DB51∕T 2687-2020 羊包虫病防治技术规范(四川省).pdf

ICS 11.220 B 41 DB51 四EE, 省由巳T目，万标准DB 51/T 2687-2020 羊包虫病防治技术规范2020 -07 -14发布2020 -08 -01实施四川省市场监督管理局发布DB51/T 2687-2020 目次前言. 1 范围. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 规范性引用文件. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 术语和定义. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 诊断. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 疫情报告.2 6 疫情处置.2 7 预防控制. 8 人员防护.:J 附录A(规范性附录)免疫层析法6 附录B(规范性附录)酶联免疫吸附试验(ELISA). 附录c(规范性附录)分子生物学检测方法.8 DB51/T 2687-2020 目IJ1=1 本规范依据GB!T1.1-2009的规定起草。本标准附录A、附录B、附录C为规范性附录。本标准由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本标准由四川省市场监督管理局批准。本标准起草单位:四川省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人:周明忠、阳爱国、袁东波、郭莉、侯巍、尹杰、莫茜、伊力军、郭万里、曾于鑫、李春、蔡冬冬、刘瑞瑛、张辉、王正义。DB51/T 2687-2020 羊包虫病防治技术规范1 范围本规范规定了羊包虫病的诊断、疫情报告、疫情处置、预防控制和人员防护。本规范适用于四川省行政区域内从事羊养殖、运输、屠宰、加工、交易及羊包虫病防治活动有关的单位和个人。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 32948 犬科动物感染细粒棘球综虫粪抗原的抗体夹心酶联免疫吸附试验检测技术DB51/T 1105 动物棘球蝴病(包虫病)防治技术规范NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法中华人民共和国动物防疫法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1 羊包虫病由细粒棘球络虫(Echinococcusgranulosus)幼虫寄生于绵羊、山羊等的肝、肺等器官所号|起的一种人畜共患寄生虫病。4诊断4.1 流行特点4. 1. 1 易感动物绵羊、山羊等草食动物。其中绵羊最为易感，山羊、牛、猪次之。传染源和传播途径感染细粒棘球络虫的犬是囊型包虫病的主要传染源，寄生于犬小肠内的成熟虫体、孕卵节片或者虫卵随粪便排出体外，羊因摄入被成虫、孕卵节片或者虫卵污染的饲草、饮水等，经消化道或呼吸道等途径感染包虫病。4.1.2 流行区域i亥病主要分布在牧区和半农半牧区。我省主要流行区为川西高原藏区，其他地区为散发流行。4. 2 11备床症状DB51/T 2687-2020 该病感染早期无明显症状，感染后期严重时，病羊表现被毛逆立、脱毛，发育不良、消瘦，发生咳嗽，咳后长久卧地不起，个别羊可因包囊破裂产生过敏性休克而突然死亡。当包囊大量生长于肝脏时，叩诊时浊音区扩大，腹部右侧膨大，触诊时病羊表现疼痛。4. 3 病理变化肝、肺等脏器可见大小不等的囊状突起，也可在脾、肾、肌肉、皮下等多处发现包囊。包囊周围有类上皮细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞浸润及纤维母细胞增生，最终可形成纤维性包膜(外囊)，外囊厚度一般为35mm，包囊内充满液体，液体沉淀后用肉眼或在解剖镜下可见许多生发囊与原头蝴。由于包虫的不断生长，压迫周围组织、器官，引起组织细胞萎缩、坏死。4.4 实验室诊断4.4.1 镜检观察将来集的疑似包囊病灶样品，以4%福尔马林盐水固定，采用常规组织学技术染色检测。显微镜下观察，结缔组织下出现过腆酸雪夫氏(PAS)阳性无细胞结构的角质层，内层为具有细胞核结构的生发膜，即可视为棘球蝴的特征性结构。可育囊内或棘球砂中出现原头蝴也是包虫病病原的诊断特征。4.4.2 血清学检测采用免疫层析法、ELlSA法检测羊血清中特异性抗体水平O免疫层析法操作程序见附录AoELlSA法具体操作程序见附录804.4.3 分子生物学检测采用分子生物学方法检测包虫核酸，具体操作程序见附录C。4. 5 结果判定符合4.1、4.2和4.4.1的结果为阳性判定为疑似:符合4.1、4.2和4.4.2的结果为阳性判定为疑似:符合4.3和4.4.3的结果为阳性判定为患病动物:符合4.4 .2和4.4.3的结果为阳性判定为患病动物。5 疫情报告任何单位和个人发现疑似病例后应当及时向当地动物疫病预防控制机构报告。动物疫病预防控制机构接到疫情报告并确认后，按有关规定及时逐级上报，井及时向同级兽医行政主管部门报告。应准确报告疫情发生的时间、地点，感染动物种类、数量、病理变化、诊断情况，流行病学和疫源追踪情况，已采取的控制措施，疫情报告单位、负责人、报告人及联系方式等。6 疫情处置6. 1 疫情确认羊包虫病疫情由县级以上兽医主管部门根据疫病流行特点、|临床症状、病理变化和实验室检测结果予以确认。DB51/T 2687-2020 6. 2 疫点、疫区、受威胁区的划分和处置措施6.2.1 疫点为发病羊所在的地点。相对独立的规模化养殖场(户)，以病羊所在的养殖场(户)为疫点:散养羊以病羊所在的自然村为疫点:放牧羊以病羊所在的牧场及其活动场地为疫点。6. 2. 2 疫区疫点内犬只经常活动的区域，以县级以上动物疫病预防控制机构根据实际调查结果划定。6. 2. 3 受威胁区疫点内犬只活动的最大区域，以县级以上动物疫病预防控制机构根据实际调查结果划定。6.2.4 病羊、污染物品及环境的处理对病羊立即隔离，限制移动。对病变脏器采用高温、焚烧或化制等方式进行无害化处理。对羊舍、活动场地、器具、垫料、饲草和粪便等应用10%的氢氧化呐溶液喷洒或火焰消毒处理。6. 2. 5 感染犬只、污染物品及环境的处理按7.1.1定期对犬只进行驱虫。对犬舍、活动场地、器具、垫料、饲料和粪便等应用10%的氢氧化铀溶液喷洒或火焰消毒处理。7 预防控制7. 1 犬只的防治7. 1. 1 犬只驱虫按犬只每公斤体重5lOmg的剂量一次性口服毗唾酣，每46周驱虫一次，一年812次。投药前家犬应禁食l天，然后将药片夹在食物中(如馒头、肉等，或用含诱食剂的ptlp奎酣)进行投喂，确认犬吞服后进行犬只驱虫登记。7.1.2 犬只驱虫后粪便的处理收集犬只驱虫后5天内的粪便，采用深埋、焚烧或10%的氢氧化铀溶液消毒等方式进行无害化处理，防止虫卵污染环境。7.1.3 严格犬只数量管理犬只管理机构应加强犬只的管理和登记，实行拴养、圈养制度，应及时扑灭阳性犬，严格管控犬只数量。7. 2 免疫7.2.1 疫苗选择采用羊包虫病疫苗(含细粒棘球蝴Eg95抗原)进行羊免疫。7.2.2 疫苗的保存、运输3 DB51/T 2687-2020 在28C下保存，避免高温和阳光直射，忌、剧烈摇荡。疫苗稀释后，如不能当日用完，可在-20C冻存，但只能冻融l次，不可反复冻融使用。7. 2. 3 免疫程序免疫手里序的制定应以羊群包虫病血清抗体水平的高低为依据。免疫过的母羊所产羔羊应在16周龄进行首次免疫，20周龄进行强化免疫。未免疫过的母羊所产羔羊应在8周龄进行首次免疫，12周龄进行强化免疫。免疫过的羊每12个月加强免疫1次。7.2.4 免疫要求接种的羊必须临床表现健康，疫苗注射当天早晨应禁饲。疫苗使用前要J瓶检查，药瓶应无破损、真空包装完整，瓶签上疫苗的名称、批号、有效日期、检验号码等必须清楚。包装破损、破乳分层、颜色改变等现象的疫苗不得使用。疫苗使用前应置于室温(22250C)2小时，使用时充分摇匀，保持匀质。疫苗启封后，24小时内用完。按瓶签注明的头份，用灭菌生理盐水稀释，每只羊颈部皮下注射1mLo7. 2. 5 免疫质量控制安排专人负责监督接种过程，发现漏种的羊要及时丰|、种，对免疫血清抗体水平不合格的羊要及时强化免疫。做好免疫记录工作。记录内容包括:羊的品种、年龄、疫苗的来源、批次、接种时间等。7.2.6 免疫效力的评价羊群在同批次疫苗接种前和免疫后3周，分别静脉采血3-5mL分离血洁，检测羊的免疫抗体水平，评价免疫效果。7. 2. 7 不良反应处置及时在羊皮下注射0.1%盐酸肾上腺素lmL.视病情缓解程度，20分钟后重复注射相同剂量l次:肌肉注射盐酸异丙嗦100mg，地塞米松磷酸铀10mg(孕羊不得使用)。7. 3 检疫按家畜棘球蝴病有关检疫规定进行检疫手口处置。7.4 监测7.4.1 监测对象绵羊、山羊等中间宿主。犬只等终末宿主。7.4.2 监测方法对羊群按4.3观察病理变化，结合4.4.1病原学检测和4.4 .2血清学检测方法进行监测。对犬等终末宿主按照国家规定的检测方法进行监测。初次监测应进行流行病学调查。7.4.3 监测范围、时间及数量DB51/T 2687-2020 对羊群每年进行一次血清学监测，每县(市)在不同乡应抽检300头(只)以上，年龄应在12月龄以上。犬只等终末宿主每年至少进行一次粪样监测，监测数量每县应在100只以上。7.4.4 监测结果处理及时向当地动物疫病预防控制机构报告监测结果。判断为患病动物时，按6.1、6.2和7.5进行处置，以及按7.1、7.2和7.3进行预防和控制。7. 5 屠宰管理按有关规定对羊进行屠宰检疫手口产品检验。不得出售病变脏器，以及将病变脏器喂犬。不得在屠宰场内养犬，并防止犬只进入屠宰场。对病变脏器应进行高温高压、焚烧或深埋等无害化处理。8 人员防护应穿防护服、长筒靴子，戴于套、口罩和护目镜等开展包虫病相关防控工作。使用过的防护服、口罩和一次性于套采用高温或焚烧等方式进行无害化处理，护目镜、靴子用10%次氯酸铀溶液消毒或者高温进行杀虫灭卵。在防控过程中，应对犬只粪便、羊包囊及污染物采用深埋、高温或焚烧等方式进行无害化处理。5 DB51/T 2687-2020 A. 1 材料准备A. 1. 1 抗原采用包虫纯化抗原。A. 1.2 待检血清/全血附录A(规范性附录免疫层析法适用于检测羊的血清及全血样品C样品须新鲜、无污染及未变质。若样品有大量血脂，应处理后去澄清部分检测。全血样品:采用抗凝剂处理的全血，应在24/J、时内检测，避免冷冻及溶血。A. 2 操作方法A. 2.1 用滴管吸取血清或全血，垂直、缓慢、J滴地准确将2滴样品滴入装有样品稀释液的滴瓶内OA. 2. 2 盖上瓶盖，摇晃混匀。A.2.3 将检测卡平衡至室温后从铝宿袋中取出，放置在平整表面。A.2.4 用滴瓶缓慢、逐滴准确地滴加3滴稀释后的样品到检测卡的加样孔中。A.2.5 室温下(l8250C)放置10分钟内判断结果，超过10分钟结果无效。如果环境温度过低或过高，可能影响反应，应调节温度后检测。A. 3 结果判断四盹;i(J-司时(Tr斗时iL.:.J I_ 自lr1阳啊k睡阳性:检测(T)线区及对照(C)线区同时出现红色线。阴性:只有对照(C)线区出现一条红色线。无效:对照(C)线区不出现红色线。IH!. ( L蝇附录B(规范性附录酶联免疫吸附试验(ELISA) B. 1 材料准备B. 1. 1 抗原包虫囊液纯化抗原(磷鸽酸、氯化镇沉淀法制备)0 B. 1.2 待检血清无菌采集羊血，分离血洁。B. 2 操作方法DB51/T 2687-2020 B. 2.1 抗原包被聚苯乙烯板:用O.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液稀释抗原至最适浓度，每凹孔加入100uL，置温盒。40C过夜(或1224h)，次日，倾去抗原，用含O.05%吐温20磷酸缓冲盐水(0.Olmol/ L, pH7.4PBS-T)洗涤3次，每次5min，甩干。B. 2. 2 加待检血清:血清用PBST作1: 200稀释，每凹孔加入lOO!lL.每板应设参考阳性一孔，参考阴性三孔及PBS对照一孔。置温盒，3TC 1h，然后取出，倾去血清，洗涤同前。B.2.3 加结合物:加入用PBS-T作工作稀释度的辣根过氧化物酶(HRP)一标记结合物10。此，3TC，1h倾去结合物，洗涤同前。B.2.4 加底物:通常加邻苯二肢(OPD)底物榕液C10mgOPD+25mL pH5. 0拧棱酸缓冲液+30%H(下标始)2(下标终)O(下标始)2(下标终)10L)lOO!lL. 3TC, 30mino B.2.5 加中止液2mol/ LH(下标始)2(下标终)SO(下标始)4(下标终)50!lL。B. 3 结果判断在酶标专用比色计上读取492nmOD值，以待测样本(S)对阴性对照血清(N)的S/N值二三2.1 为阳性1向界值。7 DB51/T 2687-2020 附录G(规范性附录分子生物学检测方法C. 1 样本处理剖开疑似包囊，取包囊内膜10-30mg，提取DNAoC. 2 普通PCRC. 2.1 引物F 1: 5-TTTTTTGGGCA TCCTGAGGTTT A T -3 R1: 5-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3 C. 2. 2 扩增体系反应采用25L体系2xEasyTaqPCR SuperMix12.5L、上下游引物各lL(10M)、DNA模板lL、ddH209.5L C. 2. 3 扩增程序94C预变性5min:然后40个循环94C15S, 50C35S, 72C35S:最后72C延伸8min，产物大小420bp。C.2.4 结果判定取2LPCR扩增产物(包括阴阳性对照)及4LDNA标准Maker对照，于1.5%琼脂糖(含Gelstain核酸染料)凝胶中80V电泳30min，而后于凝胶成像仪中观察结果，有目的条带即为阳性。若需要进一步确认检测结果，可直接取10uLPCR阳性产物进行测序:C. 3 荧光PCR(探针法)C. 3. 1冒|牧lF:TGTACTGGTTGGGGTGGTTACAA R:GCCTCAAACCTAACAGATCCAAAA (MGB)探针CACATCGAACAGACCTTC.3.2 扩增体系每个样本反应体系为20uL，上下游引物终浓度0.9uM，探针终浓度0.25uM。其中，模板1-2L(阴性对照模板为2L无菌双蒸水)，上下游寻|物各1.8队，探针0.5阵，PCR反应液10队，其余用无菌双蒸水补齐。C.3.3 扩增程序(94C30s: DB51/T 2687-2020 (940C 10s, 600C40s(采集荧光);40-45cycles. C.3.4 结果要IJ定C. 3.4.1 质控样品:阴性样品无Ct值或无扩增曲线:阳性样品Ct直应小于25，并出现典型扩增曲线;否则，此次试验视为无效。C. 3.4. 2 结果判断:阴性样品无Ct值或无扩增由线;阳性样品有Ct直且出现S型扩增曲线，表示样品中有包虫DNAo9