DB32∕T 3777-2020 规模化猪场猪圆环病毒病防治技术规范.doc

ICS65.020.20B 31DB32江苏省地方标准DB 32/ T 37772020规模化猪场猪圆环病毒病防控技术规范Technical Specifications for Prevention and Control of Porcine Circovirus Diseases in the Large-scale Pig Farms 2020 - 04 - 08发布2020 - 05 - 15实施江苏省市场监督管理局发布目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14诊断15疫情报告与处置46预防与控制4附录A（规范性附录）6附录B（规范性附录）10前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由南京农业大学提出并归口。本标准起草单位：南京农业大学。本标准起草人：姜平、白娟、王先炜、李玉峰、陈闻、曹瑞兵、周斌、许家荣规模化猪场猪圆环病毒病防控技术规范1 范围本标准规定了猪圆环病毒病的诊断、疫情报告、疫情处置、预防与控制等技术规范。本标准适用于规模化猪场猪圆环病毒病的诊断、疫情报告和确认、疫情处置、预防与控制。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 21674 猪圆环病毒聚合酶链式反应试验方法GB/T 35910 猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测方法NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范SN/T 2708 猪圆环病毒病检疫技术规范DB32/T 1457 猪圆环病毒2型检测方法SYBR Green I实时定量PCR病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发201725号）3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1猪圆环病毒病 Porcine circovirus disease, PCVD又称猪圆环病毒相关性疾病，是由猪圆环病毒2型（PCV2）感染引起的具有多种临床表现的疾病，主要包括：断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、母猪繁殖障碍和肉芽肿性肠炎。3.2猪圆环病毒2型感染 Porcine circovirus type 2 infectionPCV2侵染猪体，并在一定部位定居、生长、繁殖，引起猪体一系列病理反应和免疫反应的过程，包括亚临床感染和隐性感染。4 诊断4.1 流行病学4.1.1 PCV2可以感染各种年龄、不同性别的猪，多呈亚临床感染。传播途径有水平传播和垂直传播。临床疾病多伴存在其他病原混合感染或继发感染。4.1.2 断奶仔猪多系统衰竭综合征一般发生于5周龄12周龄，发病率一般为10%30%，有时高达50%60%，死淘率在5%20%范围内。4.1.3 猪皮炎与肾病综合征主要发生于保育猪、育肥猪和成年猪，发病率通常低于1%，饲养管理差的猪场可以达到10%或更高，高温季节发病率高。4.1.4 猪呼吸道病综合征主要出现于8周龄26周龄猪群，发病率和死亡率随混合感染的病原性质和饲养管理条件差异较大。4.1.5 母猪繁殖障碍主要见于后备母猪和第一和第二胎生产母猪。4.1.6 肉芽肿性肠炎主要发生于8周龄16周龄的猪。4.2 临床症状4.2.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）患猪主要表现皮肤苍白、被毛粗乱、呼吸困难、腹泻，呈现进行性消瘦，猪群长势不均，偶尔出现黄疸症状，易继发其他病原感染，保育猪群死淘率约10%20%。4.2.2 猪皮炎与肾病综合征（PDNS）患猪主要表现厌食和精神沉郁，后肢到会阴处皮肤或全身皮肤出现不规则、红色或紫色的斑疹或丘疹，形成黑痂脱落，表皮损伤消退或留下疤痕，病程一般7 d10 d。严重的急性感染，可致死亡。4.2.3 猪呼吸道疾病综合征患猪主要表现生长缓慢、厌食、精神沉郁、发热、咳嗽和呼吸困难,如与猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪肺炎支原体等病原混合感染，呼吸道症状表现会更加明显。4.2.4 母猪繁殖障碍本病主要见于后备母猪群和新侵猪群，主要表现妊娠后期流产和木乃伊胎、死胎和弱仔数增多。木乃伊胎可见于妊娠的各个阶段。4.2.5 肉芽肿性肠炎患猪主要表现皮肤苍白、生长缓慢、腹泻，粪便呈灰色，部分猪粪便带血。4.3 病理变化4.3.1 肉眼病变4.3.1.1断奶仔猪多系统衰竭综合征：消瘦、贫血、苍白，偶有黄疸。肺脏肿大，间质增宽，呈间质性肺炎变化，肺质度坚硬或似橡皮。全身淋巴结肿大约2倍5倍，特别是腹股沟、纵膈、肺门和肠系膜淋巴结，切面为苍白呈灰黄色，混合感染时有出血。肾脏显著肿大，有白色坏死斑。脾脏肿大，部分发病猪脾头出现折叠。4.3.1.2猪皮炎肾病综合征：以皮肤病变和肾脏白色坏死斑为主，皮炎主要见于猪的后肢和会阴部，有时全身出现。 4.3.1.3猪呼吸道病综合征：多有其它病原继发或混合感染，可出现相应疾病的病理变化，如胸膜炎、心包炎、腹膜炎和关节炎等。4.3.1.4母猪繁殖障碍：流产胎儿可能出现心肌肥大和肝脏充血。4.3.1.5肉芽肿性肠炎：肠黏膜增厚，肠系膜淋巴结肿大，小肠壁剪开后自动外翻。4.3.2 组织病变不同临床表现的猪圆环病毒病，患猪的组织学病变有一定共性，主要包括：淋巴结：淋巴细胞减少，淋巴滤泡消失，出现多核巨噬细胞侵润及包涵体。脾脏和扁桃体：B细胞滤泡消失，出现包涵体。肺脏：坏死性和溃疡性细支气管炎，肺泡隔膜的肉芽肿性炎症和细支气管周边的肉芽肿性增生和混合性炎症。4.4 实验室诊断4.4.1 样品采集、保存与运输4.4.1.1 基本要求按照NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范标准的要求进行。4.4.1.2 组织样品采集与运送采取发病猪或死亡猪的淋巴结、脾脏、肺脏和肾脏组织样品，于28条件下24 h内送往实验室，或置-20冻存，并在冻结状态下送往实验室。同时，取患猪或病死猪的相同组织样品，用4%甲醛溶液固定，送往实验室。4.4.1.3 血液样品采集与运送采用消毒注射器经患猪颈静脉采集血液2 mL，凝固后24 h内于28条件下送到实验室。4.4.2 病原学诊断4.4.2.1 病毒分离与鉴定按照SN/T 2708 猪圆环病毒病检疫技术规范进行。将待检样品无菌处理，接种PK15细胞，盲传1代3代，采用聚合酶链式反应（PCR）和间接免疫荧光试验（IFA）等方法进行鉴定。4.4.2.2 间接免疫荧光试验（IFA）采用PCV2 Cap的单克隆抗体或PCV2阳性血清，检测细胞培养物中的PCV2抗原（参见附录A.1）。4.4.2.3 聚合酶链式反应采用针对PCV2基因的特异性引物，通过PCR方法或荧光定量PCR方法检测组织病料中的PCV2核酸。按照GB/T 21674或DB32/T 1457方法进行。4.4.2.4 免疫组化试验肺脏、淋巴结或肠道组织经固定后，用PCV2特异性抗体检测组织中的病毒抗原（参见附录A.2）。4.4.3 血清学诊断4.4.3.1 间接酶联免疫吸附试验（ELISA）抗体检测方法采用商品化的PCV2间接ELISA抗体检测试剂盒进行检测。4.4.3.2 阻断ELISA抗体检测方法按照GB/T 35910猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测方法的标准要求进行。 4.4.3.3 IFA抗体检测方法采用PCV2 感染的PK-15细胞，异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊（鼠或兔亦可行）抗猪IgG或FITC-SPA（FITC标记的葡萄球菌A蛋白），通过IFA抗体检测方法，检测PCV2抗体（参见附录A.3）。4.5 结果判定4.5.1 同时符合4.1、4.2和4.3中对应疾病条件，判定疑似猪圆环病毒病。4.5.2 符合4.5.1，并符合4.4 .2中的任何一条，确诊猪圆环病毒病。4.5.3 符合4.4.3中的任何一条，判定PCV2感染（疫苗免疫猪群除外)。5 疫情报告与处置按中华人民共和国动物防疫法和动物疫情报告管理办法中相关规定执行。发现疑似疫情，畜主应对疑似患病动物进行隔离，对病猪污染的场所、用具、物品严格进行消毒。病死猪、淘汰猪及废弃物按照病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发201725号）进行无害化处理。 6 预防与控制6.1 免疫接种目前，商品化的猪圆环病毒病疫苗有全病毒灭活苗和基因工程亚单位疫苗，可用于免疫母猪和仔猪。免疫程序一般为：母猪产前45 d左右首次免疫，间隔3周4周加强免疫。仔猪2周3周龄免疫，间隔3周4周可以再免疫一次。6.2 饲养管理完善日常饲养管理制度，严格实施全进全出和分群饲养制度，保持合适的饲养密度。尽量减少对猪群的应激。注意环境清洁，改善空气质量，控制猪舍温度。改善饲料的质量，提高猪群的营养水平。保育舍内设立独立的饮水加药设施。产房、保育舍、配种怀孕舍、育肥舍和公猪舍应定期做好带猪消毒。生产区内，出入猪舍的各种器具、推车和饲喂工具应每天刷洗干净，定期消毒。母猪产前1周和产后1周、保育仔猪断奶后第2周和第4周，饲料中可添加抗菌药物、免疫增强类药物或饲料添加剂等。AA附录A （规范性附录）检测方法A.1 免疫荧光试验检测PCV2A.1.1 主要仪器、材料和试剂荧光倒置显微镜、操净工作台、高速台式冷冻离心机和微量移液器（规格0.5 L10 L、20 L200 L、100 L1 000 L）。96孔细胞板、1.5 mL微量离心管和移液器配套的吸头等。PK15细胞、PCV2单克隆抗体、PCV2病毒液和荧光标记二抗（羊抗鼠-FITC、SPA-FITC或抗猪IgG-FITC）。A.1.2 操作方法A.1.2.1 细胞制备 用含10%小牛血清的RMPI-1640营养液培养PK15细胞，长满单层后，弃营养液，用Hanks液洗涤单层2次3次后，用0.025%胰酶消化，铺在96孔板上，37 5%CO2培养36 h48 h，细胞长满单层。A.1.2.2 接种样品 将细胞培养物接种96孔细胞单层板上，50 L/孔，37吸附1 h，弃培养液，加入维持液（含2%血清的RMPI-1640营养液），50 L/孔，同时，设PCV2病毒液和PBS缓冲液的接种，分别作为阳性对照和阴性对照，37 5%CO2培养36 h48 h。弃培养液，每孔加入浓度为300 mmol/L的D-氨基葡萄糖液50 L，37培养30 min，弃去D-氨基葡萄糖液换细胞维持液，37继续培养24 h36 h。A.1.2.3 固定 弃维持液，用PBS缓冲液（参见附录B.1）洗涤细胞一次，充分晾干后，加入100 L预冷的无水乙醇，4固定45 min，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。A.1.2.4 加PCV2抗体孵育 将抗PCV2单克隆抗体（或PCV2阳性猪血清）用PBS缓冲液适当稀释后，每孔加入100 L，37孵育1 h。A.1.2.5 漂洗 用PBS洗涤3次，每次5 min。A.1.2.6 加荧光二抗孵育 将荧光二抗如羊抗鼠-FITC或SPA-FITC，用PBS缓冲液1:100稀释后，每孔加入50 L，37孵育1 hA.1.2.7 漂洗 同A.1.2.5。A.1.2.8 观察 于荧光显微镜下，观察细胞形态及有无绿色荧光的细胞。A.1.3 结果判定细胞形态规则，且PCV2阳性对照孔内细胞核内含有大量特异性绿色荧光，而阴性对照孔内无特异绿色荧光时，则试验成立。样品孔细胞核内有荧光着染，则判PCV2检测阳性。A.2 免疫组化法检测PCV2抗原A.2.1 主要仪器、材料和试剂石蜡组织切片机、显微镜、微量移液器（规格0.5 L10 L、20 L200 L、100 L1 000 L）。病理组织染色缸、载玻片、盖玻片和移液器配套的吸头等。4%中性福尔马林、4%多聚甲醛、3% H2O2甲醇溶液、1.5%的牛血清白蛋白、二甲苯、乙醇、石蜡、PCV2 Cap单克隆抗体、PCV2阳性对照血清和阴性对照血清、HRP标记羊抗鼠IgG（或HRP标记羊抗猪IgG）和苏木精染色液等。A.2.2 操作方法A.2.2.1 组织固定与修块 采集待检猪淋巴结、肺脏、肾脏、脾脏、肝脏、肠道、心脏等组织，大小1 cm32 cm3，置4%缓冲福尔马林中固定8 h12 h后，将组织修成5 mm 5 mm 2 mm3 mm 的小块，再置4%多聚甲醛中固定8 h12 h。A.2.2.2 脱水、透明与包埋 将固定好的组织取出，可稍作修整后，置于脱水筐中，用梯度酒精脱水。75%乙醇浸泡45 min1 h，重复一次；85%乙醇浸泡45 min1 h，重复一次；95%乙醇浸泡1 h2 h，重复一次；无水乙醇浸泡1 h2 h，重复一次。将脱水完全的组织浸泡于二甲苯中3 min左右（肺脏透明时间要控制好，不要超过1 min），取出后，置于60石蜡中透蜡2次，各1 h1.5 h。透蜡后，将组织包埋于石蜡中。A.2.2.3 载玻片及盖玻片的处理 将新的载玻片浸泡酸中过夜，用自来水充分冲洗后，去离子水清洗干净，并在温箱中烘干。如有必要，可用0.1 mg/mL的多聚甲醛浸泡10 min后烘干。A.2.2.4 切片、贴片与烤片 将蜡块修整到比组织块略大，在切片机上5 m厚度连续切片。将切好的组织在42 水浴中充分展平后，贴于载玻片上。贴片后平放一段时间，防止组织滑落，然后置于染色架上60 烤片过夜。处理好的组织切片可置于28保存。A.2.2.5 脱蜡和水化 将组织片置于二甲苯中浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min；无水乙醇中浸泡5 min，重复一次；95%乙醇中浸泡5 min，重复一次；85%乙醇中浸泡5 min，重复一次；75%乙醇中浸泡5 min，重复一次；PBS清洗5 min，复洗3次。A.2.2.6 抗原修复 在微波炉中将柠檬酸盐缓冲液（附录B）加热至沸腾后，将组织切片置于缓冲液，继续在微波炉中维持15 min，取出后自然冷却至室温，然后用PBS清洗5 min，复洗3次。A.2.2.7 封闭内源性过氧化物酶 将清洗好的组织切片擦干或自然干燥后，滴加3% H2O2甲醇溶液100 L，于室温中孵育15 min，以封闭内源性过氧化物酶，防止非特异性染色。然后用PBS清洗3次，每次5 min。A.2.2.8 封闭 用浓度为1.5%的牛血清白蛋白(BSA)作为封闭液，滴加在组织上，每块组织滴加50 L，于室温封闭15 min，用PBS清洗3次，每次5 min。A.2.2.9 加PCV2抗体孵育 将PCV2单克隆抗体或PCV2阳性猪血清作适当稀释后，滴加在组织切片上，每片组织滴加100 L，置于湿盒内，37孵育1 h。孵育后，用PBS清洗5 min，重复3次。A.2.2.10 加二抗孵育 将HRP标记羊抗鼠IgG（或HRP标记羊抗猪IgG）用PBS作1:3 000稀释后，每组织片滴加100 L，37孵育1 h。用PBS清洗5 min，重复3次。A.2.2.11 DAB显色 将组织片擦干，滴加DAB显色液50 L，于室温显色5 min10 min（可在显微镜下掌握染色程度），PBS清洗5 min，重复3次。A.2.2.12 苏木精复染、脱水、透明和封片 苏木精染色1 min，水洗蓝化（在显微镜下掌握染色程度，过度可用盐酸酒精分化）。梯度酒精脱水：75%，5 min，2次；85%，5 min，2次；95%，5 min，2次；100%，5 min，2次。二甲苯透明：5 min10 min，2次。取出，待二甲苯尚未挥发完全时，中性树胶封片。A.2.2.13 观察 将染色处理后的切片置显微镜下，观察组织细胞形态结构、淋巴细胞数量，尤其是有无细胞着染情况。A.2.3 结果判定在高倍显微镜下观察，切片组织中出现棕黄色着染细胞，判为PCV2抗原检出阳性。A.3 免疫荧光试验检测PCV2抗体A.3.1 主要仪器、材料和试剂荧光倒置显微镜、操净工作台、高速台式冷冻离心机和微量移液器（规格0.5 L10 L、20 L200 L、100 L1 000 L）。96孔细胞板、1.5 mL微量离心管和移液器配套的吸头等。PK15细胞、PCV2病毒液、PCV2阳性对照血清和阴性对照血清、荧光标记二抗（羊抗鼠-FITC、SPA-FITC或抗猪IgG-FITC）。A.3.2 操作方法A.3.2.1 细胞制备 用含10%小牛血清的RMPI-1640营养液培养PK15细胞，长满单层后，弃营养液，用Hanks液洗涤单层2次3次后，用0.025%胰酶消化，铺在96孔板上，37 5%CO2培养36 h48 h，细胞长满单层。A.3.2.2 接种病毒 将PCV2（104 TCID50/mL）接种96孔细胞单层板上，50 L/孔，37吸附1 h，弃培养液，加入2%血清的RMPI-1640维持液，50 L/孔，37 5%CO2培养36 h48 h。弃培养液，每孔加入浓度为300 mmol/L的D-氨基葡萄糖液50 L，37培养30 min，弃去D-氨基葡萄糖液换入细胞维持液，37继续培养24 h。A.3.2.3 固定 弃维持液，用PBS缓冲液洗涤细胞一次，充分干燥后，加入100 L预冷的无水乙醇，28固定45 min，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。A.3.2.4 加血清样品孵育 取无菌处理的猪血清样品，用PBS缓冲液做2倍梯度稀释至1:128，每个稀释度样品加2个孔，每孔加入100 L。同时，设1:8稀释的PCV2阳性对照血清和阴性对照血清，各加2个孔，每孔加入100 L，37孵育1 h。A.3.2.5 漂洗 用PBS洗涤3次，每次5 min。A.3.2.6 加荧光二抗孵育 加入用PBS缓冲液作1:100稀释的荧光二抗，如羊抗猪-FITC或SPA-FITC，每孔50 L，37孵育1 h。A.3.2.7 漂洗 同A.4.2.5。A.3.2.8 观察 于荧光显微镜下，仔细观察细胞形态及有无绿色荧光的细胞。A.3.3 结果判定细胞形态规则，且PCV2对照孔内细胞核内含有大量特异性绿色荧光，阴性血清对照孔内无特异绿色荧光时，则试验成立。样品孔细胞核内有荧光着染，则判PCV2检测为阳性。以荧光着染阳性细胞孔的最高血清稀释倍数作为血清抗体的检测效价。BB附录B （规范性附录）试剂配制B.1 PBS缓冲液取NaCl 8 g、KH2PO42H2O 0.2 g、Na2HPO42H2O 2.9 g和KCl 0.2 g，溶于灭菌去离子水中，定容至 1 000 mL，分装；100 mL/瓶。28保存。B.2 抗原包被液 （pH 9.6，0.05 mol/L）称取Na2CO3 1.59 g、NaHCO3 2.93 g，加去离子水800 mL，用1 mol/L的NaOH调pH值至9.6，加去离子水定容至1 000 mL。B.3 封闭液称取BSA 1g，溶解于100 mL PBST洗涤液中，0.22 m滤膜过滤，分装后4 保存。B.4 血清样品稀释液取NaCl 8 g、KH2PO42H2O 0.2 g、Na2HPO42H2O 2.9 g、KCl 0.2 g和Tween-20 0.5 mL，溶于灭菌去离子水中，定容至1 000 mL，0.22 m滤膜过滤，分装；20 mL/瓶。28保存。B.5 PBST洗涤液10PBST洗涤液配制：取NaCl 80 g、KH2PO42H2O 2 g、Na2HPO412H2O 29 g、KCl 2 g、Tween-20 5 mL，加入灭菌去离子水充分溶解，定容至1 000 mL，0.22 m滤膜过滤，分装，80 mL/瓶。28保存。洗涤液配制：将10倍浓缩洗涤液恢复至室温，并摇动使沉淀溶解（或于37水浴锅中加热5 min10 min），然后用去离子水作10倍稀释，混匀，稀释好的洗涤液在28可以存放7 d。B.6 显色液A液配制：取Na2HPO4 14.6 g、柠檬酸9.33 g、30%H2O2 2 mL，加蒸馏水至1000 mL，调pH至5.2。B液配制：取3,3,5,5-四甲基联苯二胺（TMB）20 mg、无水乙醇10 mL，加蒸馏水至1000 mL。使用前将A液和B液等量混合，分装于棕色瓶内，20 mL/瓶，28避光保存。B.7 终止液（2 mol/L H2SO4）取去离子水177.8 mL，缓慢加入H2SO4 (96%) 22.2 mL，10 mL/瓶，28保存。B.8 柠檬酸盐缓冲液（pH5.0，0.01 mol/L） 0.1 mol/L 柠檬酸：取21.01 g柠檬酸，加蒸馏水至1000 mL。0.1 mol/L 柠檬酸钠：取29.41 g柠檬酸钠，加蒸馏水至1000 mL。取9 mL 0.1 mol/L柠檬酸和41 mL 0.1 mol/L 柠檬酸钠，用1 mol/L的NaOH调pH值至5.0，加蒸馏水定容至5000 mL，混匀，100 mL/瓶，2 8 保存。B.9 4%缓冲福尔马林取40%甲醛溶液4 mL，加蒸馏水定容至100 mL，混匀，2 8 保存。B.10 4%多聚甲醛取20 g多聚甲醛粉末，加蒸馏水定容至500 mL，混匀，100 mL/瓶，2 8 保存。B.11 3% H2O2甲醇溶液取1.5 mL H2O2，加甲醇溶液定容至50 mL，混匀，28保存。B.12 1.5%的牛血清白蛋白 取1.5 mL新生牛血清，加1PBS缓冲液定容至100 mL，混匀，28保存。 _