HH-4；桌面型迷你离心机：上海生工公司的 G508010；台式高速微量冷冻离心机：中国海尔生物医疗公司的 LX-165T2R。1.3 试验条件（1）AuNPs 的合成。AuNPs 由柠檬酸钠还原法制备。实验前，将所要用到的玻璃器皿浸泡在王水(浓硝酸:浓盐酸=1:3)中 30min 以上，之后用超纯水冲洗干净，烘干备用。将 100mL 浓度为 1mM 的氯金酸溶液加入 250mL 的烧瓶中，边搅拌边加热，直至溶液沸腾。待沸腾稳定后，向烧瓶中加入 10mL 浓度为 38.8mM 的柠檬酸钠溶液，并快速搅拌。几秒钟之内溶液颜色由浅黄变为无色，并迅速变为黑色，继续搅拌加热，溶液颜色在 5min 内经历从黑色到红色的变化。20min 后停止加热，溶液持续搅拌直至冷却到室温，即得到直径为 13nm 的 AuNPs，AuNPs溶液在 520nm 处吸收值最大，制备好的 AuNPs 溶液转入棕色瓶中 4保存，待进一步使用。（2）AuNPs-DNA 探针的标记。AuNPs-DNA 探针标记实验使用冷冻法进行。具体方法为将 50L 浓度为 10M含多聚腺嘌呤标记的 DNA 探针加入 1mL 浓度为 5nM 的AuNPs 溶液中。溶液混匀后放置于-20冰箱中至少 2h。待室温下溶液解冻后，在 4、12000r/min 条件下高速收稿日期：2022-12-29作者简介：元超群（1993），男，河南林州人，硕士研究生，助理工程师，研究方向：产品检验检测。基于 CRISPR/Cas12a 系统的比色检测方法探究元超群（新乡市食品药品检验所，河南新乡 453000）摘要：基于 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas12a（CRISPR/Cas12a）系统的特征基因识别检测技术，已经可以实现 DNA 的普适性检测。同时，基于 CRISPR/Cas12a 系统的反式酶切活性，可以降解（有目标 DNA）或者不降解（无目标 DNA）检测体系中添加的指示探针，设计一对通用的 DNA 纳米金探针进行裸眼可视化 DNA 比色检测。整个检测过程与结果读出不依赖于实时定量荧光 PCR 仪、恒温培养箱等大型仪器，整个流程可以在 1 小时之内完成。关键词：CRISPR/Cas12a；反式酶切活性；DNA 纳米金探针；比色检测中图分类号：TS207.3 文献标识码：B 文章编号：1671-2064(2023)15-0098-03表1 基于CRISPR/Cas12a系统所使用的序列情况表Nucleic acids IDSequence(5-3)AuNPs-DNA probe 1AAAAAAAAAATTTTTATGATGTTCGTTGTGAuNPs-DNA probe 2AAAAAAAAAATTTTTCGTTTAGGATTTGTGLinker ssDNATCCTAAACACCACAACGAACEGFP crDNA-1GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTCTTGTAGATCTCAGGGCGGACTGGGTGCTEGFP crDNA-2AGCACCCAGTCCGCCCTGAGATCTACAAGAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCEGFP crRNAUAAUUUCUACUCUUGUAGAUCUCAGGGCGGACUGGGUGCU992023年8月上 第15期 总第411期工艺设计改造及检测检修China Science&Technology Overview离心 30min，将上清液抽吸弃去，沉淀在清洗缓冲液中重悬，此清洗步骤重复 3 次。最后，在重悬缓冲液中将沉淀重悬，AuNPs-DNA 探针溶液置于棕色瓶中 4保存。（3）AsCas12a 蛋白蛋白的表达和纯化。委托华南师范大学生命科学学院周小明教授课题组进行。（4）基于 CRISPR/Cas12a 系统的通用、可视化比色检测。Cas12a/crRNA 反应缓冲液为：100mM 氯化钠、Tris-盐酸 50mM、10mM 氯化镁、100g/mL BSA 蛋白、pH=7.9。20L 反应体系中包含 100nM AsCas12a 蛋白，200nM crRNA 和 200nM 的基底 Linker ssDNA。DNA 扩增产物被添加到反应体系中，将混合液置于 37水浴锅反应 20min。与 60L 的 AuNPs-DNA 探针预混液混匀。混合液在室温下孵育 3min 后，经小型台式离心机短暂低速离心。将上清吸至新 PCR 管中，在 LED 白色背光板上进行比色分析。2 结果与分析研究表明，当 Cas12a 蛋白与 crRNA 及其目标 DNA形成三联复合体时，除了对目标 DNA 切割之外，还能够将反应体系内单链 DNA 无序裂解成 2 4 个核苷酸片段，Cas12a 的顺式切割和反式切割活性均与其 RuvC 结构域有关。同时也有研究表明，Cas13a 蛋白与 crRNA 及其靶RNA 形成三联复合体时，也有类似切割 RNA 的能力。利用 Cas12a 蛋白和 Cas13a 蛋白的这种依赖于靶标的反式切割活性，本研究开发了一种基于 AuNPs-DNA 探针光学特性的新型比色检测方法，具体原理如图 1 中 a 图所示。在该检测平台中，设计了通用的 Linker ssDNA 或ssRNA 作为 CRISPR/Cas12a 系统或 CRISPR/Cas13a 系统的反式切割底物，设计一对通用的 AuNPs-DNA 探针与 Linker ssDNA 或 ssRNA 杂交。在没有目的靶标存在的情况下，反式切割不会被激活，因此 Linker ssDNA 或ssRNA 在反应体系中保持完整，AuNPs-DNA 探针对将与其进行杂交诱导交联形成聚合态。当 Cas12a/crRNA 复合物和 Cas13a/crRNA 复合物分别识别它们的目标 DNA 或RNA 时，反式切割被激活，Linker ssDNA 或 ssRNA 被降解，AuNPs-DNA 探针对失去了杂交的 Linker ssDNA或 ssRNA，从而变得分散。由于 AuNPs-DNA 探针的光学特性，可以通过观察溶液颜色实现比色检测。比色检测方法原理确定之后，比色检测方法的工作流程也被确定，如图 1 中 b 图所示。由于可以预先制备 Cas蛋白/crRNA 复合物、Linker ssDNA 或 ssRNA 底物和AuNPs-DNA 探针对混合液，并且这些组分都适合长期保存，因此整个检测过程可以分为 3 个步骤：溶液 1 的制备、溶液 2 的制备和裸眼比色检测。溶液 1 是将目的靶标与 Cas 蛋白/crRNA 复合物和 Linker ssDNA 或 ssRNA底物混合，目标物能够激活 CRISPR/Cas 系统的反式切割反应。溶液 2 的制备只需将 AuNPs-DNA 探针对等比例混合即可。最后将溶液 1 与溶液 2 混匀，孵育 3min 后，经低速离心处理，即可裸眼分析检测结果。通过观察溶液的颜色变化，能够可视化分析核酸样品的不同拷贝数。c图1 基于CRISPR/Cas系统的通用、可视化比色检测方法的原理图和工作流程Cas12a/crRNA 复合物和 Cas13a/crRNA 复合物具有依赖于靶标的反式切割活性。在靶标存在的情况下，Linker ssDNA 或 ssRNA 被切割裂解，AuNPs-DNA 探针对失去杂交连接，变得分散。在没有靶标的情况下，Linker ssDNA或 ssRNA 保持完整。AuNPs-DNA 探针对与 Linker ssDNA或 ssRNA 的交联反应导致聚合。基于 CRISPR/Cas 系统的通用、可视化比色检测的工作流程：首先，在 Linker ssDNA 或 ssRNA 存在下，将靶标 DNA 或 RNA 添加到 Cas蛋白/crRNA 复合物中以制备溶液 1。其次，将 AuNPs-DNA 探针对等比例混合以制备溶液 2。最后，进行裸眼可视化比色检测，通过向溶液 2 中加入溶液 1 见图 1（C），进行低速离心完成此操作。探究AuNPs-DNA探针对完全交联反应时Linker ssDNA或 ssRNA 的浓度。以 Linker ssDNA 为例，测试了不同Linker ssDNA浓度下，AuNPs-DNA探针对的交联反应情况。测量不同形式下AuNPs-DNA探针对溶液在520nm 处的吸收值情况，结果表明，当 Linker ssDNA 浓度大于30nM 时，AuNPs-DNA 探针对的交联反应达到饱和，使用低速离心方法处理之后，能够观察到非常明显的颜色变化。当 Linker ssDNA 浓度为 40nM 时，低速离心方法能够得到足够清晰的背景信号，信噪比显著提高。以 10ng/L EGFP 基因作为检测目标,在 Cas12a/crRNA 复合物和 40 nM 基底 Linker ssDNA 的存在时，评估了 CRISPR/Cas12a 系统依赖于目标的反式切割的反应时间。实验结果表明，切割 Linker ssDNA 的反应可以在 20min 内完成。最后，测试了基底 Linker ssDNA 的长度，对不同长度的 Linker ssDNA 进行实验，发现 Cas12a 蛋白没有这种1002023年8月上 第15期 总第411期工艺设计改造及检测检修China Science&Technology Overview长度依赖关系。考虑到较长的序列可能在室温下形成影响杂交的二级结构，本研究选择了一个 20bp 长度的 Linker ssDNA。实验结果如图 2 所示。图2 基于CRISPR/Cas12a系统的通用、可视化比色检测方法的条件探究（a）低速离心法辅助裸眼可视化检测。由于 Linker ssDNA 的裂解，AuNPs-DNA 探针对失去杂交模板，从而变得高度分散。低速离心前后颜色无变化；在完整的 Linker ssDNA 中，AuNPs-DNA 探针对和 Linker ssDNA 之间的杂交交联会导致颜色从红色变为品红，交联物经低速离心后沉淀在管底，溶液变得无色透明。（b）通过直接观察颜色变化和在 520nm 处测量吸收值筛选 Linker ssDNA 浓度。（c）通过低速离心法筛选 Linker ssDNA 浓度。（d）在低速离心处理情况下，利用 AuNPs-DNA 探针对与 CRISPR/Cas12a 系统中的反式切割活性进行反应动力学测定。（e）在低速离心处理情况下，对 AuNPs-DNA 探针对与CRISPR/Cas12a 系统中的 Linker DNA 长度进行分析。此时，基于 CRISPR/Cas12a 系统的通用、可视化基因检测平台的条件探究已经完成。最终结果表明，基于CRISPR/Cas 系统的可视化检测方法只需要 20min 的孵育时间，基底 Linker ssDNA 或 ssRNA 浓度为 40nM，长度为 20bp，低速离心处理之后会有较高的信噪比结果。3 结论基于 CRISPR/Cas12a 系统的通用、可视化基因检测平台的检测流程已经明确，待测核酸经过扩增后，进行 20min的CRISPR/Cas系统反应，反应液与预混的AuNPs-DNA 探针对溶液混合，短暂室温孵育，经过低速离心(5000r/min)处理后进行颜色观察分析。目前，本研究正在积极探索其在实际样品检测中的表现。后续，将进一步探究基于CRISPR/Cas13a 系统的通用、可视化基因检测平台的检测应用情况以及这两种方法在基因分型等方面的应用。本研究所提出的这种新型检测方法只得到一个初步的结论，需要对其不断优化和改进，赋予其巨大潜力。参考文献1 Nicolaides K H,Syngelaki A,Ashoor G,et al.Noninvasive Prenatal Testing for Fetal Trisomies in a Routinely Screened First-Trimester PopulationJ.Obstetrical&Gynecological Survey,2013,68(3):173-175.2 Daniel C Koboldt 1,Qunyuan Zhang,David E Larson,et al.VarScan 2:Somatic Mutation and Copy Number Alteration Discovery in Cancer by Exome SequencingJ.Genome Research,2012,22(3):568-576.3 Makarova K S,Haft D H,Barrangou R,et al.Evolution and Classification of the CRISPRCas SystemsJ.Nature Reviews Microbiology,2011,9(6):467-477.4 Horvath P,Barrangou R.CRISPR/Cas,the Immune System of Bacteria and ArchaeaJ.Science,2010,327(5962):167-170.5 Mali P,Yang L,Esvelt K M,et al.RNA-guided Human Genome Engineering Via Cas9J.Science,2013,339(6121):823-826.6 Jinek M,Chylinski K,Fonfara I,et al.A Programmable Dual-RNAguided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial ImmunityJ.Science,2012,337(6096):816-821.7 Cong L,Ran F A,Cox D,et al.Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas SystemsJ.Science,2013,339(6121):819-823.Study on Colorimetric Detection Based on Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas12a SystemYUAN Chaoqun(Xinxiang Food and Drug Inspection Institute,Xinxiang Henan 453000)Abstract:The identification and detection technology of pathogenic microorganism characteristic genes based on the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas12a(CRISPR/Cas12a)system has been able to realize the universal detection of DNA pathogenic genes.At the same time,based on the trans digestion activity of CRISPR/Cas12a system,the indicator probes added in the detection system can be degraded(with target pathogenic microorganisms)or not degraded(without target pathogenic microorganisms),a pair of universal DNA nanogold probes are designed for naked-eye visual detection.The whole detection process and result reading do not depend on large-scale instruments such as real-time quantitative fluorescent PCR instrument and thermostatic incubator,and the whole process can be completed within 1 hour.Key words:CRISPR/Cas12a;trans digestion activity;nanogold probes;visual detection