DB43∕T 1826-2020 黄瓜抗病毒病抗性鉴定技术规程—侵染性克隆法(湖南省).pdf

ICS 65.020 816 湖DB43 南省地万标准DB43/T 1826-2020 黄瓜抗病毒病抗性鉴定技术规程-侵染性克隆法Rule for evaluation of cucumber resistance against viral diseases -viral infectious clone method 2020-08-25发布2020-11-25实施沽用薛Z毛旨芮王土w且主李雪辛苦王里走司发布DB43/T 1826-2020 目次前言.III I 范围2 圳范性才|用文件. 3 术语和定义. 4 试剂与材料.2 5 仪器与设备.36 抗病鉴定设计.3 7 接种毒源.3 8 病情调奇.4 9 抗病性评价.5 附录A(资料性附录)黄瓜绿斑驳花叫病毒病和烟草花叫病毒病病原7 I DB43/T 1826-2020 目IJ1=1 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容nJ能涉及专利。本文件的发布机构不屈担识别这些专利的责任。本标准由湖南省农业农村厅提出O本标准向湖南省农业标准化委员会归口O本标准起草单位:湖南省植物保护研究所、全国农业技术推广服务中心、广东省农业科学院植物保护研究所、湖南省蔬菜研究所、江苏省农业科学院植物保护研究所、宁波大学植物病毒学研究所、云南农业大学、东北农业大学、沈阳农业大学、怀化农业农村局。本标准主要起草人:刘勇、刘慧、张松怕、何自福、张德咏、程兆柿、热飞、李凡、汤亚飞、李正刚、程晓非、张战江、张宁、张卓、吴元华、彭静、币1-fj娥、李兴华。III DB43/T 1826-2020 黄瓜抗病毒病抗性鉴定技术规程一侵染性克隆法1 范围本标准规定了黄瓜抗病毒病抗性鉴定技术协!程侵染性克隆法的术语和主义、试剂与试材、仪器与设备、抗病鉴定设训、接种毒源、?市恬调查、抗病性评价等技术要求。本标准适用I葫芦科主要作物黄瓜(Cucumissativus L.)杂交种、白交系、群体以及野生资源和近缘种等抗黄瓜绿斑驳病毒病和烟草花叶病毒病的室内鉴定及抗性评价。2 规范性引用文件下列文件对于本文11的引用是必不可少的。凡是注日期的引用文刊，仅注日期的版本适用于本文刊。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。NY/T 1857. 7-2010 黄瓜主要病害抗病性鉴定技术规和第7部分:黄瓜抗黄瓜花叶病毒病鉴定技术规程3 术语和定义NY!T 1857. 7界远的以及下列术语和定义适用于本文件。3. 1 黄瓜绿斑驳花叶病毒Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV 黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒属于帚状病毒利(Virgaviridae)烟申花H十病毒属(岛归movirus), 怕毒粒子为杆状结构。可通过种子、水、土壤、机械和嫁接转播，主要侵染葫芦科作物，严重降低果实商品性。3. 2 烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus, TMV 黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒属于帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(岛bamovirus), 病毒粒子为杆状结构。可通过种子、水、土壤、机械和嫁接传播，TMV寄主范围广，侵染葫芦科作物，可降低葫芦科作物产量，降低果实商品性。3. 3 黄瓜绿斑驳花叶病毒病Cucumber green mottle mosaic virus disease 黄瓜绿斑驳J七叶病毒病是由黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染号|起的黄瓜病毒病害。黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染黄瓜，黄瓜叶片斑驳、畸形以及产生绿色突起或泡状，叶柄和果柄产生褐色坏死斑，果实表面产生浓绿色斑驳:病果果肉部分呈现白色或黄包水渍状、纤维化或产生空洞，昧古，从1(11失去商品性。3. 4 烟草花叶病毒病Tobacco mosaic virus disease 烟草花叶病毒病是由烟草花叶病毒引起的黄瓜病毒病害。烟草花叶病毒侵染黄瓜，黄瓜口十片产牛花叶、畸形，黄瓜着色不均匀或畸形，尚品性严重下降。D843/T 1826-2020 3. 5 农杆菌介导的CGMMV、TMV侵染性克隆Agrobacterium-mediated infectious cDNA clones of CGMMVorTMV 山黄瓜绿斑驳花叶病毒、炯草花叶病奇的侵染性cDNA克隆与农杆菌Ti质粒重组体形成的、对寄主植物具有高效侵染能力的农杆雨雨株，经体外转录传染寄主细胞后，能导致寄主植物发生原病原物的病害。3. 6 人工病罔disease nursery 在7巳明显自然由源十扰的地怪，通过人工接种的方法将目的病原物置于克此病害的士壤中或特定的环辑中，并创造适合病声:发生的环境条件，用l二寄主植物的抗病性鉴定，以便能准确地反映出寄主植物的抗病水平。4 试剂与试材4. 1 MS培养基MS干粉4.43g，庶糖30g，无离子水定容至1L，调节pH为5.8，于121C高原灭茵30 mi丑，4 C F保存备用。MSI古|体培养基添加琼脂粉9g。4. 2 YEP培养基肤蛋白陈10 g，酵母提取物10g，氧化铀5g，无高于水950mL，用5mol/L NaOH 1容液调pH7.0，定容至1L，于121C高压灭菌30min, 4 C f保存备用。YEP固体培养基添加琼脂粉9g。4. 3 抗生素母液4.3.1 100 mg/mL卡那毒素母液.500 mg卡那霉京放入.5mL无肖子水中，珞解后在超净台内注入5mL的一次性注射器中，好、于L径。，22m膜过滤j(菌，即为100mg/mL卡那霉素母液。分装到5个火菌的2mL离心管里，每管1mL, 青4C冰箱中，可保存一个月:豆豆-20C长期保存。4. 3. 2 50 mg/mL利福平母液250 mg利福平先用少量无水乙醇涡旋振荡以溶解，再用无离子水定容至5mL，然后在超净台内用一次性注射器和一次性O.22m滤膜过滤除菌，NI1自己成50mg/mL利福于母液。分装到5个反菌的2mL 离心管里，每管1mL，置20C可保存3个月。4. 4 接种液100mmol/L乙酌丁香酬母液98.1 mg乙酷丁香酣先溶于少量无水甲醉巾，再缓慢用无离子水定容至5mL，然后在超净台内用一次性注射器和一次性O.22um滤膜过滤除菌，即配成100mmol/L乙眈丁香酬母液，分装到5个灭菌的2mL离心管里，每管1mL。现用现配，置一20C保存仅l个月。4. 5 CGMMV、TMV侵染性克隆农杆茵茵株提取感染黄瓜绿斑驳花叶病毒的黄瓜样本基因组总RNA，利用随机六粟体才|物进行反转录为cDNA，采用该病毒的特异性引物和PCR方法，扩增出病毒基因组的cDNA全序列后，将扩增产物克隆至T-Vector2 DB43/T 1826-2020 巾，并对克|雀产物进行PCR筛选和序列测定:再利用限制性酶切的方法把病毒基因组今长cONA构建到改良型植物表达载体上，获得带有该病毒的侵染性克隆:最后通过常规的二亲交配将其侵染性克隆导入农杆南细胞巾。5 仪器与设备超净工作台、高压灭南锅、恒温培养箱、冰箱、超低温冰箱、恒温摇床、台式冷冻离心机、防虫日光温车、光照生长箱等。6 抗病鉴定设计6. 1 小区排列鉴定黄瓜材料随机排列政顺序排列，每份鉴定材料重复3次，每一重复10i味苗。6. 2 对照品种;(瓜品种汕头青瓜(Cucumis sativus cv. Shantouqinggua)为感病对照品种:大津科润蔬菜研究所选育的黄瓜品种津优409(Cucumis sativus cv. Jinyou N 0.409, )为抗病对照、品种。6. 3 种子消毒鉴定黄瓜种子经灭菌水浸泡4-6h，依次经70%酒精表面消毒30s、20%次氯酸铀溶液(含0.1%Twee口-20)浸泡15mi口，最后用灭菌水忡洗56次，即可催芽播种。6. 4 育苗消毒过的黄瓜种子，置于含泪湿滤纸的培养皿中，恒温培养柏在芽(29:1:1 OC)，萌发后播种于盲目盘。育南基质为草炭土和i石(2:1)，纤高温蒸汽灭菌(131oC, 3050 min)。在防虫H光温室里育凹，室内温度白天为28oC30 oC，仅晚为18oC20 oC，所有幼回应生长健壮、-致。当幼囚的第3片第4片真叶充分展开时，进行抗病性鉴定。7 接种毒jJJ、7. 1制备农杆菌接种体将陈存的CGMMV或TMV侵染性克隆农杆菌菌株接种手含卡那霉素100mg/L和利福平50mg/L的YEP固体培养基中，划线接种或均匀涂板，28 oC培养24h48 h，至菌落长好，其菌洛作为接种体。挑取单个商落于50mL YEP液体培养某(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)巾，28 oC、200 rpm震荡培养过夜，即得CGMMV侵染性克隆农杆菌的菌;母液。将南悬液于4oC下，4 000 rpm离心10mi口，随即用MS液体培养基(含乙酷丁香嗣100mol/L)悬浮沉淀，经分光光度l(00600)测定农杆菌菌;母液的浓度，并i周至00600为1.0作为接种液，置4oC 备用。7. 2 注射器侵润法接种按照6.2育苗的打法培育刊鉴定的黄瓜幼苗，采用注射器侵润法接种。当黄瓜幼苗K至第33 D843/T 1826-2020 片第4片真叶时，用无菌1mL 注射器，去掉针头，吸取1mL制备的农杆菌接丰111体，离叶片叶柄。.1 cm处缓慢压入黄瓜幼苗第3片豆豆第4片叶，直至整个叶片被侵润。接种后的黄瓜植株肯于防虫温室里，进行正常的肥水管理。8 病情调查8. 1 调查时间接种2周后观察1鉴定植株的发府在状，20 d30 d统计发病恬况、l算病情指数和评价!鉴定材料对CGMMVl内抗性。8. 2 病情级别划分接种植株的病情级别及其相对应的症状描述见表l。表1CGMMV引起黄瓜绿斑驳花叶病毒病的病情级别划分仙情级别症状描述O 无任何可见发病症状。心叶明脉或轻花叶。3 心叶及中部叶)1花叶、斑驳。5 多数叶片花叶、少数叶片畸形、产生泡状凸起，相物轻度矮化。7 重花叶，多数叶片产生浓绿泡状凸起或叶脉绿带、畸形、皱缩，柏株矮化。9 重花叫，叶片明显畸形，i业株严重矮化成死亡。表2TMV引起烟草花日十病毒病的病情级别划分病情级别?正状描述O 无任何可见发病症状。l 心叶轻花叶。3 心叶及中部叶片花叶。5 多数叶片花叶、少数叶片畸形，植物轻度矮化。7 主花叶，多数叶片畸形、皱捕，桓株矮化。9 重花叶，叶片明显畸形，植株严重矮化或死仁。8. 3 调查方法根据接种植株的病情级别及其相对应的症状描述，调查所有接种植株的发病情况，记载每一单株的病情级别，并计算每份鉴定材料的病情指数(DJ)，取二次重复病情指数的平均值。病情指数(DJ)按下列公式计算:工(sx n) DI= x 100. (川NxS 式中DI一一病言指数:4 DB43/T 1826-2020 z一一各病情级别代表数值与相对应的各病情级别怕株数乘积的总和:s 各病情级别的代表数值:n 各病情级别的植株数:N一一调查总植株数:S 最高病情级别的代表数值。9 抗病性评价9. 1 抗病性评价标准依据鸟在走材料3次重复的病情指数平均值确定其抗性水平，划分标准见表30表3黄瓜材料对黄瓜绿斑驳花叶病毒病和烟草花叶病毒病抗性的评价标准病情指数(DI)抗病卡:评价DI=O 免疫(I)ODI5 高抗I1igh1yresistRnt (IIR) 5Dl运20抗州Rcsistant(R) 20Dl运40耐州Tolcrancc(T) 40DI运100感病Susccptib1c(S) 9. 2 鉴定有效性判别当感州对照材料达到其相应感讷程度(DI注40)，亥t比次鉴定视为有效。9. 3 鉴定记载表格黄瓜材料抗黄瓜绿斑驳花叶病毒悄(表4)和烟草花叶拍毒祸(表5)鉴定结果记载表。表4年黄瓜材料抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病鉴定结果记载表病情级别(株数)重复黄瓜材料主li号4号称来说病级平均抗病性R号指数病指评价O级1级3级5级7级9级II III ;中1.鉴定地点:2.播种日期:3.接毒日期:4.调查日期:5 D843/T 1826-2020 表5年黄瓜材料抗烟草花叶病毒病鉴定结果记载表病情级别(株数)黄瓜材料编号名称来汹重复病级平均抗病性/x号指数病指评价O级1级3级5级7级9级II III 注1.鉴定地点:2.播种H期:l.接毒H期:4.调查H期:9. 4 鉴定材料处理鉴定完毕后，i守所有瓜曲集中焚烧。6 DB43/T 1826-2020 A. 1 学名和理化特性A. 1. 1 学名附录A(资料性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒病和烟草花叶病毒病病原黄瓜绿斑驳花叶病毒病的病属为黄瓜绿斑驳花叶病毒，烟草花叶病毒病的病原为烟草花口十病毒，属J二帚状病毒科CVirgaviridae)烟草花叶病毒属CTobamovirus)，病毒粒子为杆状结构，是一种正单链刚A植物病毒。A. 1.2 形态描述CGMMV具有典型的烟草花叶病毒属病毒的杆状形态，病毒粒子的大小约为18nmX 280-310 nm (图A.1)。TMV具有是的烟草花叶病毒届代表性病毒，病毒粒子为杆状，病毒粒子的大小约为18nmX 300-310 nm (国A.2)。图A.1 黄瓜绿斑驳花日十病毒粒子的 电镜照片(寻|自Kader-Jailaniet a1., 2017) 图A.2 烟草花日十病毒粒子的电镜照片叮|白Owenset a1., 2011) 7 D843/T 1826-2020 A. 1.3 基因组结构CGMMV为正单链RNA病毒，主主因组RNA大小为6.4kb，病毒基因组含;有4个ORFs:ORFl和OFR2编码复制酶蛋白(Replicationproteins, Reps), ORF3编码运动蛋白(Movementprotein, MP), ORF4编码衣壳蛋白(Coatprotein, CP)。复制酶蛋白白基因组5端ORFl和ORF2表达，1(11MP和CP以业基因组方式表达。TMV为正单链RNA病毒，基国组RNA大小为6395nt，病毒基因组含有4个ORFs:ORFl和OFR2编码复制酶蛋白(Replicationproteins, Reps), ORF3编码运动蛋白(Movementprotein, MP), ORF4编码衣壳蛋白(Coatprotein, CP)。复制酶蛋白白基因组5端ORFl和ORF2表达，而MP和CP以亚基因组力式表达。8