病毒培养技术.ppt

病毒增殖技病毒增殖技术 1.动物增殖病毒技物增殖病毒技术禽胚增殖病毒技禽胚增殖病毒技术细胞增殖病毒技胞增殖病毒技术2.一、一、动物增殖病毒技物增殖病毒技术 选择动物的物的标准：准：大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、青壮年和健康(经临床检查、检疫)；对相应病毒易感，并十分敏感；经隔离饲养和观察检查证明健康；家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确，并符合普通级实验动物标准；体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。3.二、禽胚增殖病毒技二、禽胚增殖病毒技术（一）禽胚的（一）禽胚的选择 SPF鸡胚胚 据国家据国家标准，无准，无22种特定病原体种特定病原体 非免疫非免疫鸡胚胚 应无特定病原的母源抗体，无特定病原的母源抗体，普通普通鸡胚胚 可能可能带有有鸡的多种病原体，不适用于疫苗生的多种病原体，不适用于疫苗生产 异源性性疫苗：异源性性疫苗：鸭胚和胚和鸽胚胚4.（二）禽胚接种途径与收（二）禽胚接种途径与收获 绒毛尿囊膜接种法 尿囊腔接种法 卵黄囊接种法 羊膜腔接种法 静脉接种法 脑内接种法5.鸡胚胚绒毛尿囊膜接种法毛尿囊膜接种法 6.尿囊腔接尿囊腔接种法种法 7.尿囊液收尿囊液收获方法方法 8.鸡胚卵黄囊接种法胚卵黄囊接种法9.1种蛋种蛋质量量病原微生物：垂直传递，如白血病、脑脊髓炎、腺病毒、支原体及传染性贫血因子等。母源抗体：抗生素：立克次氏体和鹦鹉热衣原体 2孵化技孵化技术温度：3739.5。传染性支气管炎病毒37 湿度：鸡胚5357，水禽胚比鸡胚高510。通风：氧气，二氧化碳。翻蛋：（三）影响禽胚增殖病毒的因素（三）影响禽胚增殖病毒的因素10.3接种技接种技术 不同病毒的增殖有不同的接种途径，同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。接种日龄：鸡胚1314日龄。鸭胚1516日龄，尿囊液含 量最高，平均约68ml，羊水约12ml。接种部位：不应伤及胚体和血管，以免影响其发育严格防止禽胚污染 鸡胚接种时严格无菌操作；定期清扫消毒孵化室，保持室内空气新鲜；种蛋入孵前先用温水清洗，消毒，凉干。11.三、三、细胞增殖病毒技胞增殖病毒技术 1细胞培养的概念胞培养的概念 细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团悬液进行培养。细胞分胞分类：根据细胞染色体和繁殖特性 原代细胞(primary cell)细胞株(cell strain)传代细胞（continued cell line）细胞系(cell line)12.（1）原代）原代细胞胞(primary cell)指由新指由新鲜组织经剪碎和胰剪碎和胰酶消化制消化制备的的细胞，如胞，如CEF细胞。胞。（2）细胞株胞株(cell strain)又称二倍体又称二倍体细胞胞 指指自自继代代培培养养的的细胞胞中中选育育出出具具有有特特殊殊生生物物学学性性质和和标记的的细胞胞。这类细胞胞且且能能保保持持原原来来的的二二倍倍染染色色体体数数目目，能能连续传很很多多代代(50100代代)，但但为有有限限生生命命；没没有有肿瘤瘤原原。如如PKl5、BHK21和和Vero（3）传代代细胞（胞（continued cell line）细胞系胞系(cell line)能能在在体体外外无无限限传代代，应用用方方便便，其其染染色色体体数数目目及及增增殖殖特特性性均均类似于似于恶性性肿瘤瘤细胞，且多来源于癌胞，且多来源于癌细胞，如胞，如HeLa细胞系胞系 13.静置培养静置培养 转瓶培养瓶培养悬浮培养浮培养(suspension cell culture)微微载体培养体培养(microcarrier cell culture)中中 空空 纤 维 细 胞胞 培培 养养(hollow fibre cell culture)微囊化微囊化细胞培养胞培养2细胞培养方法胞培养方法14.悬浮培养浮培养 通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。微微载体培养体培养微载体直径应为60105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞吸附在表面，如DEAESephadexA-50、Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3等。微载体培养的容器为特制的生物反应器，有自动化装置。细胞产量达106107个/m1，每升培养液可加微载体25g，每克有80009000个珠子，培养面积约为25万cm2，比常规培养面积大1025倍。15.中空中空纤维细胞培养胞培养(hollow fibre cell culture)组成成:中空中空纤维生物反生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕器、培养基容器、供氧器和蠕动泵中中空空纤维由由乙乙酸酸纤维、聚聚氯乙乙烯丙丙烯复复合合物物或或多多聚聚碳碳酸酸硅硅等等材材料料制制成成，外外径径50100m，壁壁厚厚2575m，壁壁呈呈海海绵状状，上面有很多微孔。上面有很多微孔。中中空空纤维的的内内腔腔表表面面是是一一层半半透透性性的的超超滤膜膜，允允许营养养物物质和和代代谢废物物出出入入，而而对细胞胞和和大大分分子子物物质（如如单克克隆隆抗抗体体）有有滞滞留作用。留作用。培培养养液液能能有有效效地地分分布布，细胞胞培培养养维持持时间可可达达数数月月，保保持持高高度度活活性性，培培养养的的细胞胞密密度度大大，细胞胞分分泌泌的的蛋蛋白白质浓度度高高，纯度度可可达达6090；占用空；占用空间小，适于各小，适于各类细胞，但胞，但设备昂昂贵。16.培养液培养液血清血清细胞接种量胞接种量pH温度温度无菌条件无菌条件培养器皿清培养器皿清洁度度3.细胞培养要素胞培养要素RPMI-1640、199、DMEM、F12 17.血清血清成成分分：必必需需氨氨基基酸酸、促促进细胞胞生生长和和贴壁壁的的成成分分。-珠珠蛋蛋白白和和白白蛋蛋白白能能促促进细胞胞生生长；白白蛋蛋白白具具有有毒毒作作用用；糖糖蛋蛋白白、a2-球蛋白和球蛋白和脂蛋白脂蛋白G2能促能促进细胞胞贴壁。壁。血血清清选择：同同种种动物物优于于异异种种动物物血血清清；人人和和牛牛血血清清优于于马血清；血清；马血清血清优于兔血清和于兔血清和鸡血清。血清。血血清清使使用用：目目前前国国内内多多用用犊牛牛血血清清，使使用用前前须经56灭活活30min，并并进行行细胞胞毒毒性性试验。生生长液液血血清清含含量量一一般般为520。维持液中血清量持液中血清量为0%5。血血清清替替代代因因子子：激激素素和和生生长因因子子（如如胰胰岛素素、上上皮皮生生长因因子子）、结合合蛋蛋白白（如如转铁蛋蛋白白）、贴壁壁因因子子（如如鱼精精蛋蛋白白、聚聚赖氨氨酸酸）和和微微量量元元素素（如如硒硒）四四类几几十十种种，多多数数无无血血清清培养液培养液须补加加38种血清替代因子。种血清替代因子。18.细胞接种量胞接种量 细胞胞在在生生长过程程中中分分泌泌刺刺激激细胞胞分分裂裂的的物物质，若若细胞胞量量太太少少，这些物些物质分泌量少，而作用也小。分泌量少，而作用也小。接接种种细胞胞数数量量越越大大，细胞胞生生长为单层的的速速度度越越快快，但但细胞胞过多多对细胞生胞生长也不利。也不利。鸡胚成胚成纤维细胞胞为100万万m1小鼠或地鼠小鼠或地鼠肾细胞胞为50万万m1猴猴肾细胞量胞量为30万万ml传代代细胞胞为1030万万m119.(1)细菌菌污染染(2)真菌真菌污染：念珠菌或酵母菌。染：念珠菌或酵母菌。培养液中可培养液中可见黄白色小点状黄白色小点状悬浮物浮物 镜检时可可见菌菌丝结构。构。(3)支原体支原体污染：染：污染率染率为5060(4)病毒病毒污染染 组织带毒毒 培养液培养液带毒毒4细胞培养胞培养污染染问题20.（1）血清）血清：维持液内持液内犊牛血清含量一般不超牛血清含量一般不超过2。（2）温度：）温度：狂犬病病毒狂犬病病毒32，犬疱疹病毒，犬疱疹病毒36。（3）pH：（4）病毒接种）病毒接种剂量：量：应以以TCID50为依据依据 一般按一般按维持液的持液的110(VV)量接入。量接入。接种量小，接种量小，细胞不能完全胞不能完全发生感染，会影响毒价；生感染，会影响毒价；接种量接种量过大，会大，会产生大量无感染性缺陷病毒。生大量无感染性缺陷病毒。(5)病毒接种方法：病毒接种方法：异步接毒和同步接毒。异步接毒和同步接毒。5.细胞培养病毒要胞培养病毒要素素21.6.病毒增殖指病毒增殖指标与收与收获细胞病胞病变(CPE)：细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等；细胞聚合，如腺病毒；细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒；轻微病变，如正粘病毒、冠状病毒等。包涵体和血凝性：包涵体和血凝性：也可作为检查病毒增殖的指标。有些病毒不产生CPE。病毒收病毒收获：CPE达80时收获，反复冻融多次使病毒释放，然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20保存。病毒毒价病毒毒价：TCID50、中和试验、AGP效价、HA22.疫苗制造工疫苗制造工艺流程流程23.病毒性病毒性细胞疫苗制造工胞疫苗制造工艺流程流程 24.病毒性病毒性组织疫苗制造工疫苗制造工艺流程流程25.细菌疫苗和菌疫苗和类毒素制造工毒素制造工艺流程流程 26.寄生虫疫苗制寄生虫疫苗制备的工的工艺流程流程 27.28.5/7/202429.