DB14∕T 2290-2021 实验动物 猫微生物等级与监测(山西省).pdf

ICS 65. 020. 30 CCS B 44 0014 山西省由巳ET且，方标准DB 14/T 2290-2021 实验动物猫微生物等级与监测2021 - 07 -20发布2021 - 10 -20实施山西省市场监督管理局发布DB 14/T 2290-2021 目次前言.II1 范围.12 规范性引用文件.13 术语和定义.14 等级分类.15 检测要求.16 检测程序.27 检测规则.38 检测方法.49 结果判定.410 报告.附录A(规范性)猫泛白细胞减少症病毒和猫擅摩病毒I型的多重PCR检测方法.6附录B(规范性)猫杯状病毒RT-PCR检测方法.7附录C(规范性)猫血巴尔通体PCR检测方法.8附录o(规范性)猫传染性腹膜炎病毒巢式RT-PCR检测方法.9附录E(规范性)猫免疫缺陷病毒巢式RT-PCR检测方法.10附录F(规范性)猫臼血病病毒巢式RT-PCR检测方法.11DB 14/T 2290-2021 目IJ1=1 本文件按照GB/T1.1-2020 标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由山西省科学技术厅提出、归口井监督实施。本文件起草单位:山西医科大学。本文件主要起草人:末国华、轩瑞晶、陈朝阳、高继萍、刘茂林、续国强、王晓堂、肖兰飞。II DB 14/T 2290-2021 实验动物猫微生物等级与监测1 范围本文件规定了实验动物猫(以下简称实验猫)微生物等级与监测的术语和定义、等级分类、检测要求、检测程序、检测规则、检测方法、结果判定及报告。本文件适用于普通级和SPF级实验猫微生物等级与监测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件:不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB!T 14926. 1 实验动物沙门菌检测方法GB!T 14926.4 实验动物皮肤病原真菌检测方法GB!T 14926. 14 实验动物金黄色葡萄球菌检测方法GB!T 14926.46 实验动物钩端螺旋体检测方法GB!T 14926.56 实验动物狂犬病病毒检测方法NY!T 541 动物疫病实验室检验采样方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 实验猫experime ntalf e l ine 经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检定以及其他科学实验的猫。3. 2 普通级猫conventi ona I (CV) fe I i ne 不携带重要人兽共患病和猫烈性传染病病原的实验猫，简称普通猫。3. 3 无特定病原体级猫specificpathogen free (SPF) fel ine 除普通级猫应排除的病原外，不携带所主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的实验猫，简称无特定病原体猫。4 等级分类实验猫分为普通级与无特定病原体级。5 检测要求DB 14/T 2290-2021 5. 1 临床观察对实验猫的精神状态、行为、被毛、分泌物进行检查，观察有无异常。5.2 微生物检测项目各等级实验猫病原微生物指标见表10表1各等级实验猫微生物检测项目动物等级病原微生物检测项目检测要求j苗泛白细胞减少症病毒Felinepanleukopenia virus j苗宿珍病毒I型Felineherpesvirus type 1 猫杯状病毒Feli口巳calicivirus j苗狂犬病毒Felinerabies virus 普通级沙门菌Salmon巳11aspp. 猫巴尔通休Bartone11日 7巳特定病原休级致病性钩端螺旋体Leptospira 皮肤病原真商Pathogenicd盯malfungi O j苗传染性腹膜炎病毒Felineinfectious peritonitis virus 金黄色葡萄球两Staphylococcusaureus 猫免疫缺陷病毒Felineimmunodeficiency virus O 猫白血病病毒Felineleukosis virus O 注.必须检测项曰o必要时检查项目。5. 3 检测项目分类微生物检测项目分为必须检测项目和必要时检查项目。必须检测项目是指在进行实验猫质量评价时必须检测的项目。必要时检查项目是指从省外或国外号|进实验猫，怀疑有寄生虫流行感染或申请生产许可证或实验特殊需要时必须检测的项目。6 检测程序检测程序按图1执行。在采样时，结合临床症状和实验室检查结果，需要进一步确证的，可取特定样本进行检测。2 DB 14/T 2290-2021 训丁 | 某样| 耳后、背部毛M皮屑 豆1唔血清病毒或其他病原的抗体检查量拭子、虹拭子(M新鲜粪便)唔-一一一病原体检查图1检测程序7 检测规则7. 1 检测频率3 DB 14/T 2290-2021 普通级与无特定病原体级猫群至少每6个月检测1次。7.2 采样7.2.1 方式选择成年实验猫用于检测(也可根据需求抽样)，随机抽样。新鲜粪便样本应在饲养单元中选取至少4个点随机取样。血液采样量每只动物至少1mL。7. 2. 2 数量根据实验猫群体大小，抽样数量见表20表2实验猫抽样量群体大小(只)抽样数量小于100不少于5民100500 不少于10民大于500不少于15民7. 2. 3 方法采样方法遵守NY/T541第3章样品的采集。受检动物应当日来样，可按病毒、细菌、真菌及寄生虫检测要求联合采样。7. 3 送检要求样本要求有明显标识，包装完好，送检单应写明检品名称、品系、等级、数量及检测项目等内容，安全送达送检单位。8 检测方法8. 1 猫泛白细胞减少症病毒和猫痛痒病毒I型采用多重PCR方法检测，见附录Ao8. 2 猫杯状病毒采用RT-PCR方法检测，见附录B。8. 3 狂犬病病毒按GB/T14926.56的规定进行。8. 4 沙门氏菌按GB/T14926. 1的规定进行。8. 5 猫巴尔通体采用PCR方法检测，见附录co8. 6 钩端螺旋体按GB/T14926.46的规定进行。8. 7 皮肤病原真菌按GB/T14926.4的规定进行。8. 8 猫传染性腹膜炎病毒采用巢式RT-PCR方法检测，见附录D。8.9 金黄色葡萄球菌按GB/T14926. 14的规定进行。8.10 猫免疫缺陷病毒采用巢式RT-PCR方法检测，见附录E。8. 11 猫白血病病毒采用巢式RT-PCR方法检测，见附录Fa9 结果要Ij定4 DB 14/T 2290-2021 在检测的各等级动物中，如有某项指标不符合该等级标准指标要求，则判为不符合该等级标准。10 报告检测结束出具报告，报告应包括检测结果、检验结论等内容。3 DB 14/T 2290-2021 附录A(规范性猫泛白细胞减少症病毒和猫癌癖病毒l型的多重PCR检测方法采用PCR方法，特异性扩增猫泛白细胞减少症病毒(FPV)的儿罗基因序列和猫擅痊病毒I型(FHV-1) 的TK基因序列，用于猫泛臼细胞减少症病毒和猫擅瘁病毒I型的检测。A. 1 病毒DNA的提取按照病毒DNA提取试剂盒操作方法进行，提取的DNA于一20C保存备用。A. 2 PCR反应引物A. 2.1 猫泛白细胞减少症病毒PCR反应引物上游引物序列(5-3)ATGGTTGGTGACTCTTTGTTT 下游引物序列吁-3)TACATTTGATTGACACTTCCC A. 2. 2 猫癌事病毒|型PCR反应号|物上游引物序列(5-3)GACGTGGTGAATTATCAG 下游引物序列(5-3)CAACTAGATTTCCACCAGG A.3 PCR反应条件94C变性5min;94C变性30s，55C退火30s，72C延伸1m山，30个循环72C延伸10minoA.4 PCR产物A. 4.1 检测方法1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。A.4.2 产物大小猫泛白细胞减少症病毒目的片段大小为392bp;猫殖痊病毒I型目的片段大小为290bp 0 6 附录B(规范性猫杯状病毒RT-PCR检测方法DB 14/T 2290-2021 采用PCR方法，特异性扩增猫杯状病毒(FCV)的ORF2基因序列，用于猫杯状病毒的检测。B. 1 病毒RNA提取按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于一20C保存备用。B. 2 反转录使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备cDNAoB. 3 PCR反应引物上游引物序列(5-3)AACCTGCGCTAACGTGCTT 下游引物序列日-3)CAGTGACAATACACCCAGAA B.4 PCR反应条件94C预变性5min;94C变性30s，55C退火30s，72C延伸1m山，30个循环72C延伸10minoB.5 PCR产物B. 5.1 检测方法1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。B.5.2 产物大小猫杯状病毒目的片段大小为922bpo 7 DB 14/T 2290-2021 附录G(规范性猫血巴尔通体PCR检测方法采用PCR方法，特异性扩增猫血巴尔通体16SrDNA基因片段，用于猫血巴尔通体的检测OC. 1 DNA :tEr 按照DNA提取试剂盒操作方法进行，提取的DNA于200C保存备用。C. 2 PCR反应引物上游引物序列(5-3):TCACAATGGACGAAAGTCTG 下游引物序列(5-3):CCAAACATCTCAAGACACGAG C.3 PCR反应条件950C预变性2min;950C变性15s，550C返火30s，720C延伸lmin，35个循环720C延伸5min。C.4 PCR产物C. 4.1 检测方法1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。C.4.2 产物大小猫血巴尔通体目的片段大小为711bpo 8 OB 14/T 2290-2021 附录D(规范性猫传染性腹膜炎病毒巢式RT-PCR检测方法采用RT-PCR方法，特异性扩增猫传染性腹膜炎病毒ORF1b基因片段，用于猫传染性腹膜炎病毒的检测。O. 1 病毒RNA提取按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于一20C保存备用。O. 2 反转录使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备cDNAoO. 3 PCR反应引物上游引物序列日-3);GTGATGCTATCATGACTAG 下游引物序列吁-3);CAGTGACAATACACCCAGAA 0.4 PCR反应条件95C预变性2min;95C变性30s，48C返火35s，72C延伸45s，30个循环72C延伸5mino0.5 PCR产物0.5.1 检测方法1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。0.5.2 产物大小猫传染性腹膜炎病毒目的片段大小为417bpo 9 附录E(规范性猫免疫缺陷病毒巢式RT-PCR检测方法DB 14/T 2290-2021 采用巢式RT-PCR方法，特异性扩增猫免疫缺陷病毒po1基因片段，用于猫免疫缺陷病毒的检测。E. 1 病毒RNA的提取按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于一20C保存备用。E. 2 反转录使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备cDNAoE. 3 PCR反应引物E. 3. 1 第一次反应引物上游引物序列(5-3):TGGCCWYTAWCWAATGAAAARATWGAAGC 下游引物序列(5-3):GTAATTTRTCTTCHGGNGTYTCAAATCCCC E. 3. 2 第二次反应引物上游引物序列日-3):TGAAAARATWGAAGCHTTAACAGAMATAG 下游引物序列吁-3):GTAATTTRTCTTCHGGNGTYTCAAATCCCC E.4 PCR反应条件E. 4.1 第一次PCR反应条件以制备的cDNA为模板，进行第一次PCR反应，条件如下95C预变性2min;95C变性45s，58C 退火30s，72C延伸1mi口，35个循环72C延伸7minoE.4.2 第二次PCR反应条件以第一次PCR产物为模板，进行第二次PCR反应，条件如下95C预变性2min;95C变性45s，58C 退火30s，72C延伸1mi口，35个循环72C延伸7minoE.5 PCR产物E. 5. 1 检测方法1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。E.5.2 产物大小猫免疫缺陷病毒目的片段大小为578bpo 10 附录F(规范性猫白血病病毒巢式RT-PCR检测方法DB 14/T 2290-2021 采用巢式RT-PCR方法，特异性扩增猫臼血病病毒基因片段，用于猫白血病病毒的检测。F. 1 病毒RNA的提取按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于一20C保存、备用。F. 2 反转录使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备cDNAoF. 3 PCR反应引物F. 3. 1 第一次反应引物上游引物序列(5-3):ACAGCAGAAGTTTCAAGGCC 下游引物序列(5-3):GACCAGTGATCAAGGGTGAG F. 3. 2 第二次反应引物上游引物序列日-3):GCTCCCCAGTTGACCAGAGT 下游引物序列吁-3):GCTTCGGTACCAAACCGAAA F.4 PCR反应条件F. 4.1 第一次PCR反应条件以制备的cDNA为模板，进行第一次PCR反应，条件如下95C预变性2min;95C变性45s，58C迢火30s，72C延伸1min，35个循环72C延伸7min。F.4.2 第二次PCR反应条件以第一次PCR产物为模板，进行第二次PCR反应，条件如下95C预变性2min;95C变性45s，58C 退火30s，72C延伸1mi口，35个循环72C延伸7minoF.5 PCR产物F. 5. 1 检测方法1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。F.5.2 产物大小猫白血病病毒目的片段大小为601bpo 11