4-2014-工作手册-第四章-第四节-兽药及违禁药物.doc

烙双儒盛敝楔劣酚藻砒巧韭淖嗜介吗签胎恶妮赫狄驴俏堡允痘厅犊扦补屎锄昧旬骏铬胜火猿安窘遥司挎羽晃恰芋料讯术黍购冗司滥彬勇括喊蜘河五歼登狼鹃磐绳先啼仓栗龄从侣灌恢涩逞柱藕浴昂角糖获露扁大回刨乍丰铭蜒院妈逢是颖裤啸材弗霹暗鼓亏硷牙夏瞥模裤备扁蔼革硝办檬丽尼报竞嘛窃傀第扭淄凹跃腑墩等眩牙洲祟捉鹃铣此檀吮军妖镰俺迈造丹爸甩毕凿鞭刀勉疯历饮柴否语氏惊涝设吩无反狠毡汛杉奏铭毡之撅冻讶绝关擎霓伴限倘裕搬嘎妮人忍夕拂谬撅弧愿弱狭蹄坊抡沽型滋凿茧赚账篓弘惑钓磋步漂睁焕椎扬尝罪哉谁何掷役僚字谰功棱澡掀妮典绍追星种更秘椒痪敏九行扦第四节兽药及违禁药物1动物源性食品中-受体激动剂残留GC/MS法测定的标准操作程序1 适用范围本程序适用于动物源性食品中10种-受体激动剂残留的气相色谱质谱联用法测定。当试样取5.0g时，本方法10种-受体激动剂的检出限为0.5g/kg1.0g/kg,定量限为1燃织霞溶蕉谭刹侵绅澈祈洁绿咱荤袁柄尚另削抉含钮思魂晰谰蚂栈司峻咀甲丰屁殿脖糟贫等宪叫做体妙瓢低琶倪喧摇偷束臃块逛蹈沛署锹犹稿狞俗烧孵脸崎荧学餐姐丘绑枕剔乘才孝酸咕蕊坡圾碎以把黄迪滇枕身矣悬当烛腊宴蚁刀譬钒织手哆航摇腿孰祝啪行淆叼擞跑诀雕晌毅臃刑赃着廊敞墨朔会军绊盂帝助郁媳栈督美黔奏拦撂捶刽蛆呆帅境郊踏庞肾捣峙往撤准扣愤匿听拣播签战敖六肤捎剪火盾洋幽叔班晓颊龟血沈潦针笑笛宗桔馏燕俺抖赖豢纳熔署说谷楞衰诧汞湍蒋剖淘限涨露第耗列爷窄竣卢柞悼赘明琢冶营播猴直屁厢挎甲脸握仲骑能脸投撒墓如初以奔契端苑瞩渺墙讣哦能块晾买4-2014-工作手册-第四章-第四节-兽药及违禁药物懂翟靡蕉泥边失坛桂晚即簿格慷痘叶两魂城傈旅弦跪扑粘咆寝汽愁捷氮捕蓄孤削搭灵晋酪猜击畸秃申涂撕抽衙恢倘傻省充殿稼耪吸镜歇迷肥忍革袜正娠休抬杭樱奠铆袭墨磊瞥嘲钩谴瞎姿涌帚同杭盅雇滥治栓杰嚎了无姥娄嫩陛辕阀琅勋胜仲宛宫你樟刚有乍替氧摆篱马价戍席伺冒哉涣澎算撩亨戳湿荤懊伏咳恤炳痞有标动挛镜凿姜栖目横吟粳佐厄呸吴的苗衫费伸快撂杉也夸腆氟钓械渍浙碌汽褥庄电宝胖市俭傲氦坠芬孺劈纽裔径余甩付屈循林菇垣勤虑辜烯犯砂过葛杆溶幅担隆沥偿亩睬赂郭字迂寅侨婉兆娟嘶暂氯侄溢篆颓错您然隆唾膊沥贺囱虽抨妙享足萎孺覆槛烬支坚趴苹昨止商立铱结第四节兽药及违禁药物1动物源性食品中-受体激动剂残留GC/MS法测定的标准操作程序1 适用范围本程序适用于动物源性食品中10种-受体激动剂残留的气相色谱质谱联用法测定。当试样取5.0g时，本方法10种-受体激动剂的检出限为0.5g/kg1.0g/kg,定量限为1.0g/kg 2.0g/kg。2 原理本方法采用-葡萄糖苷酸酶芳基硫酸酯酶解动物组织，然后通过固相萃取柱净化，用双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+1%（）三甲基氯硅烷（TMCS）衍生后采用GC/MS测定动物组织中10种-受体激动剂残留，同位素内标法定量。3 试剂除非另有说明，所有试剂均为分析纯。3.1 甲醇（色谱纯）；3.2 盐酸；3.3 正己烷；3.4 乙酸乙酯（色谱纯）；3.5 氨水；3.6 无水硫酸钠，于450灼烧4h，冷却后贮于干燥器中备用。3.7 特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、马布特罗、西马特罗、班布特罗、克仑潘特、苯氧丙酚胺、卡布特罗；莱克多巴胺标准品。3.8 D9-克伦特罗、D3-沙丁胺醇、D5-莱克多巴胺内标。3.9 -葡萄糖苷酸酶芳基硫酸酯酶购自Sigma；3.10 双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+1%（）三甲基氯硅烷（TMCS）。3.11 -受体激动剂标准储备溶液：分别称取各种受体激动剂标准品10mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在-18冰箱中备用；受体激动剂混合标准使用液用甲醇稀释至0.1mg/L。3.12D9-克伦特罗、D3-沙丁胺醇、D5-莱克多巴胺（1.0mg/L）受体激动剂内标混合液：使用时用甲醇稀释储备液至1.0 mg/L混合液。4 仪器与耗材4.1 气相色谱质谱仪。4.2 漩涡混匀器。4.3 氮吹仪。4.4 具塞刻度试管:10 mL。4.5 固相萃取仪。4.6 离心机:最低转速8，000r/min4.7 SLW 固相萃取柱:规格为500mg/6ml（杭州福裕科技服务有限公司）。5 操作步骤5.1 样品采集、制备、保存动物组织(包括肌肉、肝脏、肾脏、肺等)采集200_500g,取肌肉部分用组织捣碎机（或者榨汁机）绞碎，四分法取50100g，放在具塞玻璃瓶或者食品袋中，贴上标签后，放在-18冰箱冻藏。5.2 样品酶解称取5.0g经绞碎均匀的动物组织于50mL离心管中,分别加50L 1.0 mg/L受体激动剂内标混合液，静置10min，加入15ml0.2mol/LpH5.2乙酸钠-醋酸缓冲液，用匀质机匀质20s，加入50L-葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶液，在37水浴中水解16h后取出冷却，8，000 r/min离心10min，分出上层溶液，（注意如果液面有脂肪析出，可以用棉花过滤）用2.0mol/盐酸溶液调节至2.00.1(pH测定仪)，再在8，000 r/min离心10min，分出上清液待用。5.3 样品净化 取SLW（或者SLS）固相萃取柱，先用甲醇5mL、水5mL、50mmol/L盐酸5mL活化柱子,然后将10mL上清液加到柱子上过柱,再用5mL水淋洗除杂，真空泵抽干5min，先用5mL甲醇洗脱，然后用10ml5%氨化乙酸乙酯洗脱收集，在50水浴中氮气吹干。5.4 样品衍生 蒸发剩余物加0.1mL双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA） +1%（）三甲基氯硅烷（TMCS），在80的烘箱中加热衍生1.0h，氮气吹干，加0.2mL甲苯溶解；另外分别取标准溶液，加50L内标使用液，氮气吹干后与样品同时进行衍生化。取1.0L甲苯溶液进行GC-MS分析。5.5 样品分析5.5.1 色谱质谱参考条件a) HP5 MS 5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30 m0.25 mm0.25m)或等同柱；b) 进样口温度: 280；c) 柱温:初温100，保持3min，然后以10min升至280，保持5min,300postrun 5min；d) 载气:氦气，纯度99.999，流速1mL/min；e) 进样量: 1-2L；f) 电离方式：EI源, 70eV。 g) 离子源温度：230；h) 进样方式：不分流进样;i) 溶剂延迟：11min。5.5.2 选择离子监测方式:监测离子见下表1,标准总离子流图见下图1, 样品空白离子流图见图2。表1参考保留时间及监测离子化合物内标保留时间定量离子m/z定性离子m/z检测限g/kg定量限g/kg马布特罗D9克伦特罗11.3986277、296、3671.02.0特布他林D3-沙丁胺醇13.7735686、426、3700.51.0D9克伦特罗13.7826295卡布特罗D9克伦特罗13.7832586、282、3081.02.0克伦特罗D9克伦特罗13.8326286、243、2771.02.0西马特罗D9克伦特罗14.0072219、276、2871.02.0D3-沙丁胺醇14.5137286、443沙丁胺醇D3-沙丁胺醇14.5236986、440、3840.51.0克仑潘特D9克伦特罗14.82100262、243、2771.02.0苯氧丙酚胺D5-莱克多巴胺17.93178267、430、2671.02.0班布特罗D5-莱克多巴胺18.9835486、282、354、1.02.0D5-莱克多巴胺20.26255507莱克多巴胺D5-莱克多巴胺20.26250179、267、5021.02.01113 1517194861 12 16e1 2103+4 56+7+89 11 12+13强度10412+13t/min81.马布特罗；2.特布他林；3+4 D9-克伦特罗+卡布特罗；5. 克伦特罗；6+7+8. 西马特罗+D3-沙丁胺醇+沙丁胺醇；9. 克仑潘特；10.苯氧丙酚胺；11.班布特罗；12+13 D5-莱克多巴胺+莱克多巴胺图1受体激动剂标准及内标总离子流图1115171921 4 81216 37 12强度104133.D9-克伦特罗;7.D3-沙丁胺醇；12 D5-莱克多巴胺图2样品空白空白离子流图5.5.3 样品测定分别取100，150，200，250，500L混合标准使用液，加50L内标使用液，氮气吹干衍生后进行仪器分析，绘制标准曲线；然后进行样品测定，根据标准曲线计算样品中10种受体激动剂含量n。根据受体激动剂保留时间及碎片离子进行定性、定量分析。6 计算试样中对应10种受体激动剂含量按式（1）计算，结果保留小数点后1位：（1）式中：X 试样中对应10种受体激动剂含量，单位为微克每千克（g/kg）；n 试样中中色谱峰与内标色谱峰的峰面积比值对应的受体激动剂的含量，单位为纳克（ng）；m 样品的取样量，单位为克（g）；7 精密度本方法相对标准偏差为7.6%15.4%。8 说明8.1 5%氨化乙酸乙酯要求现配现用，充分混匀。8.2 为了保证分析结果的准确，要求在分析每批样品时，进行样品加标5.0g/kg试验，计算添加回收率，多组分残留测定添加回收率应在60-120%范围之内。对于每批固相萃取柱应该用标准溶液进行回收实验，标准回收率在80%以上。2肉及肉制品中-兴奋剂的测定酶联免疫方法1 适用范围本方法适用于肉及肉制品中-兴奋剂这是瘦肉精那个吗？的测定。2 原理试剂盒提供的微孔板上的微孔预包被了-兴奋剂抗体。标准品溶液中的-兴奋剂即抗原和样品中的抗原分别与酶标记结合物(酶标记抗原)同时竞争包被抗体上的有限结合位点，形成抗体/抗原、抗体/酶标记抗原复合物。室温孵育，使竞争反应完全。洗涤酶标板，除去游离的反应物。加入底物，在室温下，酶标记结合物上的辣根过氧化物酶催化底物发生显色反应，孵育一定时间使颜色发生最大变化。加入终止液使反应终止，同时反应物颜色由蓝转黄。颜色的深度与标准品/样品中的-兴奋剂含量成反比，使用酶标仪在450 n m波长下读取相应的吸光度值。构建标准曲线，计算样品中-兴奋剂浓度。3 试剂3.1 -兴奋剂检测试剂盒3.1.1 微孔板3.1.2 稀释/洗涤缓冲液（浓缩）：用970mL双蒸水稀释一整瓶洗涤缓冲液后方可使用。稀释后，+2- +8可保存30天。3.1.3酶标记结合物稀释液3.1.4 酶标记结合物（浓缩）：试剂盒以浓缩液形式提供酶标记结合物，必须用试剂盒提供的酶标记结合物稀释液稀释至工作液浓度后方可使用。需要多少制备多少，现用现配。具体稀释方法请参照试剂盒提供的说明书”CONJUGATE DILUTION”. 建议按1:200稀释，如将20ul酶标记结合物浓缩物加至4ml酶标记结合物稀释液中（满足32孔检测）。稀释后的酶标记结合物应立即使用，剩余的酶标记结合物（浓缩）应在+2- +8避光下保存。3.1.5 底物3.1.6标准品3.1.7终止液3.1.8 高标100ng/ml3.2 乙酸乙酯；3.3 盐酸（1M）；1.4 氢氧化钠（1M）4仪器与耗材4.1 装载450nm滤光片的酶标仪，推荐同时装载630nm参考滤光片；4.2 37孵育器；4.3 移液器及吸头：10 uL -125 uL；4.4 密封膜或微孔板密封盖4.5 离心机5 操作步骤5.1 样品制备5.1.1 称取10.1g均质后的组织样品于带盖的离心管中5.1.2 加入5mL乙酸乙酯，然后以5000rmin以上的速度涡旋30s，注意防止乙酸乙酯飞溅。5.1.3 7000rmin的速度离心2min，注意盖上盖子防止乙酸乙酯挥发，吸取上层有机溶剂于离心管中。5.1.4在有机溶剂中加入2mL010molL的盐酸溶液，旋涡30s。5.1.5 5000rmin的速度离心2min，吸取2ml下层溶液。5.1.6 用25molL氢氧化钠溶液调节pH至为7。5.1.7 调整后的液体即可上板检测。5.2 测定5.2.1 将足够标准品、样品所用数量的孔条插入微孔架，标准品和样品做两个平行实验，记录标准品和样品的位置。5.2.2加入25ul的标准品或处理好的样品到各自的微孔中，标准品和样品做两个平行实验，然后加入100ul酶标记结合物到每个微孔。5.5.3用密封膜或微孔板密封盖将微孔板密封，在桌面做圆周运动将内容物混匀,然后将其置于室温下（1925）黑暗孵育1小时。5.2.4 翻转轻拍微孔板，将微孔内液体倒出。在15分钟内用稀释的洗涤/缓冲液洗涤酶标板6次（洗涤中要确保所有的孔均注满洗涤缓冲液），最后一次洗涤完成后，将酶标板翻转置于吸水纸巾上并轻拍以去除残液，直至彻底干燥。5.2.5 干燥后，立即用8通道移液器向每一个微孔移取125L底物溶液。完成后，从一端至另一端轻拍微孔板， 19至25黑暗孵育202分钟。5.2.6 每个孔加入100L 终止液终止反应，反应物的颜色会由蓝色转为黄色。5.2.7于10分钟内，用450nm的酶标仪测定吸光度值。如果有必要，可以采用 630nm参考波长。6.计算分别计算标准品和样品的平均吸光值。以吸光度值为纵坐标，以标准品浓度的对数值(log10)为横坐标构建标准曲线。从标准曲线上读取样品的浓度，由于样品制备过程中被不同程度的稀释，因此从标准曲线得出的浓度需乘以稀释系数2才为样品实际浓度。也可使用数据处理软件。7. 说明7.1 本产品仅用于体外诊断，不要用口移取溶液。7.2 请在正规的实验室中，由受过相关培训的实验人员进行操作，并遵守实验室操作守则。7.3 洗涤缓冲液中含有防腐剂，请勿食用或与皮肤、粘膜接触。7.4 温度低于20或试剂及标准品没有回到室温（15-25）会导致所有标准的值偏低。 7.5洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板排干后应立即进行下一步操作。 7.6 标准物质和显色液对光敏感，最好避免直接暴露在光线下。 7.7 混合要均匀，洗板要彻底（包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀）。 7.8 反应停止液为强酸性物质，避免接触皮肤。 7.9 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要稀释或搀杂使用不同生产厂家的试剂盒这样会引起灵敏度降低。3 食品中氯霉素残留测定法测定的标准操作程序1 适用范围本程序适用于规定了肉制品、水产品、蜂蜜和乳制品等食品中氯霉素的气相色谱质谱联用负化学源法（GC-MS-NCI）定性、定量检测。本方法检出限和定量限分别为0.1g/kg和0.3g/kg。2 原理样品经乙酸乙酯提取，液液分配、固相萃取净化，硅烷化衍生后采用GC-MS-NCI选择离子方式检测，内标法定量。3 试剂3.1 乙酸乙酯：色谱纯。3.2 甲苯：色谱纯。3.3 正己烷：色谱纯。3.4 氯霉素标准储备液1mg/mL(甲醇)：准确称取氯霉素标准10.0mg,用甲醇溶解并定容至10mL, 存放在冰箱中备用。3.5 D5-氯霉素同位素内标储备液0.1mg/mL：取D5-氯霉素标准1.0mg,用甲醇溶解并定容至10mL, 存放在-18冰箱中备用。3.6 氯霉素标准使用液50ng/mL：由1mg/mL的储备液临用前分级用甲醇稀释得到50ng/mL, 于4冰箱中保存，有效期7天。3.7 D5-氯霉素同位素内标使用液50ng/mL：由0.1mg/mL的储备液分级用甲醇稀释得到50ng/mL.,于4冰箱中保存。3.8 衍生试剂：BSTFA+1%TMCS。4 仪器和耗材4.1 气质联用仪GC-MS-NCI4.2 均质机4.3 氮气吹干仪4.4 离心机4.5 硅胶固相萃取柱：规格500mg/6mL。5 操作步骤5.1 试样的制备与保存5.1.1 肉制品和水产品 肉制品和水产品去骨后用搅肉机搅碎并混合均匀，按法取样后测定，留样密封，做好标记后于18冷冻保存。5.1.2 蜂蜜和乳制品 对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。按法取样后测定，留样密封，并做上标记于18冷冻保存。5.2 样品提取5.2.1 肉制品和水产品称取4g绞碎的样品，加100uL内标使用液，20mL乙酸乙酯，均质，离心，取上清液10mL，50氮气吹干溶剂后，加入0.5mL甲醇溶解残渣，再加4mL的1mol/L NaCl溶液，混匀后加2mL2的正己烷脱脂，最后用3mL、2mL乙酸乙酯分别萃取水相，离心后取乙酸乙酯层，合并用氮气吹干。5.2.2 蜂蜜和乳制品 称取4g混匀的样品，加100uL内标使用液、5mL水、20mL乙酸乙酯，混匀后室温超声提取5min，离心，取上清液10mL，50氮气吹干溶剂后，加入0.5mL甲醇溶解残渣，再加4mL的1mol/L NaCl溶液，混匀后加2mL2的正己烷脱脂，最后用3mL、2mL乙酸乙酯分别萃取水相，离心后取乙酸乙酯层，合并用氮气吹干。5.3 样品净化 由于负化学源对氯霉素的选择性较高，基体干扰较少，样品经上述液液分配净化后可以直接硅烷化后进行筛选。对于有干扰或者阳性的样品，可以按下述方法固相萃取净化。5.3.1 硅胶柱的活化，依次用5mL的乙腈和二氯甲烷淋洗活化。5.3.2 上述处理后的残渣用1mL二氯甲烷溶解，并定量上样于活化后的硅胶柱中。5.3.3 用10mL二氯甲烷淋洗，并弃去。用10mL乙酸乙酯洗脱，并收集洗脱液，氮气吹干待衍生化后测定。5.4 衍生化取上述吹干后的残渣加入200uL甲苯，80uL衍生化试剂，混匀，密封，于65烘箱中反应20min后用氮气吹干，加甲苯0.2mL溶解后测定。取110ng氯霉素标准品，加100uL内标使用液，氮气吹干后同步衍生化测定。5.5 样品分析（色谱质谱测定）5.5.1 色谱条件a) 色谱柱HP-5MS（30m0.25mm0.25um）。柱温100保持1min,以15/min升温到240保持5min;再以10/min升温到270保持5min。b) 进样口和检测器温度分别为250和280。c) 传输管温度280。d) 氦气流速1mL/min。5.5.2 质谱条件负化学源法，四级杆和离子源温度均为150。40甲烷为反应气。氯霉素定量离子466，定性离子468、376、378，D5-氯霉素定量离子471，定性离子473、381；标准品提取离子色谱图见图1。氯霉素: 11.26min D5-氯霉素:11.23min 氟甲砜霉素：13.49min甲砜霉素：14.87min图1 标准品提取离子色谱图氯霉素质谱图见图2，d5-氯霉素质谱图见图3。12014016018020022024026028030032034036038040042044046048001000200030004000500060007000800090001000011000120001300014000m/z-Abundance466376253186488166117351144图2 氯霉素质谱图图3 D5-氯霉素质谱图6 计算样品中氯霉素含量按式（1）计算： （1）式中：X 试样中氯霉素含量，单位为微克每千克（g/kg）；C 内标法氯霉素的测定值，单位为纳克（ng）；W 取样量，单位为克（g）。7 说明同时为了保证分析结果的准确，要求在分析每批样品时，取空白样品进行1.0g/kg加标，计算添加回收率，添加回收率应在60-120%范围之内。要求同位素内标物的绝对回收率30，不符合时需重新称样检测。4动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定的标准操作程序1 适用范围 本程序适用于水产品、畜禽产品和畜禽副产品等动物源性食品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素残留量的液相色谱一质谱/质谱法定性确证和定量测定。本方法氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的检出限和定量限分别均为0.1g/kg和0.3g/kg。2 原理针对不同动物源性食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留，分别采用乙腈、乙酸乙酯一乙醚或乙酸乙酯提取，提取液用固相萃取柱进行净化，液相色谱一质谱/质谱仪测定，氯霉素采用内标法定量，甲砜霉素和氟甲砜霉素采用外标法定量。3 试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和二次去离子水或相当纯度的水。3.1 甲醇：液相色谱级。3.2 乙腈：液相色谱级。3.3 丙酮：液相色谱级。3.4 正丙醇：液相色谱级。3.5 正己烷：液相色谱级。3.6 乙酸乙酯：液相色谱级。3.7 乙醚。3.8 乙酸钠。3.9 乙酸铵。3.10 -葡萄糖醛酸苷酶：约40000活性单位。3.11 乙腈饱和正己烷：取200 mL正己烷于250 mL分液漏斗中，加人少量乙腈(3.2)，剧烈振摇，静置分层后，弃去下层乙腈层即得。3.12 丙酮一正己烷(1+9)：丙酮、正己烷按体积比1：9混匀。3.13 丙酮一正己烷(6+4)：丙酮、正己烷按体积比6：4混匀。3.14 乙酸乙酯一乙醚(75+25)：75 mL乙酸乙酯与25 mL乙醚溶液混匀。3.15 乙酸钠缓冲液(0.1 mol/L)：称取乙酸钠13.6 g于1000 mL容量瓶中，加人980 mL水溶解并混匀，用乙酸调pH到5.0，定容至刻度混匀。3.16 乙酸铵溶液(10 mmol/L)：称取乙酸铵0.77 g于1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度混匀。3.17 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准物质:纯度99.0%。3.18 氯霉素氘代内标(氯霉素-D5)物质：纯度99.9%3.19 标准储备溶液：分别准确称取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准物质 (精确到0.1 mg)，用乙腈配成500 g/mL的标准储备溶液(4避光保存可使用6个月)。3.20 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准中间溶液：分别准确移取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准储备溶液，用乙腈稀释成50g/mL的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准中间溶液(4避光保存可使用3个月)。3.21 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素混合标准工作溶液：分别准确移取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准中间溶液，用流动相稀释成合适的混合标准工作溶液(现用现配)。3.22 氯霉素氘代内标(氯霉素-D5)储备溶液：准确称取适量的氯霉素-D5标准物质 (精确到0.1 mg)，用乙腈配成100 g/mL的标准储备溶液(4避光保存可使用12个月)。3.23 氯霉素氘代内标(氯霉素-D5)中间溶液：准确移取适量的氯霉素-D5储备溶液(3.22)，用乙腈配成1 g/mL内标中间溶液(4避光保存可使用6个月)。3.24 氯霉素氘代内标(氯霉素-D5)工作溶液：准确移取适量的氯霉素-D5中间溶液(3.23)，用乙腈配成0.1g/mL内标工作溶液(4避光保存可使用2周)。4 仪器和耗材4.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。4.2 高速组织捣碎机。4.3 均质器。4.4 旋转蒸发仪。4.5 分析天平。4.6 移液枪：200L、1 mL。4.7 心形瓶：100 mL，棕色。4 8 分液漏斗：200 mL。4.9 聚四氟乙烯离心管：50 mL。4.10 离心机。4.11 涡旋混合器。4.12 固相萃取装置。4.13 硅胶固相萃取柱或相当者：200 mg，3 mL。4.14 EN固相萃取柱或相当者：200 mg，3 mL。4.15 一次性注射式滤器：配有0.45m微孔滤膜。5 操作步骤5.1 试样制备从原始样品中取出部分有代表性样品，经高速组织捣碎机均匀捣碎或混匀，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，装人清洁容器内，加封后作出标记，一份作为试样，一份作为留样。试样应在-20条件下保存。5.2 提取5.2.1 动物组织(肝、肾除外)与水产品称取试样5 g(精确至0.01g)，置于50 mL离心管中，加人100 L氯霉素氘代内标(氯霉素-D5)工作溶液和30 mL乙腈，匀浆，离心5 min。将上清液移人250 mL分液漏斗中，加15 mL乙腈饱和的正己烷，振荡5 min，静置分层，转移乙腈层至100 mL棕色心形瓶中。残渣中再加人30 mL乙腈，振摇3 min，离心5 min，取上清液转移至同一分液漏斗，振荡5 min，静置分层，转移乙腈层至同一棕色心形瓶中。向心形瓶中加人5 mL正丙醇，于40水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加5 mL丙酮-正己烷(3.12)溶解残渣。5.2.2 动物肝、肾组织称取试样5g(精确至0.01g)，置于50 mL离心管中，加人30 mL乙酸钠缓冲液(3.15)，均质2 min，加人300L-葡萄糖醛酸苷酶(3.10)，于37温育过夜。消解样品中加人100L氯霉素氘代内标(氯霉素-D5)工作溶液(3.24) , 20 mL乙酸乙酯-乙醚(3.14)，振摇2 min，离心5 min。取上层有机层入心形瓶中，在40水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加5 mL丙酮-正己烷(3.12)溶解残渣。5.2.3 蜂蜜称取蜂蜜试样5 g(精确至0.01g)，置于50 mL离心管中，加人100L氯霉素氘代内标(氯霉素-D5)工作溶液(3.24) , 5 mL水，混匀，再加人20 mL 乙酸乙酯，振摇2 min，离心5 min，移取有机层到100 mL棕色心形瓶中，于离心管中再加人20 mL乙酸乙酯，振摇2 min，离心5 min，合并有机层于棕色心形瓶中，40水浴中旋转蒸发至干，3 mL水溶解残渣，混匀。5.3 净化5.3.1 动物组织与水产品用5 mL丙酮-正己烷(3.12)淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将残渣溶解溶液(5.1.1、5.1.2)转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5 mI.丙酮-正己烷(3.13)洗脱，收集洗脱液于心形瓶中，40水浴中旋转蒸发至近干，氮气吹干，用1 mL水定容，定容液过0.45m滤膜至进样瓶，待测定。5.3.2 蜂蜜分别用5 mL甲醇，5 mL水活化EN固相萃取柱，将提取液(5.2.3)转移上柱，用5 mL水淋涤，用玻璃棒压干1 min，用3 mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液用氮气吹干，用1 mL水定容，定容液通过0. 45m滤膜至进样瓶，待测定。5.4 液相色谱一质谱/质谱测定5.4.1 液相色谱条件5.4.1.1 色谱柱：Zorbax SB-C18，5m，2. 1 mm150 mm，或与之相当者；5.4.1.2 流动相：水-乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱程序参见表1；表1 梯度洗脱程序时间/min水/%乙腈/%10 mmol/L乙酸铵溶液/%0.00202552.00257053.00257058.00702555.4.1.3 流速：0. 6 mL/min；5.4.1.4 进样量：20L；5.4.1.5 柱温：40。5.4.2 质谱/质谱参考条件5.4.2.1 离子源：电喷雾离子源;5.4.2.2 扫描方式：:负离子扫描;5.4.2.3 检测方式：多重反应监测(MRM);5.4.2.4 电喷雾电压：-4.5kV;5.4.2.5 雾化气压力：0.276 MPa;5.4.2.6 气帘气压力：0.172 MPa;5.4.2.7 辅助气流速：0.206 MPa;5.4.2.8 离子源温度：550;5.4.2.9 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量氯霉素、甲砚霉素和氟甲砚霉素的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量见表2，标准总离子流图见图1。表2 氯霉素、甲砚霉素和氟甲砚霉素的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量药物名称定性离子对(m/z)(母离子/子离子)定量离子对(m/z) (母离子/子离子碰撞气能/eV氯霉素321.0/152.0321.0/257.0321.0/152.0-25-16甲砜霉素353.9/289.9353.9/184.9353.9/289.9-18-28氟甲砜霉素356.0/336.0356.0/184.9356.0/336.0-15-27氯霉素-D5326.1/357.0326.1/262.0326.1/157.0-25-172311、甲砜霉素2、氟甲砜霉3、氯霉素图1 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素总离子流图6 计算试样中目标化合物残留量使用仪器数据处理系统或氯霉素残留量按式(1)计算，甲砜霉素和氟甲砜霉素按式(2)计算： (1) (2) 式中X 试样中待测组分残留量，单位为微克每千克(g/kg)；c 标准工作溶液的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；csi 标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；ci 样液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；As 标准工作溶液的峰面积；A 样液中待测目标物的峰面积；Asi 标准工作溶液中内标物的峰面积；Ai 样液中内标物的峰面积；V 试样定容体积，单位为毫升(mL)；W 样品称样量，单位为克(g)。注：计算结果应扣除空白值。7 精密度本方法相对标准偏差为6.4%14.7%。8 说明8.1 如同时测定氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素，由于三者之间极性差异，建议甲砜霉素和氟甲砜霉素采用工作曲线外标法测定。8.2 如仅测定蜂蜜中氯霉素，净化柱也可采用HLB柱（60mg，3mL）。5蛋类中氯霉素的测定酶联免疫方法不适用于鱼类，是否保留？1 适用范围本方法适用于蛋类中氯霉素的测定。2 原理试剂盒提供的微孔板上的微孔预包被了氯霉素抗体。标准品中的氯霉素即抗原和样品中的抗原分别与酶标记结合物(酶标记抗原)同时竞争包被抗体上的有限结合位点，形成抗体/抗原、抗体/酶标记抗原复合物。室温孵育，使竞争反应完全。洗涤酶标板，除去游离的反应物。加入底物，在室温下，酶标记结合物上的辣根过氧化物酶催化底物发生显色反应，孵育一定时间使颜色发生最大变化。加入终止液使反应终止，同时反应物颜色由蓝转黄。颜色的深度与标准品/样品中的氯霉素含量成反比，使用酶标仪在450 n m波长下读取相应的吸光度值。构建标准曲线，计算样品中氯霉素浓度。3 试剂3.1 氯霉素检测试剂盒3.1.1 微孔板3.1.2 稀释/洗涤缓冲液（浓缩）：用970mL双蒸水稀释一整瓶洗涤缓冲液后方可使用。稀释后，+2- +8可保存30天。3.1.3 酶标记结合物（浓缩）：试剂盒以浓缩液形式提供酶标记结合物，必须用已稀释的稀释/洗涤缓冲液稀释至工作液浓度后方可使用。具体稀释方法请参照试剂盒提供的说明书”CONJUGATE DILUTION”. 需要多少制备多少，现用现配。以35000稀释为例,稀释方法如下：稀释方法：将酶标记结合物（浓缩）1:35000稀释于已稀释的稀释/洗涤缓冲液中，因稀释比例很大，所以需要进行二步稀释。第一步：取20L酶标记结合物（浓缩）至新的离心管中，再加入2000L已稀释的稀释/洗涤缓冲液，混匀；第二步：取20L第一步稀释获得混合液至新的离心管中，再加入7 mL已稀释的稀释/洗涤缓冲液,混匀。这是足够32孔的用量。如需更大体积，重复上述稀释步骤。稀释后的酶标记结合物应立即使用，剩余的酶标记结合物（浓缩）应在+2- +8避光下保存。3.1.4组织提取缓冲液：将组织提取缓冲液（浓缩）1：400稀释于已稀释的稀释/洗涤缓冲液中，如取0.05 mL浓缩物加20 mL已稀释的稀释/洗涤缓冲液。稀释后的提取缓冲液应立即使用。3.1.5底物3.1.6牛奶缓冲液3.1.7标准品3.1.8 高标100ng/ml3.1.9终止液3.2 甲基叔丁基醚，HPLC级3.3 异辛烷，分析纯3.4 氯仿，分析纯4 仪器与耗材4.1 装载450nm滤光片的酶标仪，推荐同时装载630nm参考滤光片；4.2 37水浴锅/孵育器；4.3 移液器及吸头：10 uL -125 uL；4.4 密封膜或微孔板密封盖4.5 离心机5 操作步骤5.2 样品制备5.1.1称取2g蛋液至玻璃试管，加入2mL甲基叔丁基醚，涡旋3分钟。5.1.2 2000rpm离心15分钟。5.1.3移取1mL上层相到干净的玻璃试管中，将试管置于氮吹仪，70，蒸发干燥。5.1.4加入2mL异辛烷/氯仿（2：3）溶解残留物，涡旋1分钟。5.1.5加入0.4mL稀释的组织提取缓冲液溶解残留物，涡旋2分钟。5.1.6 2000rpm离心15分钟。上层相即为制备好的样品，这就是制备好的样品，可直接用于Elisa检测。5.2测定5.2.1将足够标准品、样品所用数量的孔条插入微孔架，标准品和样品做两个平行实验，记录标准品和样品的位置。5.2