蛋白质一级结构测定.ppt

第三章第三章蛋白质的一级结构的测定蛋白质的一级结构的测定.n蛋白质氨基酸顺序的蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究测定是蛋白质化学研究的基础。的基础。n自从自从1953年年F.Sanger测定了胰岛素的一级结测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级千种不同蛋白质的一级结构被测定。结构被测定。.蛋白质的一级结构的测定是一项非常复杂的工作蛋白质的一级结构的测定是一项非常复杂的工作.A.样品必需纯（样品必需纯（97%以上）；以上）；B.知道蛋白质的分子量；知道蛋白质的分子量；C.知道蛋白质由几个亚基组成；知道蛋白质由几个亚基组成；D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。计算每种氨基酸的个数。E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。（1）测定蛋白质的一级结构的要求）测定蛋白质的一级结构的要求.（2 2）蛋白质分子的一级结构测定方法）蛋白质分子的一级结构测定方法氨基酸组成分析氨基酸组成分析氨基酸末端分析氨基酸末端分析蛋白质中肽链的拆离蛋白质中肽链的拆离肽链的部分降解及肽片断的分离肽链的部分降解及肽片断的分离肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠二硫键与酰胺基的定位二硫键与酰胺基的定位 .测定蛋白质氨基酸残基组成测定蛋白质氨基酸残基组成n根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨基酸的数量；基酸的数量；n采用经典的阳离子交采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进氨基酸的组分含量进行分析。行分析。.测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。.n由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分单独分离由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分单独分离出来；出来；n几条多肽链通过二硫键交联在一几条多肽链通过二硫键交联在一 起。可在起。可在8mol/L尿素或尿素或6mol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基；还原为巯基；n用过氧酸氧化或巯基化合物还原二硫键断裂，用烷基化试剂用过氧酸氧化或巯基化合物还原二硫键断裂，用烷基化试剂保护生成的巯基，防止其重新被氧化；保护生成的巯基，防止其重新被氧化；n如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿尿素或素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基亚基)。二硫健的断裂及多肽链的拆分二硫健的断裂及多肽链的拆分.巯基的保护巯基的保护用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化.n用酶溴化氢选择性降解多肽链产生的肽段用酸水解、碱用酶溴化氢选择性降解多肽链产生的肽段用酸水解、碱水解（针对色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自动分析水解（针对色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自动分析仪测定；仪测定；n测定并计算出蛋白质的氨基酸种类和数量；用测定并计算出蛋白质的氨基酸种类和数量；用Edman反反应分析各肽段氨基酸顺序；应分析各肽段氨基酸顺序；多肽链的选择性降解及肽段的多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺氨基酸组成和顺序的测定序的测定.p获得的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交替重获得的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交替重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序；叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序；确定多肽链中二硫键的位置。确定多肽链中二硫键的位置。利用酶利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解选择性降解和溴化氰选择性降解.2、多肽链氨基酸顺序分析、多肽链氨基酸顺序分析多肽链降解必须满足两个条件：多肽链降解必须满足两个条件：n选择性强、反应产率高选择性强、反应产率高n主要方法包括酶解法和化学法主要方法包括酶解法和化学法.n某些蛋白水解酶能够选择性的水解多肽链中的某些蛋白水解酶能够选择性的水解多肽链中的某一类肽键；某一类肽键；n主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶；菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶；n糜蛋白酶（糜蛋白酶（chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸；亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸；n胃蛋白酶（胃蛋白酶（pepsin)：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、以及其他疏水性强氨酸、以及其他疏水性强酶解法酶解法.特点：专一性较强，水解速度快特点：专一性较强，水解速度快断裂位点：赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键断裂位点：赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键R1=Lys（赖、（赖、K）和）和Arg（精、（精、R）R2=Pro（抑制）（抑制）肽链肽链水解位点水解位点胰蛋白酶（胰蛋白酶（trypsin）.特点：专一性稍弱，特点：专一性稍弱，Leu、Met和和His稍慢稍慢断裂位点：断裂位点：Phe（苯丙）、（苯丙）、Trp（色）、（色）、Tyr（酪）等疏水氨基（酪）等疏水氨基酸残基的羧基端肽键酸残基的羧基端肽键R1=Phe（F）、）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性）等疏水性AAR2=Pro（抑制）（抑制）肽链肽链水解位点水解位点糜蛋白酶糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度与相邻水解速度与相邻AA性质有关性质有关:酸性：酸性：-/碱性：碱性：+.特点专一性与糜蛋白酶相似，较弱；特点专一性与糜蛋白酶相似，较弱；断裂位点：两侧的残基都是疏水性氨基酸断裂位点：两侧的残基都是疏水性氨基酸R1和和/或或R2Phe（F）、）、Trp（W）、）、Tyr（Y）、）、Leu（L）及其它疏水性）及其它疏水性AA水解速度较快水解速度较快 R1=Pro（抑制）（抑制）pH2.0肽链肽链水解位点水解位点胃蛋白酶胃蛋白酶 Pepsin.特点：专一性较差特点：专一性较差断裂位点：断裂位点：Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Met等疏等疏水性强氨基酸残基的羧水性强氨基酸残基的羧 基端肽键基端肽键R2=Phe（F）、）、Trp（W）、）、Tyr（Y）、）、Leu（L）、）、Ile（I）、）、Met（M）、）、Val（V）及其它疏水性强的）及其它疏水性强的AA水解速度较快水解速度较快嗜热菌蛋白酶（嗜热菌蛋白酶（thermolysin).木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶：专一性差专一性差 断裂位点：对断裂位点：对Arg和和Lys残基的羧基端肽键敏感残基的羧基端肽键敏感葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶：高专一性高专一性 断裂位点：断裂位点：Glu和和Asp残基的羧基端肽键残基的羧基端肽键 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 Glu残基的羧基端肽键残基的羧基端肽键 碳酸氢铵、醋酸铵缓冲液）碳酸氢铵、醋酸铵缓冲液）梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶：高专一性高专一性 断裂位点：断裂位点：Arg残基的羧基端肽键残基的羧基端肽键.n溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。的羧基所形成的肽键。化学法化学法.-选择性地切割由选择性地切割由Met羧基形成的肽键羧基形成的肽键溴化氰水解法溴化氰水解法(Cyanogen bromide).N末端的测定末端的测定二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNFB法）；二甲氨基萘磺酰氯法法）；二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL 法）；异硫氰酸苯脂法（法）；异硫氰酸苯脂法（PITC 法）；法）；C末端的测定末端的测定羧肽酶法；硼氢化锂法；肼解法羧肽酶法；硼氢化锂法；肼解法（2）多肽链的末端氨基酸测定）多肽链的末端氨基酸测定.nN末末端端测测定定方方法法比比较较C末末端端更更加加成成熟熟、可可靠靠和和准准确确，主主要要的的方法有：方法有：二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNFB法）法）肽肽链链N末末端端氨氨基基与与2,4-二二硝硝基基氟氟苯苯（DNFB）反反应应，生生成成二二硝硝基基苯苯的的衍衍生生物物（DNP-肽肽），其其经经酸酸水水解解后后生生成成的的DNP-氨氨基基酸酸可可用用有有机机溶溶剂剂（如如乙乙酸酸乙乙酯酯）抽抽提提，再再与与其其他他氨氨基基酸酸分分开开，鉴定得知鉴定得知N末端的氨基酸。末端的氨基酸。N末端的测定末端的测定.二硝基氟苯法二硝基氟苯法(FDNB,DNFB):1945年年Sanger提出此方法。提出此方法。.n荧光剂二甲氨基萘磺酰氯（荧光剂二甲氨基萘磺酰氯（dansyl-chloride,DNS-Cl）可以可以作为标记试剂专一地与肽链作为标记试剂专一地与肽链N末端氨基反应生成末端氨基反应生成DNS-肽；肽；n同样，酸水解后可得同样，酸水解后可得DNS-氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用层析法鉴定；用层析法鉴定；nDNS-氨基酸于氨基酸于360nm或或280nm处产生强烈的荧光，根据荧光处产生强烈的荧光，根据荧光点的位置，确定点的位置，确定N末端的氨基酸。此方法反应原理同末端的氨基酸。此方法反应原理同DNFB法，法，但其灵敏度比但其灵敏度比DNFB法高约法高约100倍，用于层析分析的样品只需倍，用于层析分析的样品只需1nmol。二甲氨基萘磺酰氯法（二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）法）.二甲基氨基萘磺酰氯法二甲基氨基萘磺酰氯法,丹磺酰氨基酸具有强烈的黄色荧丹磺酰氨基酸具有强烈的黄色荧光光,灵敏性是灵敏性是DNFB法的法的100倍倍.基本原理：偶联基本原理：偶联-环化环化-转化转化n异硫氰酸苯酯能与异硫氰酸苯酯能与N末端氨基偶联生成苯氨基硫甲酰衍生物末端氨基偶联生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-肽）肽）异硫氰酸苯酯法（异硫氰酸苯酯法（PITC法）法）.n 在酸性溶液中，在酸性溶液中，PTC-肽经环化裂解生成肽经环化裂解生成PTC-氨基酸和氨基酸和N末端少一个氨基酸的剩余多肽，前者可用于末端少一个氨基酸的剩余多肽，前者可用于N末端氨基酸鉴末端氨基酸鉴定，但是该产物不稳定，很快进一步转化成定，但是该产物不稳定，很快进一步转化成3-苯基苯基-2-乙内酰乙内酰硫脲硫脲-氨基酸（氨基酸（PTH-氨基酸）。氨基酸）。.n 生成的生成的PTH-氨基酸非常稳定，它在氨基酸非常稳定，它在268nm处有强吸收峰。处有强吸收峰。剩余多肽链的剩余多肽链的N末端仍是自由的，可以进一步与异硫氰酸末端仍是自由的，可以进一步与异硫氰酸苯酯反应进行第二步降解。这样就可以从苯酯反应进行第二步降解。这样就可以从N末端开始逐次末端开始逐次降解下去，进行顺序测定。该方法也称降解下去，进行顺序测定。该方法也称Edman顺序降解，顺序降解，它是制造氨基酸顺序分析仪的理论基础。它是制造氨基酸顺序分析仪的理论基础。.一一般般说说来来，C末末端端测测定定较较N末末端端分分析析的的误误差差大大。可可采采用用的的方方法法有：有：1羧羧肽肽酶酶法法：羧羧肽肽酶酶能能特特异异地地水水解解C末末端端氨氨基基酸酸形形成成的的肽肽链链，而而用用于于测测定定C末末端端氨氨基基酸酸。羧羧肽肽酶酶分分A、B、C、Y4种种，羧羧肽肽酶酶A使使用用最最多多，但但对对C末末端端的的Pro、Arg、Lys及及Hyp不不起起作作用用。羧羧肽肽酶酶B，只只释释放放C末末端端的的Lys和和Arg，可可以以和和羧羧肽肽酶酶A互互补补使使用用。羧羧肽肽酶酶C的的作作用用范范围围宽宽。但但对对C末末端端的的Hyp或或连连续几个甘氨酸（续几个甘氨酸（-Gly-Gly-Gly）无作用。羧肽酶）无作用。羧肽酶Y也具很宽的作用范围。也具很宽的作用范围。2硼硼氢氢化化锂锂法法（LiBH4法法，也也称称“还还原原法法”）：硼硼氢氢化化锂锂可可以以与与C末末端端氨氨基基反应生成相应的反应生成相应的-氨基醇，水解后抽提氨基醇，可用层析法分离、鉴定。氨基醇，水解后抽提氨基醇，可用层析法分离、鉴定。3肼肼解解法法（hydrazinolysis）：测测定定C末末端端氨氨基基酸酸一一种种较较为为重重要要的的方方法法。多多肽肽与与无无水水肼肼发发生生反反应应时时，肼肼可可断断裂裂所所有有的的肽肽键键形形成成肼肼的的衍衍生生物物，唯唯有有C末末端端氨基酸以游离形式存在，故可通过层析鉴定。氨基酸以游离形式存在，故可通过层析鉴定。C末端的测定末端的测定.亚基拆离、肽链降解和肽段的分离亚基拆离、肽链降解和肽段的分离.亚基亚基切成切成小段小段蛋白蛋白分子分子.