脂环酸芽孢杆菌(-Alicyclobacillus).ppt

脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)的检测与控制严纪文J概述脂环酸芽胞杆菌(Alicyclobacillus)是脂环酸芽胞杆菌属，革兰阳性(仅有一株为革兰阴性)的芽胞杆菌。人们根据其耐热、耐酸的特性，俗称为耐热菌、耐热耐酸菌、嗜热耐酸菌、嗜酸耐热菌等。已有文献报导：脂环酸芽胞杆菌是引起果汁、酸性饮料(尤其是巴氏灭菌的果汁)腐败变质的主要元凶。1998 年美国国家食品生产者联盟(NFPA)经过调查发现，美国35%的果汁腐败都与嗜酸的芽胞杆菌有关。嗜酸耐热菌的在芽孢可橙汁中萌发、生长，也可以在30的苹果汁、葡萄汁中生长良好。导致果汁产品腐败的嗜酸耐热菌主要是酸土脂环酸杆菌。引起的果汁腐败变质的主要是它的代谢产物。2000年起，美国及欧洲大部分果汁消费国要求浓缩果汁中脂环酸芽胞杆菌的含量应1CFU/10mL。2002年起，浓缩果汁中对耐热嗜酸菌的要求为不得检出。脂环酸芽胞杆菌引起腐败的初期不易发现，产品并不出现明显的涨包或酸败。因而在低污染时难以检出，但其代谢产物达到万亿分之一的浓度时，就会使果汁口感风味变劣、浊度升高乃至在包装底部形成白色的沉淀等质量危害。其芽胞还可污染生产中的半成品(浓缩果汁)、生产材料(加工水果)、生产设备。Walls 等人对酸土环脂芽孢杆菌的致病性进行了研究，他们将含有高浓度酸土脂环酸芽孢杆菌的生理盐水悬菌液0.5ml 注射到小鼠腹膜内，小鼠未表现出任何异常现象，证明在受试浓度内该菌不具致病性。用含菌5106CFU/m l 的苹果汁饲喂豚鼠，一周后豚鼠仍表现正常。至今未见关于饮用了含脂环酸芽孢杆菌的果汁后导致疾病的病例报道。小结：脂环酸芽胞杆菌虽然可引起饮料变质，但目前未发现其对人致病。愈创木酚愈创木酚，又称邻甲氧基苯酚、2-甲氧基苯酚。是用于食品的合成调味料，它可以产生甜、烟熏和烧烤风味。n卤酚溴酚：包括2，6-二溴苯酚(2，6-DBP)和2，6-二氯苯酚(2，6-DCP)，可产生“药味”、“消毒水味”。脂环酸芽胞杆菌的代谢产物脂环酸芽胞杆菌的分类与命名1971年Darland和Brock在美国的酸热环境中分离到芽孢杆菌Bacillus acidocaldarius，该菌细胞膜中具有独特的-环己烷脂肪酸结构和藿烷化合物结构；且这种菌只在酸热的环境中存在，将其命名为酸热脂环芽孢杆菌。不久Hippchen等也在土壤中分离到相似的菌株。1984年Cerny等在腐败的苹果汁中分离到一株细胞膜中含-环己烷脂肪酸结构的芽孢杆菌，高度怀疑该菌导致了苹果汁的腐败。1987年Deinhard 等对包括前述菌株的13株耐热耐酸菌做了结构分析和全面的鉴定。将其中一株与B.acidocaldarius相似的菌株命名为酸土环脂芽胞杆菌(B.acidoterrestris)。1992年Wistozkey 等对这些菌株进行了16S rDNA 序列分析将这三株菌从芽孢杆菌属中划分出来，命名为脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)。Churey等人1994 年从腐败的苹果汁中发现嗜酸耐热芽胞菌，经鉴定为酸土脂环芽胞杆菌。Splittstoesser等人从腐败的无菌包橙汁中发现2 株嗜酸耐热芽胞菌，革兰染色阳性，芽孢耐热性D90为1623min，D95为 2.42.8min。脂环酸芽胞杆菌的模式株：A.acidoterrestris酸土环脂芽胞杆菌。19982003年，不断有人从南极、亚速尔群岛、日本仙台火山附近的土壤中分离到这类细菌。至此脂环酸芽胞杆菌属有11个种，1个亚种。该菌属新菌种的发现仍在继续。脂环酸芽胞杆菌的生化特性可生存在高温、高酸的条件下。最适生长温度为4253，生长pH2.06.0。在某些特殊的培养基中不能生长。如：酸土环脂芽胞杆菌不能生长于含胰酪蛋白胨、牛肉汤琼脂的培养基中，甚至pH达到3.5时也无法生长。菌株在培养基中45需氧培养 12d即形成明显的菌落。菌落形态一般为圆形饱满、乳白色、半透明或不透明，直径为0.55mm。菌体形态为杆状，革兰染色阳性，产芽孢，芽孢呈椭圆形，端生或次端生，有时会使菌体细胞膨大，菌体宽0.351.1m、长26.3m。好气生长。对脂环酸芽胞杆菌的生化鉴定常采用API 50CHB鉴定系统。API 50 CHB鉴定系统采用49 种碳源(糖、醇)，观察芽胞杆菌对其的利用情况进行编码鉴定。但脂环酸芽胞杆菌的部分菌株之间糖利用情况的差异并不显著，往往需要进一步的鉴定。酸土环脂芽胞杆菌生化反应生化项目生化项目反应反应触酶触酶+氧化酶氧化酶-明胶液化明胶液化+淀粉水解淀粉水解+吲哚产生吲哚产生-V-P试验试验-氮源利用氮源利用+脲酶试验脲酶试验+目前分离脂环酸芽胞杆菌的常用培养基：BAM(Bacteria Acidocaldarius medium)；OSA(orange serum agar)；PDA(patato destrose agar)，但需调节pH至3.5；YSG(yeast starch glucose)；K氏培养基；SK琼脂培养基 等。脂环酸芽胞杆菌的 生长温度、pH范围菌种生长温度()最适温度()生长 pH最适 pHA.acidocaldarius 45 702 6A.acidoterrestris35 55 42 53 2.25.8 A.cycloheptanius 42 53 48 3 5.5 3.54.5 A.hesperidum 35 60 50 53 2.5 5.5 3.5 4 A.Genomic species1 40 70 60 63 2.0 6.0 3.5 4.0 A.herbarius 35 65 55 60 3.5 6 4.5 5 A.acidiphilus 20 55 50 2.5 5.5 3 A.genomic species 2357055652.56.04.05.0A.sendainius4065552.56.55.5A.pomorum306045504.55A.vulcanius3565552.06.04.0嗜酸耐热菌在不同果汁中的抗热性产品产品pH值值可溶性固形物可溶性固形物温度温度()D值值/min苹果汁苹果汁3.511.485569023952.8葡萄汁葡萄汁3.315.885579016952.4橙汁饮料橙汁饮料4.15.3955.3橙汁橙汁3.9未报导未报导9010.3953.598037.9橙汁橙汁3.511.78565.69111.9浓缩果汁浓缩果汁2.526.1913.8浓缩果汁浓缩果汁2.558.59124.1研究表明：培养基中的阳离子(Ca+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Sr2+)对嗜酸耐热菌的抗热性无影响。有机酸的不同(苹果酸、柠檬酸、酒石酸)对嗜酸耐热菌的抗热性无显著性影响。在8891范围内，当pH值增加约0.6时，D值增加近1倍可溶性固形物的含量会影响嗜酸耐热菌抗热性，在同样温度时，D值随可溶性固形物的增加而增加。但当温度接近97时，影响不明显。脂环酸芽胞杆菌的分布 与污染途径脂环酸芽孢杆菌通常存在于土壤中，在18 70 生长，pH 2 7 存活，当pH 4 时便生出芽孢成为变异细胞，芽孢的耐热能力为85 56min，90 15min，95 2.4min。通过土壤、灰尘、昆虫等附着在果实表面。此外，该菌也可以通过其特殊的细胞结构黏附在果实表面。脂环酸芽胞杆菌检验方法介绍原理：样品经热处理，去除样品中的非耐热杂菌，取适量样液用0.45um滤膜过滤后，将滤膜贴于培养基中，培养后进行菌落计数，必要时可于显微镜下检查芽孢。仪器：恒温水浴：801。恒温培养箱：401。灭菌培养皿：直径为90mm。灭菌试管：18180mm。滤膜：0.45um水系一次性滤膜。K氏培养基的配制：酵母粉 1.25g蛋白胨 2.50g 葡萄糖 0.5g 吐温80 0.5ml 琼脂 6.50g 蒸馏水 500ml l配制方法：将各成分加入蒸馏水中，溶解后，在121灭菌1525min，冷却至约50 时用经过滤除菌的12.5%的苹果酸(1.25g苹果酸加入10ml蒸馏水，溶解后以0.45m滤膜过滤)调节pH3.70.1，倾注平板。平板密封后置05 下可保存60d。样品处理-浓缩汁以无菌操作分别取10ml浓缩汁于二个15ml灭菌的试管中，其中一管插入温度计(温度控制管)。将二样品管置80 1 的水浴中，观察温度控制管中温度计的温度，当温度计读数达到80 1时，开始计时，维持13min。水面应高于试管中的样品。取出后迅速冷却至室温。用90ml的灭菌蒸馏水将热处理过的样品转入灭菌容器中，摇匀。将稀释后的样品溶液用0.45um的滤膜真空过滤。也可根据样品的污染情况，选择合适的稀释度进行过滤。样品处理-清汁、水分别取150ml清汁（或水）于二个已灭过菌的玻璃样品瓶中，同上操作。样品冷却至室温，用0.45um的滤膜真空过滤。也可根据样品的污染情况，选择合适的稀释度进行过滤。样品处理-浊汁分别取20ml浊汁于二个已灭过菌的试管中，同上操作。样品冷却至室温，用0.45um的滤膜真空过滤。也可根据样品的污染情况，选择合适的稀释度进行过滤。培养与计数用灭菌的镊子，将过滤膜从过滤器上取下放在K氏培养基上，保证滤膜与培养基接触，不能留有气泡。倒置于40 41恒温培养箱中，可在恒温培养箱底部放置一个有水的盘子，以调整恒温培养箱的湿度，培养5d。培养结束后，记录该培养温度下滤膜上的菌落数。报告：CFU/10ml。关于脂环酸芽胞杆菌的检验要点培养基的pH调节：建议使用苹果酸，浓度可在1020%之间。据文献报导培养基的pH在3.70.1时，耐热菌生长良好。如配制200ml K氏培养基，用0.336g苹果酸即可达到pH3.70.1。取样量选择原则：浓缩汁-少取并稀释；成品料-多取，可不稀释或直接过滤。注意样品的代表性(视污染情况而定)。培养基的用量：因本实验的培养时间较长(5d)，所以每皿培养基的用量应在20ml以上，以避免因培养基水分损失造成细菌不生长。热处理的温度与时间：热处理温度多采用80 1，但也有采用74 76 进行热处理。热处理时间：1020min都有人选择。选择原则：接近巴氏灭菌的温度与时间，的或产品生产工艺要求的温度与时间。培养时间与温度：培养温度：在40 45，可根据样品中污染情况选择适宜的培养温度。培养时间：多数为5d，也有35d。但培养5d更利于芽胞的复苏。菌落的识别：脂环酸芽胞杆菌在K氏培养基上的菌落大多为奶油色，轻微的凸起，不透明。生长速度很快，有时24h即可形成芽胞，必要时可镜检芽胞。芽胞多位于菌体的顶端或中部。注意实验过程的不确定度：在同样的条件（人员、仪器设备、实验室相同、短暂的时间间隔）下，同一个实验样品检测两次的结果的差异应5%。在不同的条件（人员、仪器设备、实验室、时间不同）下，同一个实验样品检测两次的结果应100CFU，将冲洗液10倍稀释，分别进行细菌、真菌计数。涂抺法：适用范围：加工车间墙壁、地板、天花板、设备表面、大容器等较平坦的表面。操作方法：取灭菌的棉拭子(棉拭子的竹签应比试管长23cm)，在灭菌水管或冲洗培养基中湿润并在管壁内旋转挤压出多余的液体。握住棉拭子一端，以30角度与表面接触，缓慢而充分地在一定面积或规格板范围内涂抺，涂抺三次，每次涂抺时要变换拭子头的方向。将棉拭子放回灭菌水管或冲洗培养基中，浸洗一下挤出液体，继续用上述方法涂抺另外几个取样点。(取样点视代表面积大小确定)。最后一个点涂抺完成后，将棉拭子放回灭菌水管或冲洗培养基中。剪断手握的竹签部分。冲洗培养基可直接培养。灭菌水取样应振荡涂抺液后，吸取1ml和0.1ml分别接种平皿，倾注培养基后培养。结果报告：CFU/cm2。可选用的冲洗培养基LG(Linden Grain Medium)培养基：分成：蛋白胨2.0g葡萄糖20.0g酵母膏粉3.5g硫酸铵2.0g磷酸二氢钾1g硫酸镁1g注：用该培养基冲洗机械管道后，可分别接取起始段、中间段和尾段培养基直接进行培养，同时检测细菌和真菌。LG冲洗培养基-霉菌第三天第七天第十天第十五天LG冲洗培养基-酵母菌第三天第七天第十天第十五天LG冲洗培养基-细菌第一天第七天第十天第十五天食品加工现场空气采样的方法对加工现场室内外空气的污染程度的检测方法有：沉降平板法；撞击平皿法；吸收管法；滤膜法。沉降平板法：室内：一般30m2的车间可选择房内的四角和中央5个点，如谢谢!此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！