《电泳分离技术》.ppt

第十一章第十一章 电泳分离技术电泳分离技术广泛应用于各个科学领域的新型广泛应用于各个科学领域的新型分离技术分离技术1 1整理整理pptppt概述概述在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。迁移速率不同，可实现分离。2 2整理整理pptppt18091809年俄国物理学家年俄国物理学家PeiicePeiice首次发现电泳现象，他在湿粘首次发现电泳现象，他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。移动，这就是电泳现象。19091909年年MichaelisMichaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同他用不同pHpH的溶液在的溶液在U U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。的电泳移动和等电点。19371937年，年，Tiselius(Tiselius(瑞典瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白。球蛋白。3 3整理整理pptpptl l第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；l l19481948年，获诺贝尔化学奖；年，获诺贝尔化学奖；4 4整理整理pptppt由于早期的电泳仪价格昂贵，分辨率低，易产生对流，因由于早期的电泳仪价格昂贵，分辨率低，易产生对流，因而逐渐发展起了区带电泳。而逐渐发展起了区带电泳。自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。不便于推广应用。区带电泳是指在电泳迁移中以一个缓冲溶液饱和了的固相区带电泳是指在电泳迁移中以一个缓冲溶液饱和了的固相介质作为支持介质，减少外界干扰的电泳技术。介质作为支持介质，减少外界干扰的电泳技术。凝胶电泳和等电聚焦电泳由于其明显的优越性，得到了越凝胶电泳和等电聚焦电泳由于其明显的优越性，得到了越来越广泛的应用。来越广泛的应用。5 5整理整理pptppt电泳分析的特点电泳分析的特点 各种电泳技术具有如下特点：各种电泳技术具有如下特点：凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可以进凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可以进行定性或定量分析；行定性或定量分析；样品量极少；样品量极少；设备简单，可在常温下进行；设备简单，可在常温下进行；操作简单省时；操作简单省时；分辨率高。已被广泛应用于基础理论研究，临床诊断及工分辨率高。已被广泛应用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。业制造等方面。6 6整理整理pptppt 电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：改进，以实现下列目标：1 1、提高分辨率及灵敏度。、提高分辨率及灵敏度。2 2、简化操作，缩短电泳时间。、简化操作，缩短电泳时间。3 3、扩大应用范围。、扩大应用范围。7 7整理整理pptppt电泳的分类电泳的分类1.1.电泳按其分离原理不同，分为区带电泳、移动界面电泳、电泳按其分离原理不同，分为区带电泳、移动界面电泳、等速电泳、等电聚焦电泳等。等速电泳、等电聚焦电泳等。区带电泳区带电泳自由界面电泳自由界面电泳等速电泳：等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。分成清晰的界面，并以等速向前运动。等电聚焦电泳：等电聚焦电泳：由两性电解质由两性电解质在在电场中自动形成电场中自动形成pHpH梯度，当被分离的生物梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的大分子移动到各自等电点的pHpH出聚集成很窄的区带。出聚集成很窄的区带。8 8整理整理pptppt2.2.电泳按支持介质的不同，分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、电泳按支持介质的不同，分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDSSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳等。凝胶电泳等。3.3.电泳按支持介质形状的不同，分为薄层电泳、板电泳、柱电电泳按支持介质形状的不同，分为薄层电泳、板电泳、柱电泳等。泳等。4.4.按用途不同可分为分析电泳、制备电泳、定量免疫电泳、连按用途不同可分为分析电泳、制备电泳、定量免疫电泳、连续制备电泳等。续制备电泳等。5.5.按所用电压不同可分为：按所用电压不同可分为：低压电泳：低压电泳：100v500v100v500v，电泳时间较长，适于分离蛋白质等，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。生物大分子。高压电泳：高压电泳：1000v5000v1000v5000v，电泳时间短，有时只需几分钟，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离9 9整理整理pptppt影响电泳速度的因素影响电泳速度的因素颗粒性质：直径、形状、静电荷。颗粒性质：直径、形状、静电荷。电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常压：电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常压：2-10V/cm2-10V/cm溶液性质：电极溶液和蛋白质样品溶液溶液性质：电极溶液和蛋白质样品溶液pHpH、离子强度、溶、离子强度、溶液黏度。液黏度。电渗：电渗：液体对固体支持物的相对移动。颗粒运动的方向与电液体对固体支持物的相对移动。颗粒运动的方向与电渗方向一致时，加快颗粒的迁移率。反之亦然。渗方向一致时，加快颗粒的迁移率。反之亦然。支持介质的筛孔支持介质的筛孔1010整理整理pptpptV V:泳动速度泳动速度泳动速度泳动速度cm/cm/秒秒秒秒oror分分分分d d:泳动距离泳动距离泳动距离泳动距离cmcmt t:电泳时间电泳时间电泳时间电泳时间(秒秒秒秒/分分分分)E E:电场强度电场强度电场强度电场强度 伏特伏特伏特伏特/cm/cmu u:泳动率泳动率泳动率泳动率oror泳动度泳动度泳动度泳动度(cm/(cm/伏伏伏伏 秒秒秒秒oror分分分分)U U:电压电压电压电压 常压常压常压常压(100500v)(100500v)高压高压高压高压(50010000v)(50010000v)仅需几分钟仅需几分钟仅需几分钟仅需几分钟l l:支持场的长度支持场的长度支持场的长度支持场的长度 (有效长度有效长度有效长度有效长度)迁移率迁移率(mobility)：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度.1111整理整理pptppt凝胶电泳凝胶电泳主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖琼脂糖筛分作用小，适于大分子物质筛分作用小，适于大分子物质聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺分离效果好，分辨率高，适于小分子物质分离效果好，分辨率高，适于小分子物质1212整理整理pptppt聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)是一种利用人工合成的凝胶作是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂胺和交联剂N N，N N甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形成的三维空间凝胶网络。成的三维空间凝胶网络。PAGEPAGE具有电泳和分子筛的双重作用。具有电泳和分子筛的双重作用。PAGEPAGE是目前最常用的电泳方法。是目前最常用的电泳方法。1313整理整理pptppt原理原理 以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶为支持物，采用电以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、PHPH、电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为0.10.1毫米），然后再进行毫米），然后再进行分离，从而提高了分辨率。分离，从而提高了分辨率。1414整理整理pptppt聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点 设备简单设备简单样品量小（样品量小（1-1001-100微克）微克）时间短（时间短（30-6030-60分钟）分钟）操作方便操作方便分离范围广（多肽，蛋白，多糖等）分离范围广（多肽，蛋白，多糖等）可提高灵敏度改为超微量测定（可提高灵敏度改为超微量测定（1010-12-121010-9-9）可用于蛋白质分子量测定可用于蛋白质分子量测定1515整理整理pptppt凝胶特性凝胶特性机械性能、弹性、孔径大小等。机械性能、弹性、孔径大小等。T T单体的总百分浓度单体的总百分浓度 C C交联百分浓度交联百分浓度aa丙烯酰胺的克数丙烯酰胺的克数bb亚甲基双丙烯酰胺克数亚甲基双丙烯酰胺克数mm体积体积1616整理整理pptppt聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于总浓度，随浓度的增加聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于总浓度，随浓度的增加而降低。而降低。1717整理整理pptppt有效孔径决定蛋白质的分离有效孔径决定蛋白质的分离1818整理整理pptppt1919整理整理pptppt聚合方式聚合方式光聚合：光聚合：光聚合：光聚合：核黄素为催化剂核黄素为催化剂(阳光阳光,日光日光)，制大孔胶。，制大孔胶。化学聚合：化学聚合：化学聚合：化学聚合：制小孔胶。制小孔胶。过硫酸铵过硫酸铵 APS (APS (引发剂引发剂)N,N,N,N-N,N,N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺 TEMED (TEMED (加速剂加速剂)被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。2020整理整理pptppt特别注意特别注意丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺对中枢神经系统有损伤作用丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺对中枢神经系统有损伤作用.丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺要避光保存丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺要避光保存.混合的溶液保存不宜超过一个月混合的溶液保存不宜超过一个月.2121整理整理pptppt琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳（一）优点（一）优点1.1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3.3.凝凝胶胶结结构构均均匀匀，孔孔径径较较大大，可可用用来来分分离离酶酶的的复复合合物物、核核酸酸、病毒病毒 等大分子物质。等大分子物质。4.4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.6.有热可逆性有热可逆性2222整理整理pptppt（二）缺点（二）缺点1.1.易破碎，浓度不能太低。易破碎，浓度不能太低。2.2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.3.琼琼脂脂糖糖支支持持层层上上的的区区带带易易于于扩扩散散，电电泳泳后后必必须须立立即即固固定定染染色。色。4.4.与与PAGEPAGE相比，分子筛作用小，区带少。相比，分子筛作用小，区带少。2323整理整理pptppt主要性能指标主要性能指标电内渗电内渗胶凝温度胶凝温度熔化温度熔化温度凝胶强度凝胶强度脱水收缩作用脱水收缩作用2424整理整理pptppt琼脂糖的选择琼脂糖的选择2525整理整理pptppt凝胶电泳的应用凝胶电泳的应用常规聚丙烯酰胺电泳常规聚丙烯酰胺电泳分子筛效应提高了分辨率分子筛效应提高了分辨率各种大分子的分离各种大分子的分离研究生物大分子的特性研究生物大分子的特性可保持分离物的生物活性可保持分离物的生物活性2626整理整理pptppt缓冲系统的选择缓冲系统的选择pHpH值由于影响蛋白质的解离，在电泳过程中具有重要作用值由于影响蛋白质的解离，在电泳过程中具有重要作用离子强度既要起到缓冲作用，同时还需产热少，对电流相离子强度既要起到缓冲作用，同时还需产热少，对电流相对贡献小。一般选用较低的离子浓度。对贡献小。一般选用较低的离子浓度。凝胶浓度的选择在于选择合适的孔径。凝胶浓度的选择在于选择合适的孔径。浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶 均一胶均一胶梯度胶梯度胶染色方法常用考马斯亮蓝、溴酚蓝等。染色方法常用考马斯亮蓝、溴酚蓝等。2727整理整理pptppt理想显色剂的理想显色剂的理想显色剂的理想显色剂的7S7S安全（安全（safetysafety）灵敏（灵敏（sensitivitysensitivity）简单（简单（simplicitysimplicity）特异性（特异性（specificityspecificity）快速（快速（speedspeed）稳定（稳定（stabilitystability）兼容性（兼容性（synergysynergy）2828整理整理pptppt考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250R250：灵敏度是氨基黑：灵敏度是氨基黑10B10B的的5 5倍，但不适用与倍，但不适用与酸溶蛋白、醇溶蛋白。酸溶蛋白、醇溶蛋白。考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250：灵敏度不如：灵敏度不如R250R250，但不溶于酸性溶液。，但不溶于酸性溶液。考染灵敏度为考染灵敏度为30100ng30100ng，线性范围是，线性范围是2020倍倍.2929整理整理pptppt3030整理整理pptppt银染法银染法机制：将蛋白质带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，机制：将蛋白质带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上。银染蛋白的吸光度与他们的浓使银颗粒沉积在蛋白带上。银染蛋白的吸光度与他们的浓度成线性关系。度成线性关系。蛋白质的染色程度与蛋白质上的特殊基团有关，蛋白质的染色程度与蛋白质上的特殊基团有关，碱性和含碱性和含硫氨基酸硫氨基酸的存在对染色有贡献。的存在对染色有贡献。银染应先固定，固定的作用有两个：第一是把蛋白质固定银染应先固定，固定的作用有两个：第一是把蛋白质固定在凝胶中阻止扩散。第二为了除去干扰染色的物质，如去在凝胶中阻止扩散。第二为了除去干扰染色的物质，如去污剂、还原试剂和缓冲液中的成分（甘氨酸）。固定剂有污剂、还原试剂和缓冲液中的成分（甘氨酸）。固定剂有戊二醛、乙醇、甲醇醋酸、三氯醋酸。戊二醛、乙醇、甲醇醋酸、三氯醋酸。染色分为双胺银染和非双胺银染。染色分为双胺银染和非双胺银染。银染的线性范围是银染的线性范围是4040倍，灵敏度是考染的倍，灵敏度是考染的100100倍。倍。3131整理整理pptppt双胺银染过程：双胺银染过程：1.1.胶在胶在50%50%甲醇中浸泡至少甲醇中浸泡至少1 1小时小时.2.2.配制溶液配制溶液A 0.8A 0.8克硝酸银到克硝酸银到4 4毫升无离子水。毫升无离子水。B21B21毫升毫升0.36%0.36%氢氧化钠和氢氧化钠和1.41.4毫升毫升14.814.8摩尔的氢氧化胺摩尔的氢氧化胺.3.3.将将A A滴到滴到B B中，用无离子水加至中，用无离子水加至100100毫升，此溶液临用前毫升，此溶液临用前配制，染色配制，染色1515分钟分钟.4.4.无离子水漂洗无离子水漂洗5 5分钟分钟.5.5.显色液：显色液：2.52.5毫升毫升1%1%柠檬酸与柠檬酸与0.250.25毫升毫升37%37%甲醛混合，加甲醛混合，加无离子水至无离子水至500500毫升。显色约毫升。显色约1010分钟，蛋白带出现。分钟，蛋白带出现。6.6.无离子水漂洗后用无离子水漂洗后用50%50%甲醇终止显色。甲醇终止显色。3232整理整理pptppt3333整理整理pptppt 十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）的聚丙酰胺凝胶电泳是最）的聚丙酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定质纯度检测和测定。SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳3434整理整理pptppt SDS SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是SDSSDS能和能和蛋白质结合并使蛋白质带有大量的负电荷，大大超过其蛋白质结合并使蛋白质带有大量的负电荷，大大超过其原来所带电荷，从而使各天然蛋白质分子间的电荷差别原来所带电荷，从而使各天然蛋白质分子间的电荷差别消除；同时通过断裂分子内和分子间的氢键，蛋白质的消除；同时通过断裂分子内和分子间的氢键，蛋白质的结构也在结构也在SDSSDS作用下变得松散，形状趋于一致。排除了作用下变得松散，形状趋于一致。排除了电泳过程中电荷的影响，使电泳过程中电荷的影响，使SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳时，蛋白质迁移率的差异仅是相对分子质量的函数。时，蛋白质迁移率的差异仅是相对分子质量的函数。原理原理3535整理整理pptppt3636整理整理pptppt在一定范围内，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性在一定范围内，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系。关系。测定蛋白质相对分子质量时，用已知相对分子质量的蛋白测定蛋白质相对分子质量时，用已知相对分子质量的蛋白质与被测样品在同一条件下进行电泳，最后计算出被测样质与被测样品在同一条件下进行电泳，最后计算出被测样品的分子量。品的分子量。由于蛋白质与由于蛋白质与SDSSDS的结合对电泳影响显著，因此需要注意的结合对电泳影响显著，因此需要注意SDSSDS单体浓度、离子强度等影响因素。单体浓度、离子强度等影响因素。用用SDS-SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。3737整理整理pptppt3838整理整理pptppt 蛋白质蛋白质 Z Z 在左边的在左边的 native-PAGE native-PAGE 中无法向下泳动，中无法向下泳动，但在右边的但在右边的 SDS-PAGE SDS-PAGE 则可以依其分子量正确泳动；因则可以依其分子量正确泳动；因此一般使用上，此一般使用上，SDS-PAGE SDS-PAGE 的应用较广泛。的应用较广泛。在在 SDS-SDS-PAGE PAGE 下，虽然下，虽然 X X 分子被解析成单元体，因此分子量由分子被解析成单元体，因此分子量由 160 kD 160 kD 变成变成 40 kD 40 kD；但若在较温和的样本处理件下，有；但若在较温和的样本处理件下，有可能看到未完全解析的可能看到未完全解析的 160 kD 160 kD 蛋白质色带。蛋白质色带。3939整理整理pptpptStaking gelSeparating gel4040整理整理pptppt4141整理整理pptppt该方法可选择的缓冲液范围较广，主要影响蛋白质分离效该方法可选择的缓冲液范围较广，主要影响蛋白质分离效率和电泳速度。率和电泳速度。4242整理整理pptppt由于无电荷浓度的影响，因此凝胶浓度选择成为关键因素。由于无电荷浓度的影响，因此凝胶浓度选择成为关键因素。4343整理整理pptppt等电聚焦等电聚焦等电聚焦（等电聚焦（isoelectric focusingisoelectric focusing，IEFIEF）是）是6060年代中期问世年代中期问世的一种利用有的一种利用有pHpH梯度的介质分离梯度的介质分离等电点不同的蛋白质等电点不同的蛋白质的电的电泳技术。由于其分辨率可达泳技术。由于其分辨率可达0.01pH0.01pH单位，因此特别适合于单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。4444整理整理pptppt蛋蛋白白质质是是带带有有电电荷荷的的两两性性生生物物大大分分子子，其其正正负负电电荷荷的的数数量量随随所所处处环环境境酸酸碱碱度度的的变变化化而而变变化化。在在电电场场存存在在下下的的一一定定pHpH溶溶液液中中，带带正正电电的的蛋蛋白白分分子子将将向向负负极极移移动动而而带带负负电电的的蛋蛋白白分分子子将将向向正正极极移移动动，在在某某一一pHpH时时，蛋蛋白白分分子子在在电电场场中中不不再再移动，此时的移动，此时的pHpH值即为该蛋白质的等电点。值即为该蛋白质的等电点。等等电电聚聚焦焦(IEF(IEF）电电泳泳就就是是在在凝凝胶胶中中加加入入两两性性电电解解质质从从而而构构成成从从正正极极到到负负极极pHpH逐逐渐渐增增加加的的pHpH梯梯度度，处处在在其其中中的的蛋蛋白白分分子子在在电电场场的的作作用用下下运运动动，最最后后各各自自停停留留在在其其等等电电点点的的位位置置上上，测测出出蛋蛋白白分分子子聚聚焦焦位位置置的的pHpH值值，便便可可以以得得到到它它的的等等电点。电点。4545整理整理pptppt4646整理整理pptppt双向电泳双向电泳4747整理整理pptppt19751975年年，OFarrell OFarrell 首首先先运运用用双双向向电电泳泳技技术术将将大大肠肠杆杆菌菌总总蛋蛋白白分分离离出出11001100多多个个蛋蛋白白点点。后后来来此此技技术术一一直直用用于于原原核核生生物物和和真真核核生生物物总总蛋蛋白白的的分分离离。目目前前，随随着着蛋蛋白白组组工工程程的的发发展展，双双向向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。双双向向电电泳泳由由第第一一向向等等电电聚聚焦焦(IEF)(IEF)电电泳泳和和第第二二向向SDS-SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)组组成成，第第一一向向使使等等电电点点不不同同的的蛋蛋白白得得到到分分离离，第第二二向向使使分分子子量量不不同同的的蛋蛋白白得得到到分分离离，两两向向结结合便得到高分辨率的蛋白图谱。合便得到高分辨率的蛋白图谱。4848整理整理pptppt双向电泳具有一些明显的优点双向电泳具有一些明显的优点可在不同电泳技术的基础上构建双向电泳可在不同电泳技术的基础上构建双向电泳4949整理整理pptppt双向电泳的应用双向电泳的应用低丰度蛋白质的检测低丰度蛋白质的检测蛋白质检测和分析蛋白质检测和分析蛋白质组学和代谢组学蛋白质组学和代谢组学5050整理整理pptppt毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳（capillary elecrophoresis,CEcapillary elecrophoresis,CE）是）是以高压电场以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分离间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分离方法。方法。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：采用采用了了0.05mm0.05mm内径的毛细管；内径的毛细管；采用了高达数千伏的电压。采用了高达数千伏的电压。5151整理整理pptppt电极槽和电极槽和进样系统进样系统清洗系统清洗系统毛细管毛细管检测器检测器铂电极铂电极电极槽电极槽恒温系统恒温系统记录和数记录和数据处理据处理5252整理整理pptppt毛细管电泳的特点毛细管电泳的特点柱效高，可达柱效高，可达10105 510106 6/m/m分离速度快，几十秒几十分钟分离速度快，几十秒几十分钟溶剂和试样消耗极少溶剂和试样消耗极少没有高压泵，仪器成本比没有高压泵，仪器成本比HPLCHPLC更低更低选择性强选择性强5353整理整理pptppt检测器检测器紫外紫外/可见光检测器可见光检测器安培检测器安培检测器MSMS5454整理整理pptppt应用应用测序基因治疗与基因诊断刑事侦查单细胞分析5555整理整理pptppt手性分离小分子和离子分离5656整理整理pptppt亲和毛细管电泳亲和毛细管电泳指在电泳过程中具有生物专一性亲和力的两种分子间，发指在电泳过程中具有生物专一性亲和力的两种分子间，发生了特异性相互作用，形成受体生了特异性相互作用，形成受体-配体复合物，通过对比配体复合物，通过对比亲和作用发生前后的电泳图谱，可获得有关受体亲和作用发生前后的电泳图谱，可获得有关受体-配体亲配体亲和力大小、结构变化、作用产物等方面的信息。和力大小、结构变化、作用产物等方面的信息。5757整理整理pptppt毛细管电泳色谱毛细管电泳色谱在毛细管中填充或在管壁涂布、键合色谱固定相，依靠电在毛细管中填充或在管壁涂布、键合色谱固定相，依靠电渗流推动流动相，溶质由于在色谱固定相和流动相间吸附渗流推动流动相，溶质由于在色谱固定相和流动相间吸附与分配平衡常数的不同和电泳速率的不同而达到分离目的。与分配平衡常数的不同和电泳速率的不同而达到分离目的。5858整理整理pptppt制备电泳综述制备电泳综述制备等点聚焦制备等点聚焦自由流动电泳自由流动电泳梯度流系统梯度流系统多通道流动电泳多通道流动电泳5959整理整理pptppt