DB35∕T 1929-2020 鸭瘟抗体间接ELISA 试剂盒检测技术规范(福建省).pdf

I CS 11. 220 B 41 DB35 子吕建省由巳ET圃，、万标准DB35/T 1929-2020 鸭瘟抗体间接ELISA试剂盒检测技术规范Detection technical specification of indirect ELISA test kit for duck plague antibody 2020 -09 -29发布2020 -12 -29实施福建省市场监督管理局发布DB35/T 1929-2020 目次前言. 1 范围. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 规范性引用文件. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 疫病简述. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 原理. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 主要仪器. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 主要试剂. 7 试剂盒的组成、组装和保存.2 8 试剂盒的要求. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 样品的采集、保存与运输.4 10 试剂盒操作步骤.4 1 结果判定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 附录A(规范性附录)相关试剂的配制.6 参考文献.8 I 目IJ1=1 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由福建省农业科学院提出。本标准由福建省农业农村厅归口。DB35/T 1929-2020 本标准起草单位:福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建省动物疫病预防控制中心、福州市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人:陈珍、傅光华、刘道泉、刘荣昌、黄瑜、史惠、吴波平、陈翠腾、陈冬群、陈秀明、施少华、朱春华、刘斌琼、蔡国漳。II 鸭瘟抗体间接ELISA试剂盒检测技术规范1 范围本标准规定了鸭瘟抗体间接ELISA检测试剂盒的检测技术规范。本标准适用于鸭血清中鸭瘟抗体的定性检测。2 规范性亏|用文件DB35/T 1929-2020 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB!T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法3 疫病简述鸭瘟Cduckplague，DP)又称为鸭病毒性肠炎，俗称大头瘟是由鸭瘟病毒引起的一种急性、高度致死性传染病，不同日龄的鸭均易感染。特征病变为食道、小肠和泄殖腔粘膜出血、坏死、清房，病程稍长者食道和泄殖腔粘膜表面形成黄白色伪膜。该病传播迅速、发病率和死亡率高，广泛流行于我国华南、华中和华东地区。4 原理本标准是针对鸭瘟抗体间接ELISA试剂盒建立的检测技术规范。工作原理为:当鸭血清中鸭瘟抗体阳性时，在间接ELISA抗体反应过程中，鸭血清中的鸭瘟抗体先与包被的纯化鸭瘟病毒结合，形成抗原抗体复合物，随后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸭IgG相结合，加入显色剂显色，置450 nm波长下测定光密度值COD4S11) ，通过分析其p/M直判定鸭血清中鸭瘟病毒抗体的水平。5 主要仪器所使用的主要仪器如下:刮目每标仪(具有450nm波长滤光片)。b) 37 oc土1oc恒温箱。c) 96孔酶标板。cl) 振荡器。e) 可调微量移液器:包括多道00吐、100L、300L)和单道等。6 主要试剂所使用的主要试剂如下:DB35/T 1929-2020 a) 包被抗原:按照附录A中A.1配制。b) 标准阳性血清:按照附录A中A.2配制。c) 标准阴性血清:按照附录A中A.3配制。d) 参考品:阳性参考品(通过中和试验和本试剂盒检测均为阳性)20份，阴性参考品(通过中和试验和本试剂盒检测均为阴性)20份，每份参考品分装为每支15L装于无菌离心管中，做好标记，置于一70oc :1:.5 oc保存备用。e) 酶标二抗HRP标记的羊抗鸭IgGof) TMB显色液TMB含量为200g/mLg) 碳酸盐缓冲液:按照附录A中的A.4配制。h) 20XPBS溶液:按照附录A中的A.5配制。i) 稀释液:按照附录A中的A.6配制。j) 洗涤液:按照附录A中的A.7配制。k) 终止液:按照附录A中的A.8配制。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB!T6682-2008中一级水的要求。7 试剂盒的组成、组装和保存7. 1 试剂盒A的组成7. 1. 1 标准阴性血清，10 f.lL，清亮、无溶血。7. 1.2 标准阳性血洁，10 止，清亮、无溶血。7. 1.3 酶标二抗，10此，无色透明液体。7. 2 试剂盒B的组成7.2. 1 包被好的酶标板，3块，每个酶标板最大检测持检样品份数为90份。7. 2. 2 磷酸盐缓冲液(20XPBS), 100 mL，无色透明。7.2.3 TMB显色液，10 mL/瓶 X3瓶，无色透明，棕色瓶装，避光保存。7.2.4 终止液，40 mL，无色透明。7.2.5 吐温20，500此，无色透明。7.2.6 操作说明书，1份。7. 3 试剂盒的组装7.3. 1 本试剂盒由试剂盒A和试剂盒B组成。7. 3. 2 试剂盒外包装上应标明产品名称、包装规格、生产单位、生产批号、生产日期、有效期、产品标准编号、注册编号和保存条件。7. 3. 3 各组分均应贴上标签(内容包括:组分名称、生产日期、数量、保存条件)。7.4 试剂盒的保存试剂盒A于-20oC:1: 1 oC条件下保存，试剂盒B于2oC8 oC条件下保存。2 DB35/T 1929-2020 8 试剂盒的要求8. 1 物理检查8. 1. 1 外观:各组分外包装应完好、品名清晰。8.1.2 试剂盒:各组分应齐全、完整，液体无渗漏、澄清透明无沉淀。8. 2 阳性参考品的符合率按试剂盒操作说明书对阳性参考品进行检测，检测结果与阳性参考品的符合率不低于95%。8. 3 阴性参考品的符合率按试剂盒操作说明书对阴性参考品进行检测，检测结果与阴性参考品的符合率不低于95%。8.4 最低检测限按试剂盒操作说明书对不同稀释度的标准阳性血清进行ELISA检测时，最低检测限为1:3 2000 8.5 批内差按试剂盒操作说明书对阴阳性参考品进行检测，取10个不同试剂盒平行检测，计算检测结果的平均值M和标准差SD，根据式(1)计算变异系数CV，cv不宜高于10%。式中:cv 变异系数:SD一一测量结果的标准差1M 测量结果的平均值。8.6 批间差SD CV=E X 100%.(1) 取3个1ft次的试剂盒(每批次10个)，对阴阳性参考品进行检定，计算30次检测结果的平均值M和标准差SD，根据式(1)计算变异系数CV，结果不直高于10%。8. 7 有效期试剂盒的有效保存期为12个月。8.8 稳定性8.8.1 效期稳定性:取贮存条件下保存13个月的试剂盒，按8.28. 5方法进行检测，结果应符合8.2 8. 5的要求。8.8.2 稳定性试验:取贮存条件下保存3月、6月、9月和12月的试剂盒，按8.28. 5方法进行检测，结果应符合8.28. 5的要求。3 DB35/T 1929-2020 9 样品的采集、保存与运输9. 1 样品采集采集鸭翅静脉血0.5mL1.0mL，37 oC:!:l oC恒温箱静置1h后转入2oC8 oC条件下静置2h4 h.析出液体即为待检血洁。9. 2 样品保存置于20oC:!: 1 oC条件下贮存备用，使用前2h取出解冻，避免血清反复冻融。若分离的血清需当天使用，则放置2oC8 oC条件下备用。9.3 样品运输血清样品应在20oC:!:l oC条件下运输。10 试剂盒操作步骤10. 1 试剂均衡用前TMB显包液、终止液和磷酸盐缓冲液应取出室温均衡30mino 10.2 试剂自己市IJ从试剂盒B中取出20XPBS溶液、吐温-20.按照附录A中A.6和A.7配制1XPBS工作液和PBST工作液。10.3 加样从试剂盒B中取出酶标板，试剂盒A中取出标准阴性血洁和标准阳性血洁。待检血清标准阴性血洁和标准阳性血清用1XPBS按1:100倍稀释后加入酶标板中，每孔加入100旺，其中标准阴性血洁、标准阳性血清作两个重复孔，另设两个空白对照孔(每孔加入PBS100U 0 37 oC:!:l oC恒温箱反应1h。10.4 洗涤取出酶标板，每孔加入250LPBST洗涤液置于振荡器上振荡洗涤3次，每次3mino甩干液体。10.5 加酶标二抗从试剂盒B中取出酶标二抗，用PBS作1:3 333倍稀释后(取10mL PBS溶液加入3此酶标二抗).酶标板的每孔加入100此，于37oC:!: 1 oC恒温箱反应45min，取出后洗涤，洗涤方法同10.4010.6 显色洗涤后，每孔加入TMB显色液100L，37 oC士1oC恒温箱避光显色8min 10 min后取出。10.7 终止反应每孔加终止液100L终止反应，立即读数。10.8 读数将酶标板置酶标仪中，以450nm波长测量反应孔OD4，iO值。4 DB35/T 1929-2020 11 结果判定读出酶标板中各孔的ODl.O值之后，进行如下判定:a) 以酶标仪在4.50日m波长下测量样品孔OD值(OD15)，当阴性血洁的OD15值不超过O.22、阳性血洁的OD150值不低于1.0、空白孔OD15U值不超过0.08时试验成立。b) 按照式(2)计算持检血洁的t直:式中:t一-PjJ恒:5 样品孔O4501直:C一一空白于LOD450平均值八占一标准阴性血洁OD450平均值。s-C t =一一一一. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (2) N-C c) 待检血清t三2.1判为阳性，t 1. 9判为阴性1.9t2.1判为可疑，重检后t三1.9可判为阳性。5 DB35/T 1929-2020 A. 1 抗原的制备附录A(规范性附录)相关试剂的配制取DEF细胞培养的鸭瘟病毒液于4oC、8000 r/min离心30min，上请于4oC、45000 r/min离心2h, 弃上洁后沉淀用2mL灭菌PBS重悬，获病毒浓缩液，-70 oC士5oC下保存。抗原的纯化是通过庶糖梯度离心及超速离心力日以浓缩获得，方法如下:制备10%、20%、30%、40%和50%等五个梯度的庶糖平衡液，在10%庶糖液上铺病毒浓缩液，于4oC、40000r/min水平离心3h，收集30%40%病毒带，于4oC、45000r/min、离心2h，弃上清后沉淀用灭菌PBS重悬。测定其蛋白浓度，储于一70oC:!:5 oC条件下作为抗原备用。A. 2 标准阳性血清的制备将鸭瘟病毒浓缩液经甲自主灭活后，经检验灭活合格后与弗氏完全佐剂或不完全佐剂按1:1. 2乳化成免疫用的抗原。按制备高免血洁的常规方法免疫30日龄SPF麻鸭，首免鸭瘟病毒浓缩抗原军L化液1mL/只。14 d二免，2 mL/只(分三点注射)，二免后28天采血、分离血清，血清中和效价二三1:128，即作为鸭瘟病毒标准阳性血清。A. 3 标准阴性血清的制备购进SPF麻鸭胚，孵化至鸭苗出壳后于隔离器中饲养，至30日龄时采血、分离血洁，无血清中和作用(中和效价1:2)作为鸭瘟病毒标准阴性血洁。A.4 碳酸盐缓冲液0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)NaHC01 Na2CO 去高于水或蒸馆水A.5 20XPBS;窑液(pH7.4)NaCl KCl NaPOj.12H二。1. 46 g 0.97 g (或Na2COd2H201. 2 g) 500 mL 160.0 g 4.0 g 58.0 g KH二POj4.0 g 将上述试剂溶于800mL去离子水中，定容至1000 此C 1.034X105)Pa高压灭菌30min，室温保存备用。6 DB35/T 1929-2020 A.6 1 X PBS溶液(pH7.4)20XPBS溶液2.5 mL 菜馆水475 mL 搅拌混匀，室温保存备用。A. 7 洗涤液吐温20O. 25 mL 1 XPBS CpH7.4) 500 mL 将吐温20加入PBS溶液中充分摇匀，现配现用。A. 8 终止液浓硫酸11. 1 mL 蒸馆水388.9 mL 取蒸馆水388.9 mL.向其中加入浓硫酸11.1 mL.边加边搅拌混匀。7 DB35/T 1929-2020 8 参考文献1 GB/T 33411-2016 酶联免疫分析试剂盒通则2J SN/T 2744-2010 鸭病毒性肠炎检疫技术规范3J YY/T 1260-2015 戊型肝炎病毒IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫吸附法)4J YY/T 1517-2017 EB病毒衣壳抗原CVCA)IgA抗体检测试剂盒5J YY/T 1645-2019 人细小病毒B19IgG抗体检测试剂盒