竞争放射分析放射免疫分析.ppt

竞争放射分析竞争放射分析l放射免疫分析放射免疫分析 （Radio Immuno Assay,RIA）l竞争性蛋白结合分析竞争性蛋白结合分析 （Competitive Protein Binding Assay,CPBA）l放射受体分析放射受体分析 （Radio Receptor Assay,RRA）优点：优点：1、灵敏度高 3、应用范围广 2、特异性强 4、操作简单缺点：缺点：1、生物试剂，稳定性受多因素影响 2、灵敏度难以超过ag水平竞争放射分析的原理竞争放射分析的原理l*P+Q=（*PQ）+*P +P=（PQ）+P *P ：标记物标记物 P ：未标记物未标记物 Q ：特异性结合剂特异性结合剂放射免疫分析原理l*Ag+Ag+Ab=（*AgAb）+（AgAb）+*Ag+Ag 0 Max Min 条件：条件：1、*Ag定量、足量定量、足量 2、Ab限量限量 *AgAb 专用符号：专用符号：1、T 加入的加入的*Ag的放射性计数的放射性计数 2、B *AgAb免疫复合物的放射性计数免疫复合物的放射性计数 3、B0 Ag=0时时*AgAb放射性计数放射性计数 4、F 游离的游离的*Ag的的放射性计数放射性计数 T=B+F 5、NSB 非非特异性结合产生的放射性计数特异性结合产生的放射性计数 6、结合率：、结合率：B/T、B/B0、B/F竞争放射分析的三种基本试剂竞争放射分析的三种基本试剂l标准品l标记物l特异性结合剂标标 准准 品品l化学结构化学结构：应与被测物具有相同的化学结构l化学纯度化学纯度：纯品l化学度量：化学度量：准确l稳定性：稳定性：保持生物活性不变标标 记记 物物l要求要求：1、较高的比活度 2、生物活性与免疫活性：与标记前一致 3、放射化学纯度：95%4、稳定性l鉴定：鉴定：1、最大结合率 2、标准曲线比较法 3、稀释曲线比较法特异性结合剂特异性结合剂l要求：要求：1、亲和力 2、高滴度 3、特异性 4、可长期保存抗抗 血血 清清l抗原l动物选择l佐剂l免疫动物、收获鉴定抗体抗抗血清的鉴定血清的鉴定l亲和力亲和力：指抗体与抗原的结合能力，常用平衡亲和常数指抗体与抗原的结合能力，常用平衡亲和常数KA表示。表示。l特异性：特异性：抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合能力的比较，常用抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合能力的比较，常用 交叉反应率交叉反应率（Cross Reaction）表示表示 交叉反应率交叉反应率=Y/Z100%Y：标准抗原取代标准抗原取代50%结合率所对应的浓度结合率所对应的浓度 Z：类似物取代类似物取代50%结合率所对应的浓度结合率所对应的浓度 交叉反应率测定：以比正常生理浓度高交叉反应率测定：以比正常生理浓度高100倍以上的类似物为测定物进行测定，同倍以上的类似物为测定物进行测定，同时观察置换时观察置换0标准管标准管50时所对应的化学量时所对应的化学量l滴度：滴度：结合结合50%标记抗原时血清的稀释度标记抗原时血清的稀释度单单 克克 隆隆 抗抗 体体l特点：特点：特异性高 抗体成分专一 可反复制备l制备：制备：1、免疫小鼠，制备脾细 胞悬液 2、选择培养，用HAT培 养基筛选杂交瘤细胞 3、检测抗体 4、克隆化其它特异性结合剂其它特异性结合剂l血浆结合球蛋白血浆结合球蛋白l受体蛋白受体蛋白放射性标记放射性标记T4与不同特异性结合剂与不同特异性结合剂结合与游离部分的分离l分离方法的要求分离方法的要求 1、使结合部分与游离部分尽可能完全 分开 2、分得的成分便于作放射性操作 3、分离效果不受外界干扰因素影响 4、操作简便、分离迅速、重复性好 5、试剂来源广泛、价廉易得常用的分离方法常用的分离方法l双抗体法l聚乙二聚法（PEG）l活性炭吸附法l盐析法l微孔滤膜法lSPA法l固相抗体法：塑料、纤维素、凝胶颗粒、多孔玻璃微球l磁化颗粒法l屏蔽计数法竞争放射分析方法的建立竞争放射分析方法的建立反反 应应 方方 式式l平衡法平衡法l顺序加样法顺序加样法lSTAT法法试试 剂剂 用用 量量l高高含量样品含量样品：灵敏度高，B0/T在3050%l低含量样品：高剂量斜率好，B0/T在5070%反反 应应 介介 质质lpH和离子强度和离子强度l反应体积反应体积l添加剂添加剂l样品处理样品处理加加 样样 程程 序序l实验设计、l配制试剂l加未标记物（标准品或待测样品）l加标记物l加特异性结合剂l混匀、温育l加分离剂、分离B与Fl测量各管放射性计数，绘制标准曲线l由标准曲线反求出样品浓度免免 疫疫 放放 射射 分分 析析（Immunoradiometric Assay,IRMA）IRMA的基本原理l单位点系统：单位点系统：Ag +*Ab (Ag-*Ab)+*Ab ImAd-Ag +*Ab ImAd-Ag-*AbIRMA与RIA的主要区别IRMA的实验方法l单位点系统l双位点系统l标记第三抗体法l双标记抗体法IRMA的特点的特点l标记物的放射性活度高l反应达到平衡快l比RIA更高的灵敏度l比RIA的标准曲线范围更宽l比RIA的特异性更高l方法稳定性好l目前仅能检测大抗原数数 据据 处处 理理l作图法作图法l数学模型计算法数学模型计算法几种数学模型几种数学模型l线性内插线性内插l多项式函数多项式函数l样条函数样条函数l直线化模型直线化模型lLogistic模型模型l四参数四参数标准曲线应符合的条件标准曲线应符合的条件lB1/B085%，Bn/B03标准曲线的质控参数标准曲线的质控参数lB0%：3070%，50%最佳最佳lNSB/T5%，NSB/B00.99质质 量量 控控 制制l近期目的：近期目的：通过对测定结果的分析，对本次测定的质量作出评价，并按照预定的要求决定结果的取舍l远期目的：远期目的：通过对不同批测定结果的比较，发现造成成误差的原因，从而改进实验条件或设计，以提高质量误差及引起误差的原因误差及引起误差的原因l试剂试剂l加样误差加样误差l分离误差分离误差l测量误差测量误差l数据处理数据处理l样品的采集与制备样品的采集与制备质量控制指标质量控制指标精精 密密 度度l用用同一实验方法多次检同一实验方法多次检测同一样品所得结果的测同一样品所得结果的一致程度和重复性一致程度和重复性l标准差、变异系数、效标准差、变异系数、效应误差关系、精密度图应误差关系、精密度图准准 确确 度度l测定值与真值的符合程度测定值与真值的符合程度l用回收试验及平行实验来评价用回收试验及平行实验来评价灵灵 敏敏 度度l测定方法的最小可测量测定方法的最小可测量l确定方法：确定方法：零标准管法、零标准管法、t值检验法、值检验法、粗略估计法粗略估计法特特 异异 性性l特异性决定于抗体特异性决定于抗体l常用交叉反应率表示常用交叉反应率表示稳稳 定定 性性l指批间的指批间的重复性重复性l常用指标：常用指标：B0%、NSB、ED、r等等临床有效性临床有效性l与临床的符合程度与临床的符合程度l真阳性率、真阴性率、真阳性率、真阴性率、假阳性率、真阴性率假阳性率、真阴性率内内 部部 质质 控控l批内质控：批内质控：l批间质控：批间质控：外外 部部 质质 控控l目的：目的：提高各实验室之间检测结果的可比性l方法：方法：由一个单位提供方案及外部质量平价用的统一样品，分发到各参加单位进行检测，然后将所得结果反馈于负责单位进行整理分析、评价，用以促进检测质量的提高和资料的可比性。体外体外放射分析的误差放射分析的误差室内质控室内质控室间质控室间质控批内质控批内质控批间质控批间质控批内批内精密精密度与偏听度与偏听偏信倚分偏信倚分析析批间批间精密精密度与偏听度与偏听偏信倚分偏信倚分析析寻找误差产生的原因、寻找误差产生的原因、改进分析工作质量改进分析工作质量对某种对某种分分析方法、析方法、试剂或试试剂或试剂盒进行剂盒进行综合评价综合评价对对不同实不同实验室的分验室的分析工作质析工作质量进行比量进行比较较向向主管部门提供信息，对方法、主管部门提供信息，对方法、试剂（盒）进行改进，促进实验试剂（盒）进行改进，促进实验室内部的质量控制工作室内部的质量控制工作非非放射性标记免疫分析技术放射性标记免疫分析技术l酶酶标记免疫分析法标记免疫分析法l化学发光法化学发光法l时间分辨免疫荧光分析法时间分辨免疫荧光分析法l基因芯片技术基因芯片技术