DB37∕T 4101—2020 苹果轮纹病菌快速检测方法(山东省).pdf

TCS 65. 020. 20 B 16 DB37 山东省山巳ET且，万标准DB37/T 4101-2020 苹果轮纹病菌快速检测方法Rapid detection of botryosphaeria dothidea 2020 - 08 -31发布2020 - 10 -01实施山东省市场监督管理局发布目IJ1=1 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:山东省烟台市农业科学研究院。本标准主要起草人:王英姿、刘保友、汪少丽、王培松、石洁。DB37/T 4101-2020 DB37/T 4101-2020 苹果轮纹病菌快速检测方法1 范围本标准规定了用环介导等温扩增CLAMP)快速检测苹果轮纹病菌的测定方法。本标准适用于苹果叶片、枝条和果实中苹果轮纹病菌的快速检测。方法检出限1O-7ng/J L苹果轮纹病菌DNAo2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的号|用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的号|用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测3 原理3. 1 扩增原理根据苹果轮纹病菌的ITS序列中特异性序列设计特异性内、夕|、引物及环引物各一对，特异性序列参见附录A。三对号|物特异性识别靶标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在ITS基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物，加入显色液即可通过颜色变化观察判定结果。3. 2 显色液显色原理SYBR Green 1是一种高灵敏度的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的800.l 000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色:当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。4 缩回各语下列缩回各i吾适用于本文件OLAMP:环介导等温扩增Cloop-mediatedisothermal amplification) DNA:脱氧核糖核酸Cdeoxyribonucleicacid) ITS:内转录间隔区CInternaltranscribed spacer) 2 X Lamp Master Mix:等温扩增PCR混合液Bst酶:stDNA聚合酶CBstDNA polymerase) 5 试剂和材料DB37/T 4101-2020 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯:实验用水为GB/T6682中规定的一级水。5. 1 等温扩增PCR混合液(2X Lamp PCR Master Mix勺:包含40mmol/L Tris-HCl、20mmol/L (NH.j) SOj、20 mmol/L KC1 (pH 值为8.8)、16mmo l/L MgSO.j、2.0 mmol/L dNTPs、O.2 % Trion X-100。5.2 Bst DNA聚合酶:酶浓度8U/L 5. 3 显色液SYBRGreen 1荧光染料，1 OOOX 0 5.4 引物:根据苹果轮纹病菌ITS基因序列设计一套特异性引物，包括夕问|物1(F3) ，外引物2(B3) , 内引物1CFIP) ，内引物2(BIP) ，环引物1CLF)和环引物2(LB)。外引物扩增片段长度189bp, 引物序列见附录Ao5.5 DNA快速提取液:DNA-EZReageIIts All-DNA-Fast-Outu0 5.6 甜菜碱5mol/L。5. 7 离心管0.1mL、1.5 mL。5.8 塑料研磨棒:长度70mm，研磨头外径6.2mm，研磨头长度9.5 mmo 6 仪器设备。1恒温箱:满足65oC:!:3 oC、80oC:!: 1 oC要求。6. 2 移液器:量程O.5L10L，量程1011 L 100 11 L，量程100Ll000 11 L 7 测定步骤7. 1 试验设置7. 1. 1 阴性对照:采用不含有目标基因序列的苹果腐烂病菌CVal sa mali)基因组DNA为模板。7.1.2 阳性对照:采用含有目标基因序列的苹果轮纹病菌CBotryosphaeriadothidea)基因组DNA为模板，浓度应略高于方法检出限。7.1.3 空白对照:以水代替DNA模板。7. 2 试样采集进行田间轮纹病菌快速检测时，切取约0.5cmXO. 5 cm待检测的苹果组织(果实、叶片、枝条), 放置于1.5 mL离心管中保存并标记。7. 3 试样DNAt 7.3. 1 将100LDNA快速提取液加入到盛有试样自1.5 mT，离心管中，用研磨棒研磨5mi日。7.3.2 80 oC:!:l oC加热5min，如果是难以破裂的细胞和材料，则保温时间可以延长到10min30 mino 7.3.3 用于振荡混匀后取裂解物直接进行LAMP反应。7.4 LAMP反应步骤7.4.1 反应体系1) 由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品D2) 由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，给出这一信息是为了万便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2 DB37/T 4101-2020 LAMP反应体系见表1。每个试样各做2个平行管。加样时应使试样DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴于反应管的管盖内侧，盖管盖时应尽量小心，防止显色液混合进入反应液中。这样试样扩增反应后不必开盖即可观察颜色变化。表1LAMP反应体系组分工作液浓度加样量反应体系最终浓度外号|物1(F3) 10口mol/Lo. 5 II L O. 2口mol/L外号|物2(B3) 10口mol/LO. 5L O. 2口mol/L内引物1(FIP) 10口mol/L2L 0.8口mol/L内引物2(BIP) 10 II mol/L 2L 0.8mol/L 环寻|物1(LF) 10口mol/L1L 0.4口mol/L环寻|物2(LB) 10口mol/L1L 0.4口mol/LLamp PCR Master Mix 2X 12.5L 1X Bst DNA聚合酶8 U/ II L O. 5L O. 16 U/L 甜菜碱5 mol/L 4L 0.8 mmol/L DNA模板1L 水补足至25.0 L 7.4.2 反应过程65 oc士30C恒温扩增60mi口，800C士1oC持续10min使酶灭活，反应结束。7.4.3 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在正常光照条件下于黑色背景(如黑布、黑色纸板)下进行颜色观察。阴性对照:反应管中液体呈橙色。阳性对照:反应管中液体呈绿色。空白对照:反应管中液体呈橙色。7. 5 防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施，主荷合GB/T27403中附录D规定。8 结果判定8. 1 待测样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性，不携带苹果轮纹病菌。8. 2 待测样品2个平行样反应管中液体至少一管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阳性，携带苹果轮纹病菌。8. 3 若与上述条件不符，则本次检查结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。3 附录A(资料性附录)苹果轮纹病菌ITS基因特异性序列A. 1 丰果轮纹病菌ITS基因特异性序列Caccessionno. MN559436. 1) 1 ATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAAGC 61 TCTGCTTGGTATTGGGCACCGTCCTTTGCGGGCGCGCCTCAAAGACCTCGGCGGTGGCGT 121CTTGCCTCAAGCGTAGTAGAACATACATCTCGCTTCGGAGCGCAGGGCGTCGCCCGCCGG 181 ACGAACCTTCTGAACTTTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC 注:下JU线所示部分为引物扩增匹配区段。A. 2 组成引物中碱基构成外引物1(町，5 -3) TGCCTGTTCGAGCGTCAT 外引物2(B3, 5 -3) TCCGAGGTCAACCTTGAGAA F1c F2 内寻|物1(FIP, 5 -3 ) : ACCGCCGAGGTCTTTGAGGTACAACCCTCAAGCTCTGCT B1c B2 内引物2(BIP, 5 -3 ) : GCGTCTTGCCTCAAGCGTAGTGTTCAGAAGGTTCGTCCGG 环引物1(町，5 -3) GGACGGTGCCCAATACCA 环引物2(LB, 5 -3) AGAACATACATCTCGCTTCGGAG DB37/T 4101-2020 4