蛋白质和氨基酸测定学时概述.ppt

蛋白质和氨基酸测定蛋白质和氨基酸测定思考题思考题、硫酸、硫酸铜及硫酸钾在消化中起了什么作用？样、硫酸、硫酸铜及硫酸钾在消化中起了什么作用？样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？2 2、甲醛法测定氨基酸的原理？、甲醛法测定氨基酸的原理？3 3、考马斯亮蓝比色法及、考马斯亮蓝比色法及LowryLowry比色法测定蛋白质的原理比色法测定蛋白质的原理？4 4、茚三酮比色法测定氨基酸的原理及影响因素？、茚三酮比色法测定氨基酸的原理及影响因素？1蛋白质含量低大头娃娃蛋白质含量低大头娃娃蛋白质含量蛋白质含量“高高”，肾结石，肾结石为何测定蛋白质为何测定蛋白质1 1、重要的营养物质、重要的营养物质 婴幼儿配方乳粉婴幼儿配方乳粉:蛋白质蛋白质18%18%；（GB10765-1997GB10765-1997）婴幼儿配方乳粉婴幼儿配方乳粉、:蛋白质蛋白质12-18%12-18%；（GB10766-GB10766-19971997）2椰椰子子汁汁中中蛋蛋白白加加热热沉沉淀淀黄黄酒酒贮贮藏藏中中的的沉沉淀淀大大部部分分为为蛋蛋白白质质2 2、影响食品色、香、味及结构、影响食品色、香、味及结构面筋蛋白：面包粉面筋蛋白：面包粉33%；蛋糕粉；蛋糕粉:22%馒馒头粉头粉25%-30%（SB/T-93）3第一节第一节 蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定 定量方法：凯氏定氮法及分光光度法。定量方法：凯氏定氮法及分光光度法。一、凯氏定氮法一、凯氏定氮法 奶粉中测得氮含量为奶粉中测得氮含量为2.12%,2.12%,蛋白质含氮为蛋白质含氮为16%16%，奶粉中蛋白质含量，奶粉中蛋白质含量?换算系数通常换算系数通常6.256.25，牛乳及制品为，牛乳及制品为6.386.38，大，大豆及制品为豆及制品为5.715.71等。等。4脱水性：将脱水性：将H H、O O按按2 2：1 1比例脱去，剩下比例脱去，剩下C C、N N氧化性：氧化性：2H2H2 2SOSO4 4+C +C 2SO2SO2 2+2H+2H2 2O+COO+CO2 2 3SO 3SO2 2+2N+3H+2N+3H2 2O=3SOO=3SO3 3 +2NH+2NH3 3H2SO4 酸性：酸性：H H2 2SOSO4 4+2NH+2NH3 3=(NH=(NH4 4)2 2SOSO4 4 丹麦化学家丹麦化学家Johan KjeldahlJohan Kjeldahl（18831883）发明的，当时只用）发明的，当时只用H H2 2SOSO4 4分解试分解试样，需长时间，后来样，需长时间，后来GunningGunning改进，在消化时加入改进，在消化时加入K K2 2SOSO4 4使沸点上升从而加快使沸点上升从而加快分解速度。后来分解速度。后来51 1、原理、原理 样品与硫酸、催化剂加热消化，蛋白质分解，样品与硫酸、催化剂加热消化，蛋白质分解，其中的其中的C C、H H氧化为氧化为COCO2 2和和H H2 2O O蒸汽逸出，而氮转化蒸汽逸出，而氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵，加碱蒸馏，使氨蒸为氨，与硫酸结合成硫酸铵，加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后以盐酸滴定。出，用硼酸吸收后以盐酸滴定。硫酸钾之目的：提高沸点，加快有机物分解；硫酸钾之目的：提高沸点，加快有机物分解；硫酸铜之目的：催化剂、消化终点的指示剂硫酸铜之目的：催化剂、消化终点的指示剂（CuSOCuSO4 4蓝蓝绿色如果没消化完全，则为绿色如果没消化完全，则为CuCu2 2SOSO4 4）、）、蒸馏前加入碱量合适否的指蒸馏前加入碱量合适否的指示剂。示剂。2CuSO2CuSO4 4+C=Cu+C=Cu2 2SOSO4 4+SO+SO2 2+CO+CO2 2 Cu Cu2 2SOSO4 4+2H+2H2 2SOSO4 4=2CuSO=2CuSO4 4+SO+SO2 2+2H+2H2 2O O62 2、过程、过程消化、蒸馏、吸收、滴定消化、蒸馏、吸收、滴定 （1 1）消化）消化 小火至泡沫消失小火至泡沫消失加大火力至透明无黑粒，摇动使瓶加大火力至透明无黑粒，摇动使瓶壁炭粒溶于硫酸中壁炭粒溶于硫酸中继续消化继续消化30min30min绿色绿色7（2 2）蒸馏与吸收）蒸馏与吸收常量凯氏定氮常量凯氏定氮微量凯氏定氮微量凯氏定氮改良微量凯氏定氮改良微量凯氏定氮8A A、蒸馏完全判断、蒸馏完全判断 经验时间：经验时间：常量凯氏定氮约常量凯氏定氮约30min30min，微量定，微量定氮装置中是指示剂变色后，再蒸馏氮装置中是指示剂变色后，再蒸馏10min10min，提离，提离液面，再蒸馏液面，再蒸馏1min1min；萘氏试剂遇氨气呈红棕色。萘氏试剂遇氨气呈红棕色。配制：配制：3.5gKI+1.3gHgCl3.5gKI+1.3gHgCl2 2 溶于溶于70ml70ml水，加水，加4mol/lNaOH 30ml4mol/lNaOH 30ml。B B、吸收、吸收 用用2%2%或或4%4%硼酸作为吸收液，应注意接收管浸硼酸作为吸收液，应注意接收管浸没在吸收液中。没在吸收液中。C C、常量、半微量、微量概念、常量、半微量、微量概念9常量：常量：0.1g0.1g，10mL10mL；半微量：半微量：0.01g-0.1g 0.01g-0.1g，1mL-10mL 1mL-10mL；微量：微量：0.1mg-10mg0.1mg-10mg，0.01mL-1mL0.01mL-1mL。eg:eg:称样称样0.85g,0.85g,消化后，直接蒸馏，取出消消化后，直接蒸馏，取出消化液，定容至化液，定容至100mL100mL，取其中的，取其中的10mL10mL蒸馏蒸馏常量凯氏定氮常量凯氏定氮改良微量凯氏定氮改良微量凯氏定氮10（3 3）滴定）滴定 (NH(NH4 4)2 2B B4 4O O7 7+HCl+H+HCl+H2 200NHNH4 4Cl+HCl+H3 3BOBO3 3 用盐酸标准溶液滴定吸收有氨气的硼酸液。用盐酸标准溶液滴定吸收有氨气的硼酸液。指示剂：指示剂：0.1%0.1%甲基红甲基红+0.1%+0.1%溴甲酚绿溴甲酚绿终点判定终点判定 2%2%硼酸溶液，蓝绿色硼酸溶液，蓝绿色灰色灰色 4%4%硼酸溶液，蓝绿色硼酸溶液，蓝绿色酒红色酒红色 主要与混合指示剂的变色范围有关：主要与混合指示剂的变色范围有关：pHpH4.04.0红色红色 =5.1=5.1灰色灰色 6.26.2绿色绿色 11n样品中被恶意添加硫酸铵、氯样品中被恶意添加硫酸铵、氯化铵，？化铵，？n样品中被恶意添加硝酸铵，？样品中被恶意添加硝酸铵，？n样品中被恶意添加碳酸铵，？样品中被恶意添加碳酸铵，？n样品中被恶意添加尿素、三聚样品中被恶意添加尿素、三聚氰胺，？氰胺，？N N含量含量66.67%66.67%12策略一：策略一：甲醛法测定样品消化前铵盐含量甲醛法测定样品消化前铵盐含量 4 4NHNH4 4+6HCHO=(CH+6HCHO=(CH2 2）6 6N N4 4 H H+3H+3H+6H+6H2 2O O OHOH-六次甲基四胺（弱碱，六次甲基四胺（弱碱，pH8.7pH8.7）(NH4NH4+是极弱的酸，不能直接用是极弱的酸，不能直接用NaOHNaOH滴定）滴定）过程过程 ：样品样品+适量蒸馏水适量蒸馏水NaOHNaOH中和游离酸中和游离酸（甲基红指示剂，红色变橙色，（甲基红指示剂，红色变橙色，pHpH为为4.44.46.26.2）加入甲醛加入甲醛充分摇匀充分摇匀,静置静置5min5min用用NaOHNaOH标准溶液进行滴定（酚酞指示剂，标准溶液进行滴定（酚酞指示剂，pHpH为为8.08.09.69.6）13注意：注意：A A、中和游离酸时只能用甲基红指示剂，如果甲、中和游离酸时只能用甲基红指示剂，如果甲醛中有甲酸，宜用醛中有甲酸，宜用NaOHNaOH先中和，此时指示剂用先中和，此时指示剂用酚酞。酚酞。B B、但要注意，甲醛也能和氨基酸发生反应，且、但要注意，甲醛也能和氨基酸发生反应，且能使酸性相对凸显。能使酸性相对凸显。C C、碳酸铵不能碳酸铵不能用这种方法测定，因为生产的碳用这种方法测定，因为生产的碳酸为弱酸，不能用酸为弱酸，不能用NaOHNaOH滴定，况且滴定，况且COCO2 2会挥发。会挥发。D D、硝酸铵中、硝酸铵中NONO3 3-中的中的N N不能被直接测出，但可以不能被直接测出，但可以通过分子式中的定量关系求出。通过分子式中的定量关系求出。14策略二：策略二：牛奶中铵盐的定性检测牛奶中铵盐的定性检测2NH2NH4 4+2I+2I-+2ClO+2ClO-=NHI=NHI2 2+NH+NH3 3+2Cl+2Cl-+2H+2H2 2O O过程：过程：奶样奶样5ml5ml，加入，加入KIKI约约0.25g0.25g，缓慢逐滴加入含，缓慢逐滴加入含NaClO5%NaClO5%的的NaOHNaOH混合试剂，并同时观察奶样与最后所加试剂两者界面处混合试剂，并同时观察奶样与最后所加试剂两者界面处的颜色变化，若出现棕灰至黑色浑浊，表明样品掺有铵盐。的颜色变化，若出现棕灰至黑色浑浊，表明样品掺有铵盐。（于琴，董文宾，赵旭博，郑（于琴，董文宾，赵旭博，郑 丹丹.鲜奶中铵盐快速检测新方法鲜奶中铵盐快速检测新方法研究研究.中国乳品工业中国乳品工业.2004.2004，3232，8.8.）15策略三：策略三：非蛋白质有机物物中的非蛋白质有机物物中的N N，改用别的方法来测定，改用别的方法来测定蛋白质或别的方法测定恶意添加物。蛋白质或别的方法测定恶意添加物。三聚氰胺检测（三聚氰胺检测（GB/T22388-2008GB/T22388-2008）HPLCHPLC（高效液相色谱法）、（高效液相色谱法）、HPLC-MCHPLC-MC、GC-MSGC-MSHPLCHPLCA A、提取、提取 超声波及振荡下，三氯乙酸、乙腈混合提取，三氯乙酸沉淀超声波及振荡下，三氯乙酸、乙腈混合提取，三氯乙酸沉淀蛋白，离心除杂。蛋白，离心除杂。B B、净化、净化 阳离子固相萃取柱，用水、阳离子固相萃取柱，用水、甲醇洗脱除杂，氨化乙醇洗脱，甲醇洗脱除杂，氨化乙醇洗脱，收集洗脱液，备用。收集洗脱液，备用。16C C、测定、测定 C C8 8或或C C1818柱柱 流动相：柠檬酸、辛烷磺酸钠、乙腈组成流动相：柠檬酸、辛烷磺酸钠、乙腈组成 流速流速1mL/min1mL/min，柱温，柱温4040，进样量，进样量20L20L 波长波长240nm 240nm。17二、分光光度法二、分光光度法方法方法原理原理紫外吸收法紫外吸收法蛋白蛋白质质在在280nm280nm处处有吸收。有吸收。考马斯亮蓝比色法考马斯亮蓝比色法考考马马斯亮斯亮蓝蓝使蛋白使蛋白质质染色，在染色，在620nm620nm处处有最大吸收（有最大吸收（标标准物准物质质：牛血清蛋白：牛血清蛋白bovine serum albuminbovine serum albumin）。）。双缩脲法双缩脲法 双双缩脲缩脲与碱性与碱性铜铜生成紫生成紫红红色配合物，在色配合物，在560nm560nm处处有最大吸收。（有最大吸收。（备备注注1 1）lowrylowry法法 蛋白蛋白质质-铜络铜络合物中的酪氨酸及色氨酸残合物中的酪氨酸及色氨酸残基使磷基使磷钼钼酸酸-磷磷钨钨酸（酸（Folin phenol Folin phenol reagentreagent）还还原成原成蓝蓝色物色物质质。（。（备备注注2 2）18备注备注1 1：19双缩脲法双缩脲法备注备注2 2：（1 1）lowrylowry法的原理法的原理 色泽的变化主要缘于色泽的变化主要缘于钼、钨化学价的降低钼、钨化学价的降低，该物，该物质的吸收波长在质的吸收波长在550-750nm550-750nm之间，当蛋白质浓度在之间，当蛋白质浓度在1-1-100g/ml100g/ml时，用时，用750nm750nm或或660nm660nm，当蛋白质含量更高时，当蛋白质含量更高时，用用550nm550nm。没有铜离子时，色泽由蛋白质中的没有铜离子时，色泽由蛋白质中的酪氨酸及色氨酪氨酸及色氨酸酸残基含量决定，其次是半胱氨酸和组氨酸残基含量决残基含量决定，其次是半胱氨酸和组氨酸残基含量决定，铜离子将肽键聚合在一起，从而定，铜离子将肽键聚合在一起，从而加速加速了电子的传递。了电子的传递。干扰物质较多干扰物质较多：柠檬酸，柠檬酸，tristris，甘氨酸，组氨酸，谷，甘氨酸，组氨酸，谷氨酸，氨酸，EDTAEDTA，葡萄糖，果糖，高浓度的尿素，硫酸铵等都有影响，葡萄糖，果糖，高浓度的尿素，硫酸铵等都有影响。20（2 2）试剂组成（）试剂组成（http:/www.animal.ufl.edu/hansen/protocols/lowry.htm）Lowry A:2%NaLowry A:2%Na2 2COCO3 3 in 0.1 M NaOH in 0.1 M NaOH Lowry B:1%CuSOLowry B:1%CuSO4 4 in diH in diH2 2O O Lowry C:2%sodium potassium tartrate(NaKCLowry C:2%sodium potassium tartrate(NaKC4 4H H4 4O O6 6 4H 4H2 2O)O)Lowry stock reagentLowry stock reagent 49 ml Lowry A 49 ml Lowry A 0.5 ml Lowry B 0.5 ml Lowry B 0.5 ml Lowry C 0.5 ml Lowry C Folins Reagent:Folins Reagent:Phenol reagent-2N(Folin-Ciocalteau Phenol reagent-2N(Folin-Ciocalteau reagent)reagent)主要成分为：主要成分为：3H2O3H2O P2O5P2O5 13WO313WO3 5MoO35MoO3 10H2O10H2O 3H2OxP2O5 3H2OxP2O5 14WO314WO3 4MoO34MoO3 10H2O10H2O（http:/en.wikipedia.org/wiki/Folin%E2%80%93Ciocalteu_reagent）Folin phenol Folin phenol试剂还可以测定酚类物质的含量试剂还可以测定酚类物质的含量（郑鸿元郑鸿元 许光辉许光辉 李凤珍等李凤珍等 .土壤微生物分析方法手册土壤微生物分析方法手册.中国农业出版社，中国农业出版社，1986.1986.）21（3 3）该法的历史）该法的历史 吴宪博士吴宪博士（18931959年）是国际著名生物化学家、中国近代生物化学事业的开拓者和奠基人 于于19221922年发现年发现Folin Folin phenol reagentphenol reagent能测定蛋白质能测定蛋白质 (Wu,H.(1922)J.Biol.Chem.51,3339)。LowryLowry发现，在此前，先让蛋白质与铜发发现，在此前，先让蛋白质与铜发生发生络合反应（双缩脲法生发生络合反应（双缩脲法 ），能提高反应的），能提高反应的灵敏度灵敏度(Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,A.L.and Randall,R.J.(1951)J.Biol.Chem.193,265275）。）。22THANK YOUSUCCESS5/7/202423可编辑第二节第二节 蛋白质定性（略）蛋白质定性（略）定性蛋白质主要是通过显色反应完成。定性蛋白质主要是通过显色反应完成。常用显色剂：常用显色剂：氨基黑氨基黑10B10B、溴酚蓝、溴酚蓝、考马斯亮蓝、酸性品红、氨基萘酚磺酸。考马斯亮蓝、酸性品红、氨基萘酚磺酸。另外对于糖蛋白及脂蛋白都有专门另外对于糖蛋白及脂蛋白都有专门的显色剂。的显色剂。24第三节第三节 氨基酸定性氨基酸定性一、一般显色反应一、一般显色反应茚三酮法：蓝紫色。茚三酮法：蓝紫色。二、个别氨基酸的显色反应（略）二、个别氨基酸的显色反应（略）精氨酸的坂口反应、胱氨酸和半胱氨精氨酸的坂口反应、胱氨酸和半胱氨酸的显色反应等。酸的显色反应等。25第四节第四节 氨基酸定量氨基酸定量一、甲醛滴定法一、甲醛滴定法1 1、原理、原理 酸性的酸性的-COOH-COOH，碱性的，碱性的-NH-NH2 2，使氨基酸成为中，使氨基酸成为中性的内盐，加入甲醛溶液时，性的内盐，加入甲醛溶液时，-NH-NH2 2与甲醛结合，与甲醛结合，其碱性消失，用碱滴定其碱性消失，用碱滴定-COOH-COOH基，以间接方法测定基，以间接方法测定氨基酸的量。氨基酸的量。2 2、大约过程、大约过程 加碱中和酸（加碱中和酸（pH 8.2pH 8.2）、加入甲醛，加碱滴）、加入甲醛，加碱滴定。当加入甲醛后，溶液的定。当加入甲醛后，溶液的pHpH值还在值还在8.28.2吗？当样吗？当样品中存在品中存在4 4+时时,则测定结果偏大偏小？如何则测定结果偏大偏小？如何排除这种影响？排除这种影响？26阮富升阮富升.铵盐对甲醛法测定酱油氨基氮含量的影响铵盐对甲醛法测定酱油氨基氮含量的影响.中国调味品中国调味品.第第8 8期期19991999年年8 8月月.甲醛不但与氨基酸的氨基起反应甲醛不但与氨基酸的氨基起反应,同时也与同时也与4 4+起反应，增起反应，增加了反应体系的酸性，这部分酸性不能代表氨基酸的羧基的酸性。加了反应体系的酸性，这部分酸性不能代表氨基酸的羧基的酸性。因此，以氢氧化钠标准溶液滴定时，会消耗更多的氢氧化钠标准因此，以氢氧化钠标准溶液滴定时，会消耗更多的氢氧化钠标准溶液，使氨基氮计算结果升高。溶液，使氨基氮计算结果升高。4NH4NH4 4+6HCHO=(CH+6HCHO=(CH2 2）6 6N N4 4 H H+3H+3H+6H+6H2 2O O27二、比色法二、比色法1 1、茚三酮法、茚三酮法氨基酸与茚三酮生成氨基酸与茚三酮生成蓝紫色蓝紫色化合物二酮茚胺，该物在化合物二酮茚胺，该物在570nm570nm有最大吸收（但脯氨酸和羟脯氨酸由于有最大吸收（但脯氨酸和羟脯氨酸由于氨基被氨基被取代，生成物显黄色取代，生成物显黄色440nm440nm有最大吸收）。有最大吸收）。28 茚三酮反应的适宜茚三酮反应的适宜pHpH为为5-75-7 所有所有-氨基酸和蛋白质氨基酸和蛋白质都有此反应，但有此反都有此反应，但有此反应的不一定都是应的不一定都是-氨基酸和蛋白质，比如氨基酸和蛋白质，比如-丙氨酸、丙氨酸、氨、许多一级胺与茚三酮都呈阳性氨、许多一级胺与茚三酮都呈阳性。（。（郑继平，汤华，陈银华郑继平，汤华，陈银华 .现代生物学实验指导现代生物学实验指导.中国农业出版社，中国农业出版社，20072007.）但色泽不一定一样，但色泽不一定一样，比如，比如，-氨基酸呈黄色，苯胺橙红色。（氨基酸呈黄色，苯胺橙红色。（杨桂法等杨桂法等.有机有机化学分析化学分析.湖南大学出版社，湖南大学出版社，1996.1996.）29 但课本但课本P140P140所谈及的及所谈及的及GB/T 8314-2002GB/T 8314-2002茶游离氨茶游离氨基酸总量测定时：基酸总量测定时：-氨基酸在氨基酸在pH8.0pH8.0的条件的条件下与茚三酮下与茚三酮共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定的波长下共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定的波长下测定其含量。测定其含量。茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化，使用前用活性炭吸附被氧化物而纯化。氧化，使用前用活性炭吸附被氧化物而纯化。302 2、邻苯二甲醛法（、邻苯二甲醛法（O-Phthalic aldehyde,OPT)O-Phthalic aldehyde,OPT)邻苯二甲醛在邻苯二甲醛在2-2-巯基乙醇存在下，碱性溶液中，与氨基巯基乙醇存在下，碱性溶液中，与氨基酸产生荧光物质，激发光波长为酸产生荧光物质，激发光波长为340nm340nm，发射光波长为，发射光波长为455nm455nm。n灵敏度比茚三酮高，但荧光强度与氨基酸种类有关，灵敏度比茚三酮高，但荧光强度与氨基酸种类有关，对半胱氨酸、胱氨酸和赖氨酸等的荧光值偏低，和对半胱氨酸、胱氨酸和赖氨酸等的荧光值偏低，和脯氨脯氨酸和羟脯氨酸不反应，尿素、尿酸及氨等不发生类似反酸和羟脯氨酸不反应，尿素、尿酸及氨等不发生类似反应应。313 3、三硝基苯磺酸法（、三硝基苯磺酸法（TriNitroBenzene Sulfonic acidTriNitroBenzene Sulfonic acid）32n与茚三酮相比：灵敏度相当，且与茚三酮相比：灵敏度相当，且不受不受NH4NH4+的影响，但的影响，但不能与不能与ProPro反应，可以和反应，可以和CysCys的的-SH-SH反应，为此，反应，为此，TNBSTNBS前，前，碱性条件下碱性条件下3030保温数小时，使保温数小时，使-SH-SH都氧化成都氧化成-S-S-S-S-后，后，再测定。再测定。n碱性条件下测定的优势是可以用碱性条件下测定的优势是可以用420nm420nm，在可见光范围，在可见光范围内，劣势是每种氨基酸的消光系数不同；酸性条件下的内，劣势是每种氨基酸的消光系数不同；酸性条件下的优势是每种氨基酸的消光系数同，但需紫外光。优势是每种氨基酸的消光系数同，但需紫外光。334 4、丹磺酰氯法（、丹磺酰氯法（dansyl chloridedansyl chloride）丹磺酰氯是丹磺酰氯是5-5-二甲基氨基萘二甲基氨基萘-1-1-磺酰氯（磺酰氯（5-5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl chloridedimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl chloride）的）的简称。丹磺酰氯与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的简称。丹磺酰氯与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物磺胺衍生物(激发波长激发波长298nm298nm，发射波长，发射波长546nm546nm），也常用），也常用于多肽链的于多肽链的N N末端氨基酸的鉴定。末端氨基酸的鉴定。345 5、2,4-2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene,2,4-dinitrofluorobenzene,DNFBDNFB）法）法DNFBDNFB也叫做也叫做SangerSanger试剂，试剂，DNFBDNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitro phenyl dinitro phenyl amino acid,DNPamino acid,DNP氨基酸）氨基酸）35361.0 mL 1.0 mL 的的0.2 mol/L NaHCO0.2 mol/L NaHCO3 3,1.0 mL,1.0 mL 的的 1%DNFB(1.0mL 1%DNFB(1.0mL 溶解溶解在在100mL100mL的的1,4-dioxane)1,4-dioxane)，1.0 mL 1.0 mL 样品液样品液,黑暗处黑暗处60 60，40min,40min,加入加入0.5 mL of 1 mol/L HCl0.5 mL of 1 mol/L HCl终止反应，加入终止反应，加入5mL5mL乙酸乙乙酸乙酯萃取，静置酯萃取，静置10min,420nm10min,420nm测定，氨基酸浓度测定，氨基酸浓度0.020.021.00 mg/mL1.00 mg/mL有良好的线性关系有良好的线性关系（Lin ChenLin Chen，et al.A novel colorimetric determination of free amino et al.A novel colorimetric determination of free amino acids content in tea infusions with 2,4-dinitrofluorobenzene.acids content in tea infusions with 2,4-dinitrofluorobenzene.Journal of Food Composition and Analysis 22(2009)137Journal of Food Composition and Analysis 22(2009)137141141）。）。方法方法灵敏度灵敏度脯氨酸、脯氨酸、羟羟脯氨酸脯氨酸受氨的影响受氨的影响茚茚三三酮酮能反能反应应有影响有影响邻邻苯二甲苯二甲醛醛比比茚茚三三酮酮高高不反不反应应不影响不影响三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸与与茚茚三三酮酮同同不反不反应应不影响不影响丹磺丹磺酰氯酰氯比比茚茚三三酮酮高高反反应应未知未知2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯比比茚茚三三酮酮高高反应反应未知未知几种比色法的比较几种比色法的比较37第五节第五节 氨基酸分离及测定氨基酸分离及测定一、蛋白质的水解一、蛋白质的水解n酸水解：酸水解：5.7mol/L5.7mol/L盐酸，密封的水解管中，盐酸，密封的水解管中，105-115105-115水解水解20h20h以上。盐酸水解后，以上。盐酸水解后，色氨酸全部被破坏。色氨酸全部被破坏。n碱水解：碱水解：5mol/L NaOH5mol/L NaOH，充氮气后填充管，充氮气后填充管，110110水解水解22h22h，测，测定时，用定时，用6mol/L6mol/L盐酸中和至盐酸中和至pH6-7pH6-7后测定，碱水解时，多数氨基酸后测定，碱水解时，多数氨基酸破坏，破坏，仅色氨酸稳定，仅色氨酸稳定，因此专用于色氨酸的测定。因此专用于色氨酸的测定。n磺酸水解：磺酸水解：4mol/L4mol/L甲基磺酸，并加入色氨酸保护剂，水解后，甲基磺酸，并加入色氨酸保护剂，水解后，用用3.5mol/L NaOH3.5mol/L NaOH中和至中性，可以测定中和至中性，可以测定除半胱氨酸以外的所除半胱氨酸以外的所有氨基酸。有氨基酸。n酶解：酶解：保持所有的氨基酸不被破坏，但水解不全，且酶本身也保持所有的氨基酸不被破坏，但水解不全，且酶本身也是蛋白质，对测定有干扰。是蛋白质，对测定有干扰。（颜真（颜真.蛋白质研究技术蛋白质研究技术.西安：第四军医大学出版社，西安：第四军医大学出版社，20072007）38二、氨基酸的薄层层析法二、氨基酸的薄层层析法、原理、原理制备样品，点其于薄层板，双向上行法展开，制备样品，点其于薄层板，双向上行法展开，组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，氨基酸得到分离。后用茚三酮显色，与等作用，氨基酸得到分离。后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，通过比移值（标准氨基酸进行对比，通过比移值（）定性，）定性，斑点颜色深浅大致定量。斑点颜色深浅大致定量。39、过程、过程（）薄层板制备（）薄层板制备吸附层析吸附层析:如硅胶、氧化铝、聚酰胺等（固定如硅胶、氧化铝、聚酰胺等（固定相：这些物质）；相：这些物质）；分配层析分配层析:纤维素、硅藻土等纤维素、硅藻土等（固定相：水）；（固定相：水）；离子交换层析离子交换层析:支持剂是离子交支持剂是离子交换剂。换剂。（）样品液制备（）样品液制备游离氨基酸提取：游离氨基酸提取：水浸液，加乙醇沉淀除去水浸液，加乙醇沉淀除去蛋白质、多糖等杂质，离子交换树脂净化。蛋白质、多糖等杂质，离子交换树脂净化。酸水解法：酸水解法：蛋白质样品，加入盐酸水解。蛋白质样品，加入盐酸水解。（）点样、展开、显色。（）点样、展开、显色。40标准标准1标准标准2标准标准3样液样液a ab bR Rf f=b/a=b/a41三、氨基酸自动分析仪三、氨基酸自动分析仪利用各种氨基酸的酸碱性、极性、相对分子利用各种氨基酸的酸碱性、极性、相对分子量不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上量不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。通常先出来的为酸性氨基酸和极性较进行分离。通常先出来的为酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其次是非极性的芳香族氨基酸，最大的氨基酸，其次是非极性的芳香族氨基酸，最后是碱性氨基酸，分子量小的先洗脱下来，洗脱后是碱性氨基酸，分子量小的先洗脱下来，洗脱下的氨基酸通过茚三酮显色，从而定量各种氨基下的氨基酸通过茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。酸。4243THANK YOUSUCCESS5/7/202444可编辑