DB44∕T 868-2011 灵芝（赤芝）菌种(广东省).pdf

ICS. 65.020. 99 B 39 备案号31332-2011DB44 广东省地方标准DB44/T 868一20门灵芝(赤芝菌种Pure culture of Ganoderma /ucidum (Leyss. ex Fr.) Karst 2011-04-11发布2011-07-15实施广东省质量技术监督局发布DB44/T 868-2011 目IJ 1=1 本标准编制依据GB厅1.1-2009(标准化工作导则第一部分:标准的结构和编写规则起草。本标准的附录A、附录B和附录C均为资料性附录。本标准由广东省食用菌行业协会提出。本标准由广东省质量技术监督局归口。本标准起草单位:广东省食用菌行业协会、广东省微生物研究所、广东粤微食用菌技术有限公司。本标准起草人:杨小兵、吴清平、朱少琼、胡惠萍、李森柱、理世煌、张一帆、黄龙花、邵满超、周洁莹。本标准为首次发布。0844/T 868-20门灵芝(赤芝)菌种1 范围本标准规定了灵芝(赤芝)Gnoderma /ucidum (Leyss. ex Fr.) Karst菌种的相关术语和定义、质量要求、试验方法、检验规则及标签、标志、包装、运输贮存的要求。本标准适用于灵芝(赤芝)固体菌种。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。GB/T 191 包装储运图示标志CGB厅191，ISO 780:1997, MOO) GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T 12728 食用菌术语NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程3 术语和定义GB/T 12728界定的术语和定义适用于本标准。4 质量要求4. 1 母种4. 1. 1 容器规格按NY/T528中相关规定执行。4. 1. 2 感官要求应符合表l的规定。表1母种感官要求项目要求容器完整，无损，无色透明棉塞或硅胶塞干燥、洁净、松紧适度，能满足透气和泌菌要求培养基灌入量试管总容积的五分之一至四分之一斜面长度顶端距棉塞或硅胶塞40mm、-50mm接种块大小(接种量)(3 mm5 mm)X(3 mm5 mm) 菌丝量长满斜面菌种外观菌丝白色、浓密、短绒状，气生菌丝有但不茂盛。在接种块附近的菌丝有时菌丝体特征呈浅黄色。DB44/ T 868-2011 项目菌丝体表面菌种外观菌丝分泌物菌落边缘杂菌菌落斜面背面外观气味4. 1. 3 微生物学要求应符合表2的规定项目菌丝生长状态细菌、霉菌等杂菌4.1 . 4 菌丝生长速度表1(续)要求均匀、平展、无角变、无高温抑制线部分品种会产生少许浅黄色分泌物整齐无培养基不干缩，颜色均匀、无暗斑、无色素有灵芝菌种特有清香味，无酸、臭、霉等异味表2母种微生物学要求要求浓密、丰满、旺健，长速正常、整齐，菌丝有较多锁状联合。不得检出在CPDA(综合马铃薯葡萄糖琼脂)培养基(见附录A.1.2)上，在避光、适温(25C i: 1 C)条件下，菌丝长速为8.2mmldi: l.l mmld，菌丝长满斜面的时间为8dIO d。4. 1. 5 母种栽培性状供种单位所供母种需经出菇试验确认农艺性状和商品性状等种性合格后，方可用于扩大繁殖或出售。产量性状在正常条件下，以采用附录B中提供的栽培培养基为例，总生物学效率应不低于10%。4.1.6 母种真实性测定供试菌株基因组的rTS(内部转录间隔区)序列与参照菌株的ITS序列(Genbank登录号:GU213485 ) 进行比对，相似性应达98%亘足以t。4. 2 原种4. 2.1 容器规格按NY厅528中相关规定执行。4.2.2 感官要求应符合表3的规定。表3原种感官要求项目要求容器完整，无损棉寨或无棉塞塑料盖干燥、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌要求培养基上表面距瓶(袋)口距离50mm土5mm接种量(每支母种接原种数，接种物大小)4瓶(袋)6瓶(袋).主(12mm X 15 mm) 2 项目菌丝量菌丝体特征培养物表面菌丝体菌种外观培养基及菌丝体培养物表面分泌物杂菌菌落拮抗现象子实体原基气味4. 2. 3 微生物学要求应符合表2的规定。4.2. 4 菌丝生长速度OB44月868-2011表3(续)要求长满培养料菌丝白色、浓密、短绒状均匀、平展、无角变、无高温抑制线、均匀紧贴于物料颗粒表面紧贴瓶(袋)壁、无干缩无无无无有灵芝菌种特有清香味，无酸、臭、霉等异味在适直培养基上、适直培养容器里(以附录A.2.1为配方、使用13cmX26 cm聚丙烯塑料菌种袋、装量每袋200g干料为伊0，在避光、适温(25.C:t 1 .C)条件下，菌丝长速为8.0mmJd士0.8mmJd，菌丝长满容器的时间为16d22 d。4. 3 栽培种4. 3. 1 窑器规格按NYIT528中相关规定执行。4. 3. 2 感官要求应符合表4的规定。表4栽培种感官要求项目要求容器完整，无损棉塞或无棉塞塑料盖干燥、沽净.松紧适度，满足透气和滤菌要求培养基上表面Ji!瓶(袋)口 的距离50 Illm 士5mm 接种量每瓶(袋)原种接栽培种数30瓶(袋)50.i/i: (袋)菌丝量长满培乔料菌丝体特征茵丝白色、浓密、短绒状不同部位菌丝体生长齐整，色泽一致，无角变，无高温抑制线菌种外观培养基及菌丝体紧贴瓶(袋)壁、无干缩培养物表面分泌物无杂茵茵落无拮抗现象无子实体原基在瓶(袋)口附近允许有小块原基出现气味有灵芝菌种特有清香味，无酸、臭、霉等异味3 0844/1 868-2011 4.3.3 微生物学要求应符合表2的规定。4. 3. 4 菌丝生长速度在适宣培养基上、适直培养容器里(以附录A.2.3为配方、使用17cmX34 cm聚丙烯塑料菌种袋、装量每袋400g干料为例)，在避光、适温(25.C士1.C)条件下，菌丝长速为6.7mrn/d:!:O.8 mmld，菌丝长满容器的时间为27d33 d。5 实验方法5. 1 感官检验按表5逐项进行检验项目容器硅胶塞、无棉塑料盖母种培养基灌入量母种斜面长度母种斜面背面外观二5. 2 微生物学检验5. 2. 1 菌丝生长状态检验表5感官要求检验方法检验方法检验项目肉眼观察接种量母种、原种栽培种肉眼观察培养基上表面距瓶(袋)口的距离肉眼观察菌种外观各项(杂菌菌落除外)测量杂菌菌落肉眼观察气味检验方法院眼观察、测检查生产记录测肉眼观察肉眼?观察，必要时用5X放大镜观察鼻嗅用放大倍数不低于400倍的光学显微镜对培养物的水封片进行观察，每一检样应观察不少于50个视野。5.2.2 细菌检验取少量疑有细菌污染的培养物或菌块，按无菌操作接种于GB/T4789.28中规定的细菌培养液中，36 .C38 .C避光震荡培养1d，观察培养液是否混浊。培养液混浊，为有细菌污染;培养液澄清，为无细菌污染。必要时在光学显微镜下观察确认。5.2. 3 霉菌检验取少量疑有霉菌污染的培养物或菌块，按无菌操作接种于PDA培养基(见附录A中A.l.l)中，25 .C 28 .C避光培养3d.4 d，出现白色以外色泽的菌落或非灵芝菌丝形态菌落的，或出现异味者为霉菌污染物。必要时在光学显微镜下观察确认。5. 3 菌丝生长速度4 0844/T 868-2011 5.3. 1 母种菌丝生长速度测试方法参考附录A中A.l的配方，可任选其一，25 C:t 1 C避光培养，以划线记录法每隔24h在容器表面记录菌丝前沿位置，换算出菌丝生长速度。记录菌丝长满培养基表面所需天数(d)。5. 3. 2 原种和栽培种菌丝生长速度测试方法参考附录A中A.2的配方，可任选其25C:t 1 c避光培养，以划线记录法每隔24h在容器表面记录菌丝前沿位置，换算出菌丝生长速度。记录菌丝长满培养料所需天数(d)。5. 4 ITS序列分析方法按照附录C进行操作。5. 5 母种农艺性状和商晶性状测试方法将被检母种制成原种，再制成栽培种。参考附录B规定的培养基配方，采用熟料袋栽栽培方法，制作三组(每组平均不少于50袋)合共不少于150袋菇包，菇包大小按NY/T528相关规定执行。 三组在同一菇房内进行栽培。接种后进行符合灵芝生长条件的常规管理。在首潮灵芝子实体成熟后，每组至少采摘30个子实体测定生物学效率。根据表6所列项目，做好栽培记录，统计检验结果。同时将该母种的出发菌株设为对照，做同样处理。对比二者的检验结果，以时间计的检验项目间较对照菌株推迟5d以上(含5d)者，为不合格:产量显著低于对照菌株者，为不合格:子实体外观形态、色泽、质地与对照明显不同或子实体大量畸形者，为不合格。表6母神农艺性状和商品性状检验记录表检验项目检验结果检验项目检验结果母科长满所需时间(d)原种长满所需时间(d)菌丝长满培养基料面所需时间(d)总生物学效率(0/0)出第一潮菇所需时间(d)色泽、质地第一潮菇生物学放卒(0/0)芝形平均单产(g!袋)芝盖尺寸(mm)5.6 留样各级菌种都要留样备查，留样的数量应每个批号菌种3支(瓶、袋)5支(瓶、袋)，于避光、4C6C下储存，储存期母种为3个月，原种为2个月，栽培种为1个月n6 检验规则6.1 抽样抽样应具有代表性。母种按来源、品种、培养条件、接种时间分批编号，原种、栽培种按菌种来源、制种方法和接种时间分批编号。按批随机抽取被检样品。母种、原种、栽培种的抽样量至少分别为该批菌种量的10%、5%、1%。但每批抽样数量不得少于10支(瓶、袋);若-级抽样超过100支(瓶、袋)的，可进行两级抽样。5 0844月868-20116. 2 判定规则按质量要求进行。检验项目全部符合质量要求时，为合格菌种，其中任何一项不符合要求，均为不合格菌种。质量指标不符合要求，允许菌种生产者申请复检一次，仍不符合要求，则判此批产品不合格。7 标签、标志、包装、运输、贮存7. 1 标签、标志7. 1. 1 产品标签每支(瓶、袋)菌种应贴(印)有清晰注明以下内容的标签:a) 产品名称(如:灵芝母种); b) 品种名称(如:赤芝02); c) 生产单位(如:以菌种厂)d) 接种日期(如xxxx年xx月以日接种)e) 执行标准。7.1.2 包装标签每箱(或其它包装单位)菌种必须贴有清晰注明以下要素的包装标签:a) 产品名称、品种名称:b) 厂名、厂址、联系电话:c) 出厂日期:d) 贮存期限、贮存条件:e) 规格数量:f) 执行标准。7.1.3 包装储运图示按GB厅191的相关规定，应注明以下图示标志za) 小心轻放标志:b) 防水、防潮、防冻标志:c) 防晒、防高温标志:d) 防止倒置标志:e) 防止重压标志。7.2 包装7.2. 1 母种包装采用洁净、干燥的木盒或有足够强度的纸盒，内填棉花、碎纸、泡沫塑料等缓冲物，附产品合格证和使用说明书。7.2.2 原种、栽培种包装OB44月868-2011外包装可采用洁净、干燥的塑料箱、编织袋或有足够强度的纸箱，箱内菌种之间用碎纸、报纸等具有缓冲作用的轻质材料填满。箱内附产品合格证和使用说明书。7. 3 运输7. 3. 1 不得与有毒品混装、混运。7.3.2 气温达30C或以上时，需用4C15 C冷藏车运输，运输时间不得超过7d。7. 3. 3 运输中必须有防震、防晒、防尘、防雨淋、防冻、防杂菌污染的措施。7.4 贮存7.4. 1 母种的贮存用于转管保藏的母种，在4C6 C避光保藏不超过6个月:母种至使用时，在4C6 C避光保藏不超过90d;至销售时，在4C6 C避光保藏不超过80do 7. 4. 2 原种的贮存原种应尽快使用，在温度不超过30C、清洁、干燥、通风(空气相对湿度50%70 %)、避光的室内存放不超过7d，在4C6 C下贮存时，贮存期不超过30d。7.4.3 栽培种的贮存栽培种应尽快使用，在温度不超过30C、清洁、干燥、通风(空气相对湿度50%70 %)、避光的室内存放不超过7d，在4C6 C下贮存时，贮存期不超过30d。7 OB44/T 868一2011附录A(资料性附录)灵芝母种、原种及栽培种常用培养基及其可选配方A.1 灵芝母种常用培养基及其可选配方A. 1. 1 POA培养基(1000mL) 马铃薯(去皮)200 g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000rnL, pH自然。A.1. 2 综合POA(CPOA)培养基(1000mL) 马铃薯(去皮)200 g，葡萄糖20g，磷酸二氢饵2g，硫酸续0.5g，琼脂20g，维生素Bl20阅，水1000rnL, pH自然。A. 2 灵芝原种和栽培种常用培养基及其可选配方A. 2. 1 颗粒培养基高粱80%、小米19%、轻质碳酸钙1%。高粱用水煮熟至掰开无白心，沥去多余水分:小米使用前浸泡12小时，沥去多余水分:高粱、小米和轻质碳酸钙三者混合拌匀，pH自然。A .2. 2 棉籽壳培养基棉籽壳80%、麦款19%、轻质碳酸钙1%。三者混合拌匀，加水至培养料含水 量达60%65 %, pH 自然。A.2.3 阔叶木杂木屑培养基阔叶木杂木屑78%、款皮20%、轻质碳酸钙2%。三者混合拌匀，加水至培养料含水量达60%65%, pH自然。8 OB44/T 868-2011 附录B(资料性附录)灵芝栽培常用培养基B. 1 阔叶木杂木屑培养基闹叶木杂木屑78%、敖皮20%、轻质碳酸钙2%。三者混合拌匀，加水至培养料含水量达60%65%, pH自然。9 DB44/T 868-2011 附录c(资料性附录)灵芝菌种ITS序列分析法C. 1 检测流程待测样品菌丝液体培养菌丝DNA提取PCR扩增序列测定比对分析结果判定C.2 材料与方法C. 2. 1 菌体培养待测菌种CYM液体培养基配方:蛋白陈2g，酵母膏2g，葡萄糖20g，硫酸镇(MgS04 7H20 ) 0.5 g，磷酸氢二饵(K2HP04)1 g，磷酸二氢饵(KH2P04)1 g，纯水1000mL, pH自然。培养基分装至三个500mL角瓶后灭菌，冷却，接种，置于25.C 130 r/rnin摇床培养至菌丝生长平台期。菌丝真空抽滤，无菌水洗涤，低温干燥，-20.C保存备用。C. 2. 2 DNA提取和纯化CT AB (Cetyl Ttimethyl Arnmonium Brornide)法:a) 2倍CTAB提取液在65.C在水浴锅中预热。b) 取适量(0.1g1 g)菌丝体置于研钵中，用已灭菌的石英沙或液氮中研磨，同时加入少量聚乙烯基口比咯皖酣(PVP)防氧化，将菌丝体充分研磨成粉末状。c) 样品转入1.5rnl离心管中，管内先加入600L2倍CTAB提取液在65.C水浴锅中预热(用少量提取液洗下研钵上残留的粉末样品，轻轻混匀，在65.C中水浴30rnin60 rnin，其间每隔10 rnin轻轻摇动。d) 冷却2rnin后，加入等体积(约600L)的酣/氯仿/异戊醇(25: 24 : 1) ，充分摇动混匀。e) 以约11000哩，离心10min，取上清液移入另一新1.5rnl离心管，重复步骤d)操作，用氯仿/异戊醇(24:1)再抽提离心一次。同时将2/3体积的异丙醇(或2倍体积的无水乙醇)预冷。两次抽提后的上清液转入新离心管，加入2/3体积的预冷异丙醇(或2倍体积的预冷无水乙醇), 再加入约1110体积的乙酸饷(约30L50L)，缓慢翻转混匀，沉淀DNA。g) 以约18000哩，离心15min，弃上泊液。70%酒精(400o漂洗沉淀2次(快速翻转振荡几分钟)，以约7000鸣，离心5rnin，弃上前液，沉淀用纸巾吸取剩余乙醇，自然晾干或低温烘干(电风筒吹干)。h) 加1倍TE缓冲液(Tris10 mmol/L + EDTA 1 mmol/L)溶解(约5000-20.C保存备用。C.2.3 PCR扩增采用真菌核糖体基因间隔区通用引物对ITSI11TS4CITS1: TCC GTA GGT GAA CCT GCG G; ITS4: TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)进行PCR扩增。反应体系PCRTaq rnix (2 X) 25L. DNA模板5悔，通用引物CIOM)各4L，以无菌双蒸水补足至总体积50L。反应条件:94.C预变性5min; 94.C lmin55.C 1 minn .c 1 rnin, 30个循环n.c10 min完成延伸。C.2.4 序列测定10 D844/T 868-2011 PCR扩增产物用1.0%琼脂糖电泳检测，在UVP凝胶成像系统下成像观察条带情况，并保存图像。PCR扩增产物回收纯化后，以PCR引物为测序引物，分别从正反链双向测序，该操作由生物公司完成。C.2.5 序列分析双向序列拼接后在GenBank上进行比对CBlast)，若发现序列与GenBank上己知序列方向相反，贝IJ应对序列进行反向互补处理后再比对，对获得的同源序列进行分析，待测菌种与GenBank上灵芝菌种序列相似性达98%以上时，则可判定待测菌与GenBank上该己知菌是同一个种。取赤芝(Gl-YW)为灵芝的参照种，其ITS序列登录号为GU213485，其碱基序列如下:TCGAGTTTTGACCGGGTTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCATGTGCACGCCCTGTTCATCCACTCT ACACCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCAGATTGCGAGGCACGCTCTTTACCGGGCTTGCGGAGCATA TCTGTGCCTGCGTTTATCACAAACTCTATAAAGTAACAGAATGTGTATTGCGATGTAACACATCTA TATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTAT TCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCTACAAGCTTTTGTGGTTTGTAGGC TTGGACTTGGAGGCTTGTCGGCCGTTATTGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCTTGGTTCCTTGC GGATCGGCTCTCGGTGTGATAATGTCTACGCCGTGACCGTGAAGCGTTTGGCGAGCTTCTAACCGT CTTATAAGACAGCTTTA 当待测菌的I口TS序列与赤芝(GlGanod彷erma1ucidi伽um1(Le叮ys岱s.ex Fr.) KarstJ菌种。11