DB15∕T 2504-2022 羊胃肠道线虫耐驱虫药的测定——粪便虫卵减少试验.pdf

ICS 65.020.30 CCS B41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 25042022 羊胃肠道线虫耐驱虫药的测定粪便虫卵减少试验 Test method of anthelmintic resistance in gastrointestinal nematodes of sheep and goat（faecal egg count reduction test） 2022-01-25 发布 2022-02-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 25042022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 本文件由内蒙古畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、中华人民共和国呼和浩特海关、内蒙古大学、内蒙古农业大学、鄂尔多斯市农牧技术推广中心、阿拉善盟畜牧兽医技术推广中心、新巴尔虎右旗动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：罗晓平、李军燕、陈林军、张兴夫、王瑞、李健、特日格勒、乌云塔娜、张晓东、郭少平、高娃、耿万恒、杨晓野、赵世华、侯勇跃。 DB15/T 25042022 1 羊胃肠道线虫耐驱虫药的测定-粪便虫卵减少试验 1 范围 本文件规定了临床检测和评价羊胃肠道线虫对驱虫药耐药性的粪便虫卵减少试验。 本文件适用于临床检测和评价不同饲养条件下羊胃肠道线虫对驱虫药的耐药性。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 19526 羊寄生虫病防治技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 胃肠道线虫 gastrointestinal nematode 寄生于羊胃肠道内的线虫。 驱虫药 anthelmintics 用于防治羊胃肠道寄生线虫感染所使用的化学制剂或药物。 敏感 sensitivity 寄生虫种群对某一驱虫药物的耐受量低于常规剂量。 中介 intermediary 寄生虫种群中部分群体对某一驱虫药物的耐受量超过了常规剂量。 耐药 resistance 寄生虫种群对某一驱虫药物的耐受量超过了常规剂量，且可以遗传。 DB15/T 25042022 2 粪便虫卵减少试验 faecal egg count reduction test 通过检测用药前后动物粪便中寄生虫虫卵数来评价胃肠道线虫对某一驱虫药耐药性的试验。 克粪便虫卵数 eggs per gram of feces（EPG） 1 g粪便中某种寄生虫虫卵的数目，是用来表示感染强度的指标。 4 粪便虫卵减少试验 原理 通过粪便虫卵减少试验，依据羊驱虫前后粪便胃肠道线虫虫卵减少率，结合统计学中95 %置信域综合评价虫体耐药性。 试验动物及分组 4.2.1 试验动物 8周内未驱虫且EPG不小于300的羊只。 4.2.2 试验分组 依据粪便虫卵数或者随机将试验动物分成对照组和不同药物试验组，每组15只羊。 试验药品 4.3.1 应使用经国家批准上市的药物。 4.3.2 该方法适用于所有类型驱虫药。 试验方法 4.4.1 在同等条件下饲养试验动物，试验组羊按驱虫药说明书用药，对照组羊不用药，具体操作依据GB/T 19526 相应部分的规定执行。 4.4.2 通过直肠采集对照组和试验组羊的粪便样本，每只羊 5 g 左右。 4.4.3 对照组和试验组羊第一次粪便样本采集时间为用药 0 小时。单一类型驱虫药耐药性检测时，第二次粪便样本采集时间针对不同药物有所差异按照附录 A 的规定。对多种类型驱虫药同时进行耐药性检测时，第二次粪便样本采集应在用药 7 d 后。 4.4.4 对照羊寄生线虫虫卵特征图谱见附录 E，通过稀释虫卵计数法按照附录 B 的规定或改良麦克马斯特虫卵计数法按照附录 C 的规定计数驱虫前后 EPG。 5 数据统计 采用EXCEL整理数据， 利用内嵌公式统计试验组和对照组用驱虫药前后EPG的算数平均数、 粪便虫卵减少率；统计分析确定95 %的置信域，统计方法按照附录D的规定。 DB15/T 25042022 3 6 羊胃肠道线虫耐药性评价指标 敏感 试验组粪便虫卵减少率大于95 %且95 %的置信域下限大于90 %。 中介 以下两种情况视为羊胃肠道线虫对驱虫药存在疑似耐药，即中介。 6.2.1 试验组粪便虫卵减少率小于 95 %且 95 %的置信域下限大于 90 %。 6.2.2 试验组粪便虫卵减少率大于 95 %且 95 %的置信域下限小于 90 %。 耐药 试验组粪便虫卵减少率小于95 %且95 %的置信域下限小于90 %。 DB15/T 25042022 4 A A 附录A （规范性） 不同类驱虫药第二次采样时间 常用驱虫药类型及耐药性检测中第二次采样时间见表A.1。 表A.1 常用驱虫药类型及耐药性检测中第二次采样时间 驱虫药类型 有效成份 剂量 第二次采样时间 咪唑并噻唑类 盐酸左旋咪唑 7.5 mg/kg；内服 3 d 7 d 苯并咪唑类 阿苯达唑 10-15 mg/kg；内服 8 d 10 d 大环内酯类 伊维菌素 0.2 mg/kg；皮下注射 10 d 14 d 水杨酸类 氯氰碘柳胺钠 5-10 mg/kg；皮下或肌肉 3 d 7 d DB15/T 25042022 5 B B 附录B （规范性） 稀释虫卵计数法 B.1 实验设备、耗材及试剂 普通光学显微镜、移液器、天平、烧杯、镊子、量筒、凹玻片、盖玻片、40目筛网、吸管、电磁炉、蔗糖、甲醛、纯净水。 B.2 饱和蔗糖水配置 向沸水中加入蔗糖颗粒并不断搅拌，直至不再溶解。冷却后，加入适量石炭酸以阻止霉菌生长。 B.3 粪便稀释液配置 取2 mL甲醛溶于98 mL纯净水中。 B.4 实验方法 B.4.1 样本处理 取新鲜粪便样品2 g于100 mL烧杯中，加入30 mL纯净水（按1 g粪便加入15 mL纯净水计），用镊子将粪便压碎、充分搅拌均匀，40目筛网过滤，将滤液搅拌混匀后，用移液器立即吸取中心处的液体0.3 mL与等体积饱和蔗糖水混匀于凹玻片中，同时加盖盖玻片，做两个重复。 B.4.2 观察 静置15 min后，通过显微镜计数两个室内的虫卵（注意计数位于暗区边缘的虫卵），并记录。 B.4.3 统计 将两个计数室的虫卵数取平均值，乘以100，可得到EPG。 DB15/T 25042022 6 C C 附录C （规范性） 改良麦克马斯特虫卵计数法 C.1 实验设备、耗材及试剂： 普通光学显微镜、麦克马斯特虫卵计数板、天平、烧杯、镊子、量筒、40目筛网、吸管、热水壶、食用盐、纯净水。 C.2 饱和盐水配置 取400 g食用盐溶于1000 mL煮沸的纯净水中，充分搅拌，冷却后使用。 C.3 实验方法： C.3.1 样本处理： 取新鲜粪便样品2 g于100 mL烧杯中，加入58 mL饱和食盐水并用镊子将粪便压碎、搅拌均匀，用40目筛网过滤，将滤液搅拌混匀后，用吸管立即吸取中心处的液体于麦克马斯特虫卵计数板的计数室内。 C.3.2 观察： 静置2 min后，通过显微镜计数两个计数室内的虫卵，并记录。 C.3.3 统计： 将两个计数室的虫卵数取平均值，乘以200，可得到EPG。 DB15/T 25042022 7 D D 附录D （规范性） 数据统计分析方法 D.1 采用下式计算试验组驱虫后粪便虫卵减少率 %（D.1） 式中： FECRR 试验组驱虫后粪便虫卵减少率； tX 试验组驱虫后克粪便平均虫卵数； cX 对照组试验后克粪便平均虫卵数。 D.2 采用下式计算驱虫后各组克粪便虫卵数的方差（算术级别） （D.2） 式中： Si2 驱虫后对照组或试验组克粪便虫卵数方差（算术级别）； j 组内每一只羊； Xij 对照组或试验组驱虫后，组内每只羊的克粪便虫卵数（EPG）； ni 试验组或对照组组内动物数。 D.3 采用下式计算各试验组驱虫后克粪便平均虫卵数减少的方差（对数级别） （D.3） 式中： Y2 试验组驱虫后克粪便平均虫卵数减少的方差（对数级别） ； nt 各试验组组内试验动物数； nc 对照组组内动物数。 D.4 采用下式计算各试验组粪便虫卵减少率 95%置信域上限、下限。 （D.4） 式中： tX 试验组驱虫后克粪便平均虫卵数； cX 对照组试验后克粪便平均虫卵数； Y2 试验组驱虫后克粪便平均虫卵数减少的方差（对数级别）。 )/(1 100FECRRctXX=) 1/(/)(S222i=iiijjijjnnXX)/()/(22222ccctttXnSXnSY+=DB15/T 25042022 8 E E 附录E （资料性） 羊常见胃肠道线虫虫卵特征 羊常见胃肠道线虫虫卵特征见表E.1。 表E.1 羊常见胃肠道线虫虫卵特征 虫种名称 寄生 部位 虫体大小 (mm) 虫卵图谱 形态描述 长径 (m) 辐径 (m) 绵羊毛首线虫 Trichuris ovis 盲肠 50.080.0 35.070.0 虫卵腰鼓形， 黄褐色，两端具塞。 7080 3040 奥利春细颈线虫 Nematodirus oiratianus 小肠 9.012.0 12.016.0 虫卵很大， 卵内细胞色黑较大。 255272 119153 蒙古马歇尔线虫 Marshallagia mongolica 皱胃 10.714.0 12.316.8 虫卵很大， 卵细胞色较淡、 较小且密集。 182217 83115 捻转血矛线虫 Hcemonchus contortus 皱胃 18.022.0 18.030.0 虫卵椭圆形， 卵壳略带黄色。 6695 4346 环纹奥斯特线虫 Ostertagia circumcincta 皱胃 7.512.0 10.312.8 虫卵椭圆形， 系典型的圆线虫类虫卵。 8995 4659 DB15/T 25042022 9 表E.1 羊常见胃肠道线虫虫卵特征（续） 虫种名称 寄生 部位 虫体大小 (mm) 虫卵图谱 形态描述 长径 (m) 辐径 (m) 叶氏古柏线虫 Cooperia erschovi 皱胃 小肠 胰脏 4.711.1 8.811.4 虫卵椭圆形。 6773 2241 蛇形毛圆线虫 Trichostrongylus colubriformis 小肠 4.55.0 5.06.0 虫卵椭圆形。 7376 4043 羊仰口线虫 Bunostomum trigonocephalum 小肠 12.017.0 19.026.0 虫卵两端钝圆， 两侧平直， 胚细胞大而数少， 内含暗色颗粒。 8297 4757 哥伦比亚食道口线虫 Oesophagostomum columbianum 结肠 12.013.5 16.718.6 虫卵椭圆形， 刚排出时内含卵裂细胞 8-16 个。 6575 4045 绵羊夏伯特线虫 Chabertia ovina 大肠 17.020.0 24.027.0 虫卵椭圆形。 85130 4256 乳突类圆线虫 Strongyloides papillosus 小肠 4.45.9 虫卵椭圆形，较小。 4260 2536