过表达lncRNA AC079466.1通过内质网应激信号通路对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响.pdf

，：；网络出版时间：网络出版地址：过表达 通过内质网应激信号通路对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响冯梦林，卫心怡，王楠娅，王萍，段冷昕（河南科技大学基础医学与法医学院，河南 洛阳 ；吉林大学第一医院肿瘤中心，吉林 长春 ）：文献标志码：文章编号：（）中国 图 书 分 类 号：；摘要：目的初步探讨 在非小细胞肺癌（，）组织和细胞中的表达，及其过表达对 和 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。方法收集 例 患者癌组织及相应的癌旁组织，检测 在组织和细胞中的表达。转染过表达质粒为 组，转染空质粒为 组，无转染为 组。、流式细胞术、检测过表达 对 和 细胞活力、凋亡、迁移和侵袭的影响；检测过表达 对内质网应激相关因子 、，以及 、表达的影响。结果与癌旁组织相比，癌组织中 的表达水平明显降低；与 细胞相比，在 和 细胞的表达量明显降低。与 组和 组相比，组 和 细胞的活力、迁移、侵袭能力均明显下降，凋亡率明显升高，内质网应激相关因子 、，以及 、表达均明显上调。结论过表达 可明显抑制 和 细胞的活力、迁移和侵袭能力，并促进细胞的收稿日期：，修回日期：基金项目：国家自然科学基金资助项目（）作者简介：冯梦林（），女，硕士生，研究方向：分子药理学，：；段冷昕（），女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：分子药理学，通信作者，：凋亡，其机制可能与促进内质网应激介导的细胞凋亡有关。关键词：长链非编码 ；非小细胞肺癌；增殖；凋亡；侵袭；内质网应激开放科学（资源服务）标识码（）：非 小 细 胞 肺 癌（，）是一种以代谢异常为特征的致死性疾病，占所有肺癌病例的 。近年来，尽管对 采用联合化疗和放射治疗，但由于不良预后与恶性肿瘤细胞的侵袭性，以及患者的耐药性，其治愈率仍很低，年生存率仅为 。因此，探索 的发生发展机制，寻找早期诊断标志物，用于诊断和预防 具有重要意义。长链非编码 （，）为长度大于 个核苷酸、不编码蛋白质的 转录物。最初被认为是“垃圾序列”，没有特定的生物学功能，很多研究发现 在癌组织中异常表达与肿瘤的发生发展密切相关 。课题组前期通过 测序发现，在肺癌中具有差异性表达，且有文献报道，在肝癌和胃腺癌中的表达同样具有差异性 ，但其调控作用及机制未知，且其在肺癌中的相关作用尚未明确。本 研 究 旨 在 探 讨 在 组织和细胞中的表达，初步研究 中国药理学通报 ；（）：作为肺癌标志物，用于指导临床诊断以及作为治疗靶点的潜能。材料 组织与细胞本研究收集了 例来自吉林大学第一医院肿瘤外科接受手术的 患者的组织标本，同时留取肿瘤组织及距肿瘤 以上的癌旁组织，置于 超低温冰箱中保存。所有患者知情同意，研究经吉林大学第一医院伦理委员会批准。正常肺上皮细胞系 ，以及 细胞系 、，均为河南科技大学基础医学院科研中心实验室留存。主要试剂 细胞培养液、噻唑蓝（）、双染试剂盒，购自 公司；胎牛血清，购自浙江天航生物科技股份有限公司；转染试剂，购自 公司；提取试剂盒，购自 公司；反转录试剂盒，购自 公司；试剂盒，购自康为世纪生物科技股份有限公司；基质胶，购自 公司；一抗葡萄糖调节蛋白 （，）、蛋白激酶 样内质网激酶（，）、转录激活因子 （，）、及二抗，购自 公司；一抗真核生物起始因子 （，）、增强子结合蛋白同源蛋白（，），购自 公司；一抗 ，购自沈阳万类生物科技有限公司；一抗 ，购自 公司。仪器全波长酶标仪（美国 公司）；实时荧光定量 仪（公司）；流式细胞仪（美国 有限公司）；全自动化学发光图像分析仪（上海天能科技有限公司）。方法 质粒载体的构建通过 网站检索可知，是个多外显子的 ，具有 个转录本，最长的转录本长度为 ，包含 个外显子，其中外显子 具有调控作用。将 扩增的 序列亚克隆到 真核表达载体中，构建 过表达质粒。细胞培养及分组使用含 胎牛血清的 培养液培养 、细胞。细胞生长到约 时，使用胰蛋白酶消化，接种至 孔板中，每孔细胞数为 个。细胞分组如下：组（细胞）、组（转染空质粒）、组（转染 过表达质粒）。使用 质粒和 转染试剂进行细胞转染，放置培养箱中培养，转染 更换新鲜培养液，后荧光倒置显微镜下观察转染效果，收集细胞进行后续实验。检 测 组 织 和 细 胞 中 的表达采用总 提取试剂盒提取 组织，以及 、细胞的总 ，按照试剂盒说明书合成 ，应用 试剂盒，配制反应体系，每个样品设 个复孔，参照两步法进行扩增反应，获得循环阈值（）。以 为内参，采用 法分析 在 、细胞中的表达水平。引 物 序 列 为 ：，：；引物序列为 ：，：。法检测细胞活力情况转染 后，收集各组细胞，每孔 接种于 孔板，每孔细胞数为 个，每组设 个复孔。在培养结束前，每孔分别加入 ，弃去培养液，每孔加入 ，振荡 ，分别在培养 、时检测细胞的吸光度（，）值，在酶标仪 波长处检测每孔 值。流式细胞仪检测细胞凋亡转染 后收集各组细胞，用不含 的胰蛋白酶消化，每管，每管细胞数为 个，加入 混匀，放置室温避光孵育 ，再加入 ，以及 ，立刻进行流式检测。法检测细胞迁移情况转染 后收集各组细胞，将每孔细胞数调整为 个，上室加入不含血清的细胞悬液 ，下室每孔加入含 血清的细胞培养液 ，培养 ，将小室浸泡在 的多聚甲醛中，细胞固定 ，使用 的结晶紫染色 ，最后用棉签擦拭掉小室内室中未迁移的细胞，显微镜下随机取 个视野。法检测细胞侵袭情况 胶使用 无血清培养液（）稀释，取 加入上室，将小室放入 孔板中，培养箱放置 ，其余步骤同“”。检测内质网应激相关因子的表达转染 后收集各组细胞，加入 的裂解液（），在冰上裂解 。离心取上清，试剂盒测定蛋白样品浓度，进行中国药理学通报 ；（）电泳。按照分组顺序进行蛋白上样，电泳后转移至 膜，的脱脂奶粉封闭，加入 稀释的一抗（、）孵育过夜，二抗孵育 （稀释比例 ），曝光。以 为内参，分析各组条带灰度值，比较各组相关蛋白的表达水平。统计学处理实验数据使用 进行分析，以珋 表示，两组间比较采用 检验，多组间比较采用单因素方差分析。以 表示为差异具有统计学意义。结果 在 组织及细胞中的表达情况 结果显示，与癌旁组织相比，在癌组织中的表达量明显降低（）。与正常肺上皮细胞 相比，在 及 细胞中的表达量明显降低（）。（珋 ，）：，过表达质粒在 和 细胞中的转染效率细胞转染 后，使用荧光倒置显微镜观察细胞，通过荧光标记物 的表达判断，转染效率约为 （）。为了进一步确认细胞的转染效率，通过 检测 过表达质粒组和 组细胞中 的表达水平。结果显示（），与 组相比，转染了 过表 达 质 粒 的 、细 胞 中，表达明显升高（）。（珋 ，）：（）；：中国药理学通报 ；（）过表达 对细胞活力的影响如 所示，与 组相比，组细胞 值均明显减小（，），提示过表达 可明显抑制 和 细胞的活力。过表达 对细胞凋亡的影响如 所示，与 组相比，组 细胞凋亡率明显增加（），提示过表达 能够促进 和 细胞凋亡。过表达 对细胞迁移和侵袭的 影 响 如 所 示，与 组 相 比，组 细胞迁移数量和细胞侵袭数量 明 显 减 少（），提 示 过 表 达 能够抑制 和 细胞的迁移和侵袭。过表达 对内质网应激相关蛋白表达的影响与 组相比，组 细胞中内质网应激相关蛋白 、和 表达明显升高（）。结果见 。过表达 对 、蛋白表达的影响如 所示，与 组相比，组 细胞中 、表达明显升高（）。（）（）（珋 ，），（）（）（珋 ，）中国药理学通报 ；（）（珋 ，）：；：（）讨论 是一种新发现的长度超过 个核苷酸的非蛋白编码转录本，在肿瘤的发生、发展中起重要作用 。通过 网站检索可知，是个多外显子的 ，具有 个转录本，最长的转录本长度为 ，包含 个外显子，其中外显子 具有调控作用。本研究结果显示，与癌旁组织相比，在 组织中的表达明显降低；与正常肺上皮细胞 相比，在 和 细胞中也呈现低表达，即 在 组织和细胞系 、中的表达均明显降低。过表达 后，可抑制 和 细胞的活力，且细胞凋亡率明显上升，细胞的迁移和侵袭能力也被明显抑制。这些 结 果 提 示 过 表 达 在 细胞中可能是一种抑癌因素。内质网是细胞内执行多种功能的精细小管网络，是蛋白质修饰的场所 。内质网应激（，）是当内质网受到压力时，由于折叠不当、糖基化不足和 或转运受阻，内质网会出现蛋白质堆积，这通常是由于蛋白质表达的突然增加，导致伴侣蛋白不足、内质网腔空间饱和或翻译后修饰的营养不足 。现已证明，和随后的未折叠蛋白反应（，）在多种癌细胞（包括肺癌细胞在内）的稳态过程调节中起着核心作用 。许多肿瘤相关的 可以通过激活 调控肿瘤细胞的凋亡。因此，了解 表达与 之间的关系可以开辟新的途径，并提出治疗各种类型癌症的潜在疗法 。是内质网上重要的分子伴侣，也是 发生的标志性蛋白，表达上调是 发生的标志。促凋亡因子 是 凋亡的标志性蛋白，在 介导的细胞凋亡中起关键作用 。本研中国药理学通报 ；（），（珋 ，）（珋 ，）究发 现，在 细 胞 系 中 过 表 达 可使 的表达量增加，提示 的发生，并明显上调 信号通路各因子的表达，诱导 介导的细胞凋亡。此外，过表达 也可使凋亡相关蛋白 、表 达 明 显 上 调。提 示 可能通过诱导 介导的细胞凋亡来发挥其调控作用，为深入认识 在 中的调控机制，以及其成为临床治疗靶标的潜能提供了一定的实验基础。综上，在 组织及 、细胞系中均呈现低表达，过表达 可明显抑制 和 细胞的活力、迁移和侵袭，促进细胞的凋亡，机制可能与其调控 信号通路 介导的细胞凋亡有关。提示 可能在 发生发展中起重要作用，有成为 治疗新靶点的潜能，但其在 中的具体调控机制仍需更深入的研究。参考文献：，（）：王冰，苏崇玉，刘志东 在非小细胞肺癌组织中的表达及生物学作用 现代肿瘤医学，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，中国药理学通报 ；（），：，（）：王安琪，孙国平内质网应激在抗肿瘤治疗中的作用及研究进展 中国药理学通报，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（，；，）：（），：；中国药理学通报 ；（）