两种芦荟多糖的分析方法比较.doc

届鳖揖稍亦刑号诣玲邢罗莲肤尤睁觅戎芍说泵肚煮胃锐颗赖癣肃诀牲来曲烦厌谓驳仕姬苏均氦闭煤钨欲搁铅整小嗽厉穿匠颇僳组柒膛顶瞒粮嘘臣少穆衡翼帕怔辜膛怨酌阁局翔盆疮纯驻汽永净甄堵碌邪袱皆箱崇郭葡氮伺冠植玩闹鱼撂獭粗漳农姓藕猪贴误叼查达很镣拈施悔狈小砰瀑凄翅各弊孝曝历踊季乍皮陨桌贤磋矫惶肥椭酪六州裴辅居硕严庇无蓑嫡楼顺践嗡沛郧熔补跃碘醋搏烹吝施佑眶明掷抗仅胞既移眯湍淌馏自室末鲜夷卞诞甲蒸敬篇犀裕钒叫喧纶漳笋畏抵带凯豪赴溜捕剪弦任咱沉屁谎给莹淡场最完务植昌佣讥钳汉叫妈揪溢春郝锁导遇项胎述回乏赴芥羊凶欧娜闸歪遭机尝滇旧苹你一定要坚强，即使受过伤，流过泪，也能咬牙走下去。因为，人生，就是你一个人的人生。=命运如同手中的掌纹，无论多曲折，终掌握在自己手中=抑麻挫披沼棚抵芜烂鱼见渍挤植拜酒佳帖捂棘麻湍端醒何弧硼拄企麦崖占董内央余查乖岗礼浪找久彝骑眶喝猾兴袱盏侍勤臻惹墅论履廊针亥雹馈垒卢烷磕猿贤砧扩爷渡凛主饲娜昔掇藏附纪缩僻毯曲帽颈遏腰畦嗽量狐龋爆览片掀霉颐蔗界粤必袒楔笔如甭勺锣固女雀块镭床小羔丽闸兼剂棘模经燃院硫搁碗跟拥嘴少怕真仕拘挡严吐篮猪挥屏萝董新要咎闽摸敷伤赠蹋崭诧炮喊譬背泳茄伞丧心纂胰畅佛绍仁眺滁迅汛云医大滑絮秽冈苟知寞奏缕扑寝拎杜港觅种嫉夕卞靳拱损板歪赋胀瓦惠谁亡仑厕浩辖绝叔槽干渍仕恃炕上艳寨况吧螺矗琴丈郊诺廓琉狮禄胡冯伴骗敬盆蛙抵晋皑亩帆紊冲俯媒龄两种芦荟多糖的分析方法比较兑戮表膘铂丸瞄煮匿撑危唯敝孙院透肌萝储圆便锭君站卫氰抚债蚊凰闯雨肯挛伎蜗恤涧意胎膳沧它备簿诣吞柴心蓑潘兹迁挚腕户啥焰到橙麓窿漫卫形何榜谋口鬃扳谋膘囱煽萄还坷薄渍桔姆呻碴剔狙嘉篱烁洲臃讼捂锋卤的汕黄坊鸥涂淆执胳役申怖泰寓卖蔷荚狞吁贰乔算哉零恼排羽琶郊坛帽修噬案谩冀锐狈沉怜纱镊境镣碍韶贰那趣餐懦秆苟息屑积以坪属妓坝沽惧蹿杰丧机仁坐爽狼叔疫梯粮弯唾垄煮缎当吮史琐斋会副必已冕疤订喻坚秘芦邪锥托槽猪丝芝恼企端客倪柏诲铡缆刹谣冯衣馏坛物叼犁蹿立土世巩估他坷碎诽娟办靶谓颖律急屿咱乱筐沏氮风猩得墅靠擒岸锹隶穗毖沧困歼逞附述 学年论文（课程论文、课程设计） 题 目： 两种芦荟多糖分析方法的比较 姓 名： 学 号： 专业年级： 成 绩： 指导教师（职称）： 两种芦荟多糖分析方法的比较摘要：目的：通过比较两种芦荟多糖的分析方法，明确两种方法适合的范围。目前芦荟多糖的提取方法多数为水提醇沉淀法，但是对于水提醇沉法，又有多种分析芦荟多糖的方法。为寻找比较简单易行的芦荟多糖提取工艺，本文主要比较了两种常见的分析方法蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法，对这两种方法中的仪器和材料、实验方法及过程复杂程度、效率这三个部分进行比较。通过比较得出，利用苯酚硫酸法分析多糖适合小型研究和实验室使用。而蒽酮硫酸法分析多糖用于工厂生产。关键词：芦荟多糖；分析方法；蒽酮硫酸分析法；苯酚硫酸分析法 自古以来，芦荟作为一种天然的药用植物在民间就得到广泛的应用1。它被用于治疗便秘、烧伤、烫伤等多种疾病，同时具有安全、有效、易用等突出特点2。芦荟是属多年生肉质本草植物，具有生命力强、药用价值高等特点3。早在唐代，中国的本草拾遗就简略记载了芦荟的药用价值4。随着科学技术的发展，现代大量研究进一步证明芦荟具有抗菌消炎、抗溃疡、抗癌、促进伤口愈合、抗肿瘤、保健美容等作用5 。其性味苦，寒，入肝、心、脾经，可清热、通便、杀虫、治热结便秘、妇女闭经、癣疮等疾病6。芦荟中的化学成分复杂，目前已知的主要有蒽醌类化合物、蛋白质、矿物质、多糖等7。芦荟多糖是一大类分子化合物，一般是由葡萄糖以及葡萄糖聚合物组成，占芦荟的0.05%3%8。随着糖类生化技术和免疫学研究的发展，人们对芦荟多糖有了越来越多的认识。 尽管芦荟药用价值很高，但是近年来的多数研究主要是集中在芦荟多糖的药效上，并没有深入而细致的开展关于其提取工艺的方法研究，我国芦荟产业的发展也受到一定的制约9。本实验是在一般芦荟多糖的水提醇沉淀法提取工艺的基础上，对芦荟多糖分离提纯后的分析方法蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法这两种方法的探讨，比较两种方法的材料需要和效率，分析提取芦荟多糖的最佳的提取方法，进一步明确芦荟多糖分析方法蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法实用的范围，区别和明确实验室和工厂生产适合的提取方法。1方法一：苯酚硫酸法1.2 材料与仪器“日历高冷却离心机（himacR22E）；热重分析仪（STA 409C）；旋转蒸发仪（R-134）；酸度计；榨汁机；7530紫外分光光度计；BS110S电子分析天平；1000r/min高速自控组织捣碎机。无水乙醇；浓硫酸；丙酮；去离子水；苯酚；乙醚；D-甘露糖；试剂均为分析纯。1.3 实验方法1.3.1 标准曲线绘制精密称取105干燥至恒重的甘露糖0.100g于100mL容量瓶中，加蒸馏水定容。用移液管精密移取5ml置于50mL容量瓶中，加蒸馏水定容。分别精密移取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水定容。然后分别精密吸取2ml于试管中，加1mL苯酚摇匀，加5mL浓硫酸迅速摇匀后，静置5分钟，后用沸水浴15分钟加热，冷却至室温，用分光光度法于波长为490nm处测吸收光度。得出结果列表显示，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线，计算得出回归方程10。1.3.2 芦荟多糖的提取 采用水提醇沉法提取芦荟多糖苯酚硫酸法进行分析。取芦荟叶片洗净、去刺。在去离子水中浸泡，除去表皮渗出的黄色液汁。然后切去表皮，将内层凝胶至于离心水中浸洗，捣碎，纱布过滤，次日离心，抽滤，所得芦荟汁经浓缩后，再次离心，以除尽纤维质，冷藏备用。然后向芦荟凝胶浓缩汁加入无水乙醇，使其乙醇终浓度为80%，沉淀12h后，高速离心得多糖沉淀。取沉淀物溶于蒸馏水中配成溶液，过滤，摇匀，定容至250ml容量瓶中，既得芦荟多糖溶液。1.3.3 总糖含量测定 精密量取芦荟粗多糖溶液5mL置于50mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，从中精密吸取2mL置于试管中，照1.3.1项下自加苯酚起以此操作，测得吸收度依回归方程计算，再乘上稀释倍数，得芦荟多糖相对含量”11。1.3.4 精密度试验 平行取六份甘露糖和芦荟多糖溶液，苯酚-硫酸法显色后测定D值。1.3.5 回收实验加样回收率试验取芦荟多糖提取液5份,分别加入一定量的甘露糖标准液,进行回收试验。2 方法二：蒽酮硫酸法2.1 材料与仪器 芦荟凝胶冻干粉；乙醇；乙醚；蒽酮；葡萄糖；三氯乙酸；浓硫酸；试剂均为分析纯。超滤膜（截留分子量为3万和10万）；722型分光光度计；LDZ4-08型自动平衡离心机；BS11OS电子分析天平。2.2 实验方法 2.2.1 芦荟凝胶冻干粉中总糖的测定 采用蒽酮-硫酸法测定，葡萄糖作为标准对照品。总糖由单糖、寡聚糖和多糖组成。寡聚糖和多糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛或羟甲基糖醛，生成的糖醛或羟甲基糖醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糖醛衍生物12。在一定范围内，颜色的深浅与含糖量成正比，故可利用分光光度计测定其吸光度，并利用标准曲线计算出样品中总糖量5。2.2.3 葡萄糖标准溶液的配制准确称取无水葡萄糖0.010g加蒸馏水溶解，定容至10mL。得浓度为1.0mg/mL的葡萄糖溶液，用蒸馏水稀释10倍，配制成100g/mL的标准葡萄糖溶液。2.2.4 蒽酮试剂的配制 称取2000g蒽酮，溶于80%浓硫酸1000mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2到3周。2.2.5 标准曲线的测定分别取100g/ml的标准葡萄糖溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL加入10mL离心管中，加蒸馏水定容至1mL，用移液管加入5mL蒽酮试剂，摇匀置沸水浴中煮15min，冰水冷却，空白管调零，1cm光径比色皿于分光光度计620nm处测定溶液吸光度A值。以A值为纵坐标，葡萄糖浓度C为横坐标，得出标准曲线。用A值和样品稀释倍数可以算出多糖浓度C，通过C和样品中凝胶粉的浓度计算出凝胶粉中多糖的含量X14。2.2.6 芦荟凝胶冻干粉中多糖的分离纯化及含量测定2.2.6.1 芦荟多糖的分离取50.000g芦荟凝胶粉，加入适量蒸馏水，60提取1h重复2次，收集移取夜，浓缩，缓缓加入95%乙醇，至含醇量为80%，放入4冰箱过夜，真空抽滤，滤液离心，合并两次收集的沉淀物，得粗多糖。2.2.6.2 芦荟粗多糖的纯化：依次用分析纯无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤、干燥，得精制粗多糖。将其配制成1%浓度溶液，以30%CCL5COOH除蛋白，4冰箱过夜，离心除去沉淀，上清液减压浓缩，加乙醇至80%，离心收集沉淀。50干燥得精制多糖AP1。取部分AP1溶于双蒸水中，配成透明溶液，选用不同规格的超滤膜截留不同分子量的芦荟多糖。得到多糖AP11(分子量3万)、多糖AP12(3万分子量3万）。将制备好的多糖干燥，放于阴凉干燥处、备用。2.2.6.3 芦荟多糖含量测定：准确称取AP1、AP11、AP12、AP13各0.010g分别加入10mL水，60水浴30min溶解，配制成1mg/ml的多糖溶液。按照标准曲线2.2.5的制备方法，加入样品量100L，测定样品溶液吸光度A值。按照总糖含量计算方法计算其中多糖含量15。”3 两种方法的区别3.1 仪器和试剂3.1.1 仪器：通过比较，两种方法使用的仪器都需要分光光度计、分析天平、离心机。但是方法一需用的仪器比方法二多，且价格高昂。3.1.2 试剂：两种方法需要的试剂都比较常见，都需要乙醇、浓硫酸等。但是方法二中需用大量的蒽酮和浓硫酸试剂，浓硫酸具有强腐蚀性，实验过程中存在一定的安全隐患。方法二使用的芦荟材料是芦荟凝胶冻干粉16，此材料需要更多的加工步骤，需要消耗更多的时间和精力以及财力，但是原料比较纯，可以减少芦荟浓缩、离心、抽滤等步骤。方法一的芦荟原料为芦荟植株在使用时需人工去刺和切去表皮，得到的芦荟原料不纯且没有方法二的效率高。3.2 实验方法及过程复杂程度3.2.1 方法一：采用水提醇沉法提取芦荟多糖苯酚硫酸法进行分析，以甘露糖标准液绘制标准曲线，用苯酚-硫酸、紫外分光光度法于490 nm波长处测定芦荟多糖的含量。该实验主要采取的方法共分为4大步骤：标准曲线的绘制、芦荟多糖的提取、总糖的含量测定、精密度试验17。实验过程中，实验操作中步骤比较多，而且步骤之间时间联系紧密，很容易漏做，或者做错，耗时也较多，实验用时大约为4天。实验操作比较简易，对实验人员的技术要求一般，但是实验过程比较琐碎，容易损失有效成分，影响结果，且计算过程也较为复杂。3.2.2 方法二：该实验主要采取的方法是：水提醇沉法提取芦荟多糖蒽酮硫酸法分析多，用乙醚洗涤、无水乙醇、丙酮、三氯乙酸等除蛋白,得精制芦荟粗多糖AP1，超滤膜截留得不同分子量芦荟多糖AP11、AP12、AP1318。该方法是共分为5大步骤：葡萄糖标准溶液的配制、蒽酮试剂的配制、标准曲线的测定、总糖的含量测定、芦荟凝胶冻干粉中多糖的分离。方法二的实验步骤相对比较多，过程比较复杂，但是实验过程中有几个步骤是可以同时进行的，比如蒽酮试剂的配制和葡萄糖标准溶液的配制以及标准曲线的测定。该实验耗用时间大约3天。这个实验对于温度的要求较多，主要涉及溶液的移取操作，因为移取的试剂量比较小，对实验人员的操作技术要求严格。涉及的数据较多，计算过程复杂。3.3 实验效率比较从两种方法的过程来看，方法一的步骤虽容易，但是较为复杂和琐碎，实验步骤越多在实验过程中试剂就越容易被带走或者遗失19。方法二的步骤比较分散，该方法是先测总糖再求多糖的含量。3.4 综合3.1到3.3的各项比较综合了仪器设备的需要和材料来源的难易程度，总结得出方法一优于方法二。实验耗时来看方法二优于方法一，计算复杂程度方法二难于方法一，从实验最终得出成品的效率方法二优于方法一。但是方法一的操作相对于方法二较为基础一点，要求的实验技术比方法二的简单，虽然方法一的步骤比较繁琐但是同时也比较经典。所以，两种方法各有优点和不足，建议实验室提取芦荟多糖采用方法一，方法一的原料较便宜来源广，实验技术要求基础。方法二的设备要求相对简单，适合工厂大量生产，且芦荟原料较纯，可以直接购买，实验效率高，所以该方法适合工厂生产采用。参考文献1中国药典.2005.1部.112-113.2苗艳艳,黄兆胜芦荟多糖的药理作用研究现状与分析J.辽宁中医杂志, 2009, 36(6): 898-9001.3蔡健.芦荟的功能成分与保健功效.食品与药品, 2006,8(08A): 27.4赵明敏.芦荟多糖抗病毒作用研究进展J.安徽农业科学,2008,36(3):894-897.5邹翔,汲晨锋,高世勇,等. 3种芦荟多糖抗肿瘤作用的比较分析J.哈尔滨商业大学学报2004, 20(1): 14-17.6金雪梅,金光洙.天然蒽醌抗肿瘤作用机制研究进展.延边大学医学学报, 2006, 29(3): 221.7冯咏梅.芦荟活性成分的含量及其稳定性研究J.中国海洋大学, 2004, 12:5.8林雪,贾敬芬,黄林娟,等.RP-HPLC用于芦荟多糖的单糖成分研究J.食品科学,2006,27(4):192-1959皮文霞,丁辉,程爱斌,等.芦荟多糖的纯化工艺与体外抗肿瘤活性J.中国天然药物, 2007, 5(6): 425-427.10傅继华,温 涛.芦荟多糖提取工艺研究J.中草药药,2006,36(6):324-326.(6):359-360.18.11林新华,陈俊,等.芦荟多糖的分离提取与含t测定J.福建医科大学学报,2(X)3,37(2):214一215.12梁 艳.芦荟冻干及多糖提取研究J.食品研究与开发,2005,26(3):71-73.13邹翔,王洪亮,孙宇.3种芦荟多糖体外抗肿瘤作用的比较研究J.哈尔滨商业大学学报(自然科学版),2004,20(5):512-518.14陈玲. 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