凝胶过滤和亲和层析.ppt

仪器分析课程仪器分析课程凝胶过滤和亲和层析凝胶过滤和亲和层析 中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所凝胶过滤（凝胶过滤（Gel filtration）一、概念：以多孔凝胶材料为固定相，利用材料的分子筛特一、概念：以多孔凝胶材料为固定相，利用材料的分子筛特性，按照样品分子的大小和形状对组分进行分离的一种液性，按照样品分子的大小和形状对组分进行分离的一种液相色谱。相色谱。二、原理：在凝胶色谱柱中，凝胶颗粒之间和内部孔径均充二、原理：在凝胶色谱柱中，凝胶颗粒之间和内部孔径均充满了溶剂。洗脱时，样品随溶剂一起通过色谱柱。由于各满了溶剂。洗脱时，样品随溶剂一起通过色谱柱。由于各组分分子大小和形状不同，所以进入孔径的能力不同。不组分分子大小和形状不同，所以进入孔径的能力不同。不能进入任何孔径（或称完全被排阻在孔径外）的大分子将能进入任何孔径（或称完全被排阻在孔径外）的大分子将从颗粒间隙通过，最先被分离出来。而较小的分子要经过从颗粒间隙通过，最先被分离出来。而较小的分子要经过颗粒的间隙和部分内部孔径，因此以一个较慢的速度通过颗粒的间隙和部分内部孔径，因此以一个较慢的速度通过色谱柱，并随分子的大小和形状不同产生差异，达到分离色谱柱，并随分子的大小和形状不同产生差异，达到分离的目的。的目的。三、凝胶过滤的材料三、凝胶过滤的材料 最常使用的材料是聚合的有机化合物，它们都具有立体最常使用的材料是聚合的有机化合物，它们都具有立体的孔型网状结构。的孔型网状结构。（一）、交联葡聚糖（一）、交联葡聚糖（Sephadex）交联葡聚糖为葡聚糖与表氯醇交联得到的，改变交联度交联葡聚糖为葡聚糖与表氯醇交联得到的，改变交联度可以得到不同类型的可以得到不同类型的Sephadex。排阻极限：被凝胶完全排阻在孔外的大分子的最低分子量，排阻极限：被凝胶完全排阻在孔外的大分子的最低分子量，称为凝胶的排阻极限。称为凝胶的排阻极限。吸水值：吸水值：1克干胶在完全膨胀后凝胶颗粒所吸取的水量。克干胶在完全膨胀后凝胶颗粒所吸取的水量。型号型号分级分离范围分级分离范围1)吸水值吸水值（克水（克水/克干胶）克干胶）床体积床体积（毫升（毫升/克）克）G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-2007001500100-50001000-5000 2)500-100001500-30000 2)1000-500003000-80000 2)1000-1000004000-150000 2)1000-1500005000-300000 2)1000-2000005000-600000 2)1.01.52.55.07.510.015.020.02351012-1515-2020-3030-40一些一些Sephadex凝胶的特性凝胶的特性1)任意卷曲的多糖任意卷曲的多糖 2）多肽和球蛋白）多肽和球蛋白Sephadex在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸溶液中稳定，在强碱中糖苷键被水解。可在在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸溶液中稳定，在强碱中糖苷键被水解。可在100高压消毒高压消毒40分钟。分钟。（二）、琼脂糖凝胶（二）、琼脂糖凝胶（Sepharose）由琼脂制成的线性多糖，由由琼脂制成的线性多糖，由D-半乳糖和半乳糖和3，6-脱水脱水L-半乳糖交替半乳糖交替组成。组成。一些一些Sepharose凝胶的特性凝胶的特性型号型号 近似的琼脂糖浓度近似的琼脂糖浓度(%)多糖多糖 蛋白质蛋白质 Sepharose 2B 220106 40106Sepharose 4B45106 20106Sepharose 6B61106 4106 可适用于可适用于pH3-11，低于此，低于此pH，葡聚糖可能水解。可耐受清洁剂、，葡聚糖可能水解。可耐受清洁剂、SDS、盐酸、盐酸胍等。可高温消毒。胍等。可高温消毒。四、凝胶过滤的参数和公式四、凝胶过滤的参数和公式 对于某一种凝胶，一种溶质在其内部和外部溶剂之间的对于某一种凝胶，一种溶质在其内部和外部溶剂之间的分配由一个分配系数分配由一个分配系数Kd决定，它是溶质分子大小的函数。决定，它是溶质分子大小的函数。如果是大分子溶质，完全被凝胶内部所排阻，则如果是大分子溶质，完全被凝胶内部所排阻，则Kd=0，如果溶质分子足够小，完全进入内部溶剂，则，如果溶质分子足够小，完全进入内部溶剂，则Kd=1，由，由于凝胶内部孔径大小不同，对于中等大小溶质，可以进入部于凝胶内部孔径大小不同，对于中等大小溶质，可以进入部分内部溶剂，不能进入全部内部溶剂，分内部溶剂，不能进入全部内部溶剂，Kd就在就在0与与1之间变之间变化。化。对于一个凝胶过滤柱，有几个体积的参数：对于一个凝胶过滤柱，有几个体积的参数：Ve为洗脱体积，即样品被洗脱出层析柱的体积，为洗脱体积，即样品被洗脱出层析柱的体积，V0为外水体积，即凝胶颗粒间隙中溶剂的体积，为外水体积，即凝胶颗粒间隙中溶剂的体积，Vi为内部体积，即凝胶内部孔径中溶剂的体积。为内部体积，即凝胶内部孔径中溶剂的体积。Vi=aWr，a为干胶重，为干胶重，Wr为吸水值。为吸水值。这些体积间存在关系式这些体积间存在关系式Ve=V0+KdVi，也即，也即 Kd=，为特征值。，为特征值。对于两种不同分子量和对于两种不同分子量和Kd值（值（Kd和和Kd）的物质，）的物质，它们的洗脱体积之差它们的洗脱体积之差Vs应是应是 Vs=Ve Ve=(Vo+KdVi)(Vo+KdVi)=(Kd Kd)Vi 五、凝胶过滤的应用五、凝胶过滤的应用（一）纯化：对生物大分子的纯化。如病毒、蛋白质、酶、（一）纯化：对生物大分子的纯化。如病毒、蛋白质、酶、激素、抗体、核酸和多糖等。激素、抗体、核酸和多糖等。（二）分子量的测定：球形蛋白质的洗脱体积主要是由它的（二）分子量的测定：球形蛋白质的洗脱体积主要是由它的分子量决定的，在一个相当的分子量范围内，洗脱体积大分子量决定的，在一个相当的分子量范围内，洗脱体积大约是分子量对数的线性函数。用相同形状的和已知的蛋白约是分子量对数的线性函数。用相同形状的和已知的蛋白质作出一条校正曲线，测定洗脱体积后可从校正曲线得到质作出一条校正曲线，测定洗脱体积后可从校正曲线得到分子量。分子量。（三）溶液的浓缩：加入干胶，溶液的水和小分子被膨胀的（三）溶液的浓缩：加入干胶，溶液的水和小分子被膨胀的凝胶吸收。凝胶吸收。（四）脱盐：盐可被看作是小分子。（四）脱盐：盐可被看作是小分子。（五）测定平衡常数：例如药物的蛋白结合率。药物本身分（五）测定平衡常数：例如药物的蛋白结合率。药物本身分子量较小，与蛋白结合后成为分子量较大的物质，通过凝子量较小，与蛋白结合后成为分子量较大的物质，通过凝胶过滤将二者分开。胶过滤将二者分开。六、凝胶过滤的实验设计六、凝胶过滤的实验设计 目的：包括达到最好的分离，最大的回收率，最小的样品目的：包括达到最好的分离，最大的回收率，最小的样品稀释，尽可能短的分离时间。稀释，尽可能短的分离时间。分辨率分辨率（Rs）=可反映分离的效果，当可反映分离的效果，当 Rs1.2时，表明基线分离。时，表明基线分离。（一）、凝胶类型的选择（一）、凝胶类型的选择1.组分离：当两种成分分子量差距很大时采用，例如脱盐。组分离：当两种成分分子量差距很大时采用，例如脱盐。凝胶选择使高分子量的洗脱体积在外水（凝胶选择使高分子量的洗脱体积在外水（Vo），区带窄，），区带窄，稀释少。低分子量的洗脱体积接近稀释少。低分子量的洗脱体积接近Vt。脱盐一般推荐。脱盐一般推荐Sephadex G-25。2.分级分离：当分离几种分子量接近的组分时，应该使用各分级分离：当分离几种分子量接近的组分时，应该使用各种凝胶的选择性曲线，避免几种成分的洗脱体积接近种凝胶的选择性曲线，避免几种成分的洗脱体积接近Vo或或Vt。3.分子量测定：要使样品分子量落在选择性曲线的线性部分分子量测定：要使样品分子量落在选择性曲线的线性部分及处于校正标准品的中间。一般推荐使用及处于校正标准品的中间。一般推荐使用Sephacryl S-200 superfine,Sephacryl S-300 superfine或或Sepharose CL-6B。这些胶对水溶性差使用助溶剂不会造成影响。这些胶对水溶性差使用助溶剂不会造成影响。如果可选择的胶有交搭，应该选择较低排阻极限的，这如果可选择的胶有交搭，应该选择较低排阻极限的，这样可以分离的时间短，回收率高。样可以分离的时间短，回收率高。（二）、凝胶级别的选择（二）、凝胶级别的选择1.细的（细的（20-80m）：）：2.超细的（超细的（10-40m）：以上二者区带窄，）：以上二者区带窄，分辨率高。分辨率高。3.中等的（中等的（50-150m）：）：4.粗的（粗的（100-300m）：以上二者流速快，）：以上二者流速快，适用于制备，组分离。适用于制备，组分离。（三）、层析柱的选择（三）、层析柱的选择1.柱长：两个区带的分辨率与柱长的平方根成正比。柱长：两个区带的分辨率与柱长的平方根成正比。2.柱内径：大小由载样量决定。柱内径：大小由载样量决定。3.加样装置：样品进入凝胶前避免稀释。加样装置：样品进入凝胶前避免稀释。4.死体积：样品经柱分离后避免再混合。死体积：样品经柱分离后避免再混合。5.层析床支持物：避免阻塞。层析床支持物：避免阻塞。（四）、样品量（四）、样品量较难的分离：样品体积占床体积的较难的分离：样品体积占床体积的1-5%。组分离和一般分级分离：可根据情况，加大组分离和一般分级分离：可根据情况，加大样品量。样品量。（五）、样品浓度和粘度（五）、样品浓度和粘度 凝胶过滤在很大程度上与样品浓度无关，但除了溶质凝胶过滤在很大程度上与样品浓度无关，但除了溶质的溶解性以外，样品的粘度限制了浓度的增加。的溶解性以外，样品的粘度限制了浓度的增加。（六）、洗脱剂（六）、洗脱剂 洗脱剂的组成不直接影响凝胶过滤的分辨率。洗脱剂的组成不直接影响凝胶过滤的分辨率。完全不带电荷的物质可以用蒸馏水洗脱。完全不带电荷的物质可以用蒸馏水洗脱。带电荷的物质可以用带电荷的物质可以用Tris-HCl、磷酸盐缓冲液，、磷酸盐缓冲液，Sephadex和和Sepharose用离子强度用离子强度0.02M以上缓冲液，以上缓冲液，Sephacryl用离子强度用离子强度0.05M以上缓冲液，防止与基质间的以上缓冲液，防止与基质间的离子作用。离子作用。NaCl也可采用。如果产物要冷干处理，可采用也可采用。如果产物要冷干处理，可采用挥发性的缓冲液如乙酸铵、碳酸氢铵、乙酸乙二铵等。挥发性的缓冲液如乙酸铵、碳酸氢铵、乙酸乙二铵等。最重要的要考虑洗脱液对样品的作用，如最重要的要考虑洗脱液对样品的作用，如pH、离子强、离子强度度、清洁剂等，是否会引起蛋白分解，影响酶、辅酶、激、清洁剂等，是否会引起蛋白分解，影响酶、辅酶、激素的活性。素的活性。（七）、洗脱的流速（七）、洗脱的流速 当洗脱的流速增加时，色谱的分辨率降低。当洗脱的流速增加时，色谱的分辨率降低。可根据不同的目的选择适合的流速。要求得到好分辨可根据不同的目的选择适合的流速。要求得到好分辨率时，要采用长层析柱和慢流速。要得到快速分离，可采率时，要采用长层析柱和慢流速。要得到快速分离，可采用短层析柱和快流速。好分辨率与快速分离不可兼得。用短层析柱和快流速。好分辨率与快速分离不可兼得。（八）、优化（八）、优化 有时不是一次就可以得到很理想的分离条件，可通过优有时不是一次就可以得到很理想的分离条件，可通过优化来选到。例如：化来选到。例如：A:IgG,B:transferrine,C:-chymotrypsinogenIgG与与transferrin已无法在已无法在保持好分辨率的情况下加快保持好分辨率的情况下加快洗脱速度。洗脱速度。Transferrine 和和-chymotrypsinogen的分离可的分离可以加快流速，分辨率仍可为以加快流速，分辨率仍可为2.25。如改变柱长，使分辨率为如改变柱长，使分辨率为1，柱长约为，柱长约为17cm，分离时，分离时间由间由30小时变为小时变为35分钟分钟。六、凝胶过滤的实验六、凝胶过滤的实验（一）、凝胶的准备（一）、凝胶的准备 Sephadex 干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行，干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行，注意不要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。注意不要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。不同类型的凝胶膨胀的时间不同：不同类型的凝胶膨胀的时间不同：G-25,G-50 膨胀过夜膨胀过夜 G-75 一天一天 G-100 二天二天 G-200 三天三天 在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。Sephacryl,Sepharose,Sepharose CL是膨胀好的。是膨胀好的。（二）、装柱（二）、装柱1.将凝胶悬液调成大约将凝胶悬液调成大约75%。2.用负压泵脱气。用负压泵脱气。3.如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。4.层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温度变化。度变化。5.排掉层析床支持物内的气体。排掉层析床支持物内的气体。6.层析柱调到垂直位置。层析柱调到垂直位置。7.凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。（三）、检查层析柱（三）、检查层析柱 以蓝葡聚糖以蓝葡聚糖2000（2mg/ml）为样品，观察色带在柱内洗脱时移动）为样品，观察色带在柱内洗脱时移动的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体积。的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体积。（四）、加样（四）、加样 1.手工加样手工加样 2.加样阀加样加样阀加样 要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。（五）、洗脱（五）、洗脱 洗脱装置用蠕动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液的供给，洗脱装置用蠕动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液的供给，不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。（六）、凝胶的清洗（六）、凝胶的清洗 凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到上面，影响分离效果，需凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到上面，影响分离效果，需清洗后才能恢复原样。清洗后才能恢复原样。Sephadex,，Sepacryl，Sepharose CL 可用可用0.2M NaOH。Sepharose 可用可用4pH10-4时，亲和力太低，不易成功分离，时，亲和力太低，不易成功分离，E0,L0EL,KL=)L0,=2）、）、配位体和基质的连接方式配位体和基质的连接方式 不溶性底物必须具有功能基，经化学修饰可与基质不溶性底物必须具有功能基，经化学修饰可与基质连接，并且不损害或破坏与互补酶的相互作用。这使配连接，并且不损害或破坏与互补酶的相互作用。这使配位体选择和连接方式带来难度。位体选择和连接方式带来难度。e表示位点不与互补酶作用，其它任何位点（表示位点不与互补酶作用，其它任何位点（a-d）连接）连接生成的吸附剂不是部分有效就是无效。生成的吸附剂不是部分有效就是无效。腺嘌呤核苷腺嘌呤核苷-5-单磷酸与基质连接有几种方式，其中乳酸脱氢酶单磷酸与基质连接有几种方式，其中乳酸脱氢酶与（与（a）结合最强，（）结合最强，（c）次之，（）次之，（b）再次，（）再次，（d）无亲和性。）无亲和性。3）、配位体的浓度）、配位体的浓度EL=/()式中表明以单位体积凝胶所含克分子数表示的结合酶式中表明以单位体积凝胶所含克分子数表示的结合酶EL浓度受到固定配位体浓度的限制。浓度受到固定配位体浓度的限制。但实际上凝胶中配位体表观或有效浓度约为化学但实际上凝胶中配位体表观或有效浓度约为化学测定值的测定值的1%或更低。一般采用最大配位体浓度。或更低。一般采用最大配位体浓度。对于亲和力强不易洗脱的情况，减少配位体浓度对于亲和力强不易洗脱的情况，减少配位体浓度即可将蛋白质在较温和地条件下洗脱下来。即可将蛋白质在较温和地条件下洗脱下来。如如果果配配位位体体具具有有电电荷荷，浓浓度度过过高高能能引引起起色色谱谱畸畸变变。一一般般认认为为配配位位体体浓浓度度在在10-3M,对对酶酶的的纯纯化化效效果果最最好好。因因为为10-3M,配配位位体体彼彼此此相相距距较较远远，足足以以防防止止非非特特异异性性蛋蛋白白质质同同时时与与一一个个以以上上带带电电配配位位体体发发生生相相互互作作用用。（1）溴化氰活化的琼脂糖）溴化氰活化的琼脂糖4B：（2）AH-琼脂糖琼脂糖4B：具：具6碳臂，碳臂，（3）CH-琼脂糖琼脂糖4B：具：具6碳臂，碳臂，（4）活化的）活化的CH-琼脂糖琼脂糖4B：具：具6碳碳 臂和活性脂，臂和活性脂，（5）环氧活化的琼脂糖）环氧活化的琼脂糖6B：具亲：具亲 水臂，水臂，（6）活化的含硫琼脂糖）活化的含硫琼脂糖4B：具谷：具谷 胱甘肽臂，胱甘肽臂，（7）含硫丙基琼脂糖）含硫丙基琼脂糖6B：具亲水具亲水 性臂，性臂，结合含伯氨基配体结合含伯氨基配体结合羧基配体结合羧基配体结合氨基配体结合氨基配体结合含胺基结合含胺基 配体配体结合含羧基、胺基、巯基结合含羧基、胺基、巯基结合巯基配体结合巯基配体结合巯基、重金属、卤化脂、肪结合巯基、重金属、卤化脂、肪烃及、可与含烃及、可与含C=O、C=C、N=N者加成者加成.二、偶合胶二、偶合胶在凝胶基质上连接某种功能基团，可以快速、容易、安全地固定在凝胶基质上连接某种功能基团，可以快速、容易、安全地固定配体，这种凝胶称偶合胶。配体，这种凝胶称偶合胶。1、常用的偶合胶、常用的偶合胶 2、配体与溴化氰活化的琼脂糖、配体与溴化氰活化的琼脂糖4B的偶合方法：的偶合方法：(1)膨化和洗涤胶膨化和洗涤胶 a.1mM HCl将冷冻干燥的粉末膨胀将冷冻干燥的粉末膨胀15分钟分钟 b.垂熔漏斗过滤下，用盐酸洗涤垂熔漏斗过滤下，用盐酸洗涤(2)偶合配体偶合配体 a、配体溶液的配置，用偶合溶液、配体溶液的配置，用偶合溶液(0.1M NaHCO3,pH8.3,含含0.5M NaCl)溶解配溶解配体蛋白质体蛋白质(5-10mg/ml胶胶)b.用偶合溶液洗涤胶数次用偶合溶液洗涤胶数次 c.立即将配体溶液倒入胶内并搅拌立即将配体溶液倒入胶内并搅拌(不能用电磁搅拌不能用电磁搅拌)。这个步骤要迅速，因为在。这个步骤要迅速，因为在这个这个pH下胶的活性基团易破坏。室温下胶的活性基团易破坏。室温2小时，小时，4过夜。过夜。(3)阻断过剩的活性基团阻断过剩的活性基团.偶合之后偶合之后,一些活性基团仍保留在胶上一些活性基团仍保留在胶上,应采取应采取 a、温和的碱溶液过夜或、温和的碱溶液过夜或Tris-HCl缓冲液缓冲液2小时小时 b、加过量的小的伯胺、加过量的小的伯胺(1M乙醇胺或乙醇胺或0.2M甘氨酸等甘氨酸等)(4)洗涤产物洗涤产物 为了去掉偶合后游离的配体，偶合缓冲液，乙酸缓冲液洗涤产物，以保证没为了去掉偶合后游离的配体，偶合缓冲液，乙酸缓冲液洗涤产物，以保证没有游离配体以离子形式与固定配位体结合，同时洗掉阻断剂。有游离配体以离子形式与固定配位体结合，同时洗掉阻断剂。(5)储存储存 4-8，加抗生剂。加抗生剂。三、基团的特异吸附剂三、基团的特异吸附剂 基团的特异吸附剂是对有关物质的某一基团，而不是基团的特异吸附剂是对有关物质的某一基团，而不是单一物质的亲和。因此同一配体可用于纯化若干物质（例单一物质的亲和。因此同一配体可用于纯化若干物质（例如酶系列），而不需要对每一个被纯化的不同物质准备不如酶系列），而不需要对每一个被纯化的不同物质准备不同的吸附剂。基团特异亲和层析的特异性来自两个方面，同的吸附剂。基团特异亲和层析的特异性来自两个方面，一是配体的选择性，二是使用选择性的洗脱条件。一是配体的选择性，二是使用选择性的洗脱条件。1、常见的基团特异吸附剂、常见的基团特异吸附剂类型类型特异性特异性(1)蛋白蛋白A-琼脂糖琼脂糖CL4BIgG和有关分子的和有关分子的Fc区区(2)刀豆素刀豆素A琼脂糖琼脂糖末端末端 D-吡喃葡糖吡喃葡糖 D-吡喃甘露糖吡喃甘露糖(3)小扁豆凝集素琼脂糖小扁豆凝集素琼脂糖4B与刀豆素与刀豆素A琼脂糖相似，但对简单糖琼脂糖相似，但对简单糖亲和力低亲和力低(4)小麦芽凝集素琼脂糖小麦芽凝集素琼脂糖6MBN乙酰乙酰D葡糖胺葡糖胺(5)poly(u)琼脂糖琼脂糖4B核酸核酸,特别是特别是mRNA(含含poly(A)系列系列poly(u)结合的蛋白结合的蛋白(6)poly(A)琼脂糖琼脂糖4B核酸核酸(含含poly(u)系列系列),RNA特异蛋白特异蛋白(7)赖氨酸琼脂糖赖氨酸琼脂糖4B血纤维蛋白溶酶原，核蛋白体血纤维蛋白溶酶原，核蛋白体RNA(8)蓝琼脂糖蓝琼脂糖CL-6B有有NAD+及及NADP+辅基的酶；血清白蛋辅基的酶；血清白蛋白白(9)5-AMP-琼脂糖琼脂糖4B以以 NAD+为辅基和为辅基和ATP依赖的酶依赖的酶(10)2，5-ADP-琼脂糖琼脂糖4B以以 NADP+为辅基的酶为辅基的酶 2、应用实例、应用实例 用蓝琼脂糖用蓝琼脂糖CL-4B分离醇脱氢酶等，样品为酵母粗提物，溶于分离醇脱氢酶等，样品为酵母粗提物，溶于初始溶剂（初始溶剂（5103M MgCL2，4104M EDTA,2106M 2巯巯基乙醇的基乙醇的0.02M Tris/Hcl溶液，溶液，pH6.4）。载样后洗脱。）。载样后洗脱。初始溶液初始溶液 峰峰1 非活性物质非活性物质 5mM NAD+(A)峰峰 2 醇脱氢酶醇脱氢酶10mM NADP+(B)峰峰 3 6磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶10mM NADP+pH8.6(C)峰峰4 己糖激酶己糖激酶10mM NAD+pH8.6(D)峰峰5 3磷酸甘油醛脱氢酶磷酸甘油醛脱氢酶 四、亲和层析的实验技术四、亲和层析的实验技术1、方法：、方法：色谱柱法色谱柱法2、缓冲液的选择、缓冲液的选择 平衡吸附剂的缓冲液的平衡吸附剂的缓冲液的pH，离子浓度，温度和化学组成必须使不溶性，离子浓度，温度和化学组成必须使不溶性 配位体与蛋白质之间发生强烈的相互作用。配位体与蛋白质之间发生强烈的相互作用。3、样品体积、流速和平衡时间、样品体积、流速和平衡时间（1）样品体积：高亲和力）样品体积：高亲和力 体积要求不严格体积要求不严格 低亲和力低亲和力 为防止从外水流走，体积要小为防止从外水流走，体积要小（2）速度：配位体与大分子间吸附达平衡很缓慢，所以流速宜慢，特别）速度：配位体与大分子间吸附达平衡很缓慢，所以流速宜慢，特别是样品浓度高时，如果浓度低，速度可快。是样品浓度高时，如果浓度低，速度可快。（3）平衡时间）平衡时间 增加平衡时间可以增强相互作用，提高凝胶床分辩力，非特异性吸附增加平衡时间可以增强相互作用，提高凝胶床分辩力，非特异性吸附也有相似效应。也有相似效应。N6(6氨乙基氨乙基)AMP-Sepharose上乳酸脱氢酶结合百分率上乳酸脱氢酶结合百分率 4.蛋白质浓度：亲和力一般和较高的系统、互补酶浓度对吸蛋白质浓度：亲和力一般和较高的系统、互补酶浓度对吸附无大影响，若负载高、流速快，则可能由外水流出。附无大影响，若负载高、流速快，则可能由外水流出。5.温度效应：亲和凝胶吸附作用强度随温度升高而减小。温度效应：亲和凝胶吸附作用强度随温度升高而减小。乳酸脱氢酶与固定的乳酸脱氢酶与固定的AMP相结合的温度效应。洗脱酶所需相结合的温度效应。洗脱酶所需的还原性辅酶的还原性辅酶浓度随温度升高而减小。浓度随温度升高而减小。要重复亲和层析的纯化结果，控制温度十分重要。要重复亲和层析的纯化结果，控制温度十分重要。利用不同温度吸附和洗脱，对纯化作用也很好，例如于利用不同温度吸附和洗脱，对纯化作用也很好，例如于4使酶与吸附剂紧密结合，在使酶与吸附剂紧密结合，在25 以温和条件洗脱。以温和条件洗脱。6、吸附剂容量：、吸附剂容量：由两类相关参数决定：由两类相关参数决定：1）基质、间隔臂、配位体）基质、间隔臂、配位体 2）流速、平衡时间）流速、平衡时间操作容量的测定操作容量的测定 将浓度（将浓度（Co）互补蛋白质持续加到吸附剂上监测流出情况。当吸附）互补蛋白质持续加到吸附剂上监测流出情况。当吸附剂饱和时，溶液以进柱时浓度流出，流出物浓度迅速上升，呈台阶式。剂饱和时，溶液以进柱时浓度流出，流出物浓度迅速上升，呈台阶式。每克吸附剂特异吸附被吸附物的量（每克吸附剂特异吸附被吸附物的量（q）为）为q=(V/m)Co(m为吸附剂质为吸附剂质量量)C0V0VVe洗脱液洗脱液中互补中互补蛋白质蛋白质浓度浓度 体积（体积（ml）7、特异性吸附剂蛋白质的洗脱、特异性吸附剂蛋白质的洗脱（1）洗脱方法）洗脱方法 a分段洗脱法：在惰性蛋白质流出后，更换缓冲液，包分段洗脱法：在惰性蛋白质流出后，更换缓冲液，包括组成，括组成，pH、离子浓度或温度的改变。、离子浓度或温度的改变。b梯度洗脱法：连续改变缓冲液浓度，使洗脱能力逐渐梯度洗脱法：连续改变缓冲液浓度，使洗脱能力逐渐加强。加强。（2）非特异性洗脱法：比较经济，需要改变的因素是缓冲）非特异性洗脱法：比较经济，需要改变的因素是缓冲液的液的pH，离子浓度，介电常数和温度。，离子浓度，介电常数和温度。（3）特殊洗脱技术：）特殊洗脱技术：a利用某些缓冲液特性：例如牛乳糖合成酶的半乳糖基利用某些缓冲液特性：例如牛乳糖合成酶的半乳糖基转移酶在锰离子存在下容易吸附在尿苷二磷酸琼脂糖上，转移酶在锰离子存在下容易吸附在尿苷二磷酸琼脂糖上，用高浓度用高浓度NaCl(0.5-1.0M)不能洗脱，以不能洗脱，以pH8.5硼酸缓冲液硼酸缓冲液可以洗脱。可以洗脱。b选择性断裂基质和配位体之间的键。选择性断裂基质和配位体之间的键。（4）特异性洗脱技术）特异性洗脱技术 a.用与固定配位体相同的游离配位体进行洗脱。用与固定配位体相同的游离配位体进行洗脱。b.用与固定配位体不同的洗脱配位体进行洗脱，这样的层用与固定配位体不同的洗脱配位体进行洗脱，这样的层析具有双重特异性。析具有双重特异性。例如用例如用5mM AMP从从8（6氨己基）氨己基）cAMP琼脂糖上琼脂糖上洗脱依赖于洗脱依赖于cAMP的鱼精蛋白激酶。的鱼精蛋白激酶。c.阴性洗脱：在双底物或多底物存在的亲和系统中，如果阴性洗脱：在双底物或多底物存在的亲和系统中，如果撤掉其中某一底物，使被吸附的大分子解吸附。撤掉其中某一底物，使被吸附的大分子解吸附。例：在前导底物例：在前导底物100uM NADH存在下，乳酸脱氢酶强烈存在下，乳酸脱氢酶强烈吸留在固定的丙酮酸类似物上，在洗脱液中不含吸留在固定的丙酮酸类似物上，在洗脱液中不含NADH时，时，脱氢酶被迅速洗脱。脱氢酶被迅速洗脱。