Chp1分子发光.ppt

分子发光分析法分子发光分析法一、一、分子荧光与磷光产生过程分子荧光与磷光产生过程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum三、荧光的产生与分子结构关系三、荧光的产生与分子结构关系 relation between fluorescence and molecular structure四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素factor influenced fluorescence第一节 分子荧光与磷光molecular luminescenceanalysis molecular fluorescence and phosphorescence2024/5/6 周一一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.1.分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂；分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基基态态(S0)激激发发态态(S1、S2、激激发发态态振振动动能能级级)：吸吸收收特特定定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激激发发态态基基态态：多多种种途途径径和和方方式式(见见能能级级图图)；速速度度最最快快、激发态寿命最短的途径占优势；激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S1、S2；第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T1、T2 ；2024/5/6 周一S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l 2l 1l 3 外转换l 2T2内转换振动弛豫2024/5/6 周一2.2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1 S S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0(0或或1)1)；平平行行自自旋旋比比成成对对自自旋旋稳稳定定(洪洪特特规规则则)，三三重重态态能能级级比比相相应应单重态能级低；单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态；S0T1 禁阻跃迁；禁阻跃迁；通过其他途径进入通过其他途径进入(见见能能级级图图)；进进入入的的几率小；几率小；2024/5/6 周一3.3.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛预振动弛预无辐射跃迁无辐射跃迁 激激发发态态停停留留时时间间短短、返返回回速速度度快快的的途途径径，发发生生的的几几率率大大，发光强度相对大；发光强度相对大；荧光荧光：10-710-9 s,第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态；基态；磷光磷光：10-410s；第一激发第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态；基态；2024/5/6 周一S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l 2l 1l 3 外转换l 2T2内转换振动弛豫2024/5/6 周一非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫振动弛豫：同一：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12 s。内转换内转换：相同多重态电子能级中：相同多重态电子能级中,能级间的无辐射能级交换能级间的无辐射能级交换（S1S0,T2T1）。）。通过通过内转换内转换和和振动弛豫振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。激发单重态的最低振动能级。外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。系间跨越系间跨越：不同多重态：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。轨道耦合进行。2024/5/6 周一辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射荧光发射：电子由：电子由第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态（基态（多为多为 S1 S0跃迁跃迁），），发射波长为发射波长为 2的荧光；的荧光；10-710-9 s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；长；2 2 1；磷光发射磷光发射：电子由电子由第一激发第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态（基态（T1 S0跃迁跃迁）；）；电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁）S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 发光速度很慢：发光速度很慢：10-4100 s。光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。2024/5/6 周一二、激发光谱与荧光二、激发光谱与荧光(磷光磷光)光谱光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 分分子子发发光光的的类类型型（按按激激发发模模式式）：光光致致发发光光、化化学学发发光光、生生物物发发光光、热热致致发发光光、场场致致发光、摩擦发光发光、摩擦发光 2024/5/6 周一1.荧光荧光(磷光磷光)的激发光谱曲线的激发光谱曲线固定测量波长固定测量波长(选最大发射波长选最大发射波长),化合物发化合物发射的荧光射的荧光(磷光磷光)强度与照射光波长的关系曲强度与照射光波长的关系曲线线（图中曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；最多，荧光强度最大；2024/5/6 周一2.2.荧光光谱荧光光谱(或磷光光谱或磷光光谱)固定激发光波长固定激发光波长(选选最大激发波长最大激发波长),),化合物化合物发射的荧光发射的荧光(或磷光强度或磷光强度)与发射光波长关系曲线与发射光波长关系曲线(图中曲线图中曲线II或或III)。2024/5/6 周一2024/5/6 周一3.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激激发发光光谱谱与与发发射射光光谱谱之之间间的的波波长长差差值值。发发射射光光谱谱的的波波长长比比激发光谱的长，激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电电子子跃跃迁迁到到不不同同激激发发态态能能级级，吸吸收收不不同同波波长长的的能能量量(如如能能级级图图 2,1)，产产生生不不同同吸吸收收带带，但但均均回回到到第第一一激激发发单单重重态态的的最最低低振振动动能能级级再再跃跃迁迁回回到到基基态态，产产生生波波长长一一定定的的荧荧光光(如如 2)。c.镜像规则镜像规则 通通常常荧荧光光发发射射光光谱谱与与它它的的吸吸收收光光谱谱（与与激激发发光光谱谱形形状状一一样）成镜像对称关系。样）成镜像对称关系。2024/5/6 周一镜像规则的解释镜像规则的解释 基基态态上上的的各各振振动动能能级级分分布布与与第第一一激激发发态态上上的的各各振振动动能能级级分布类似；分布类似；基基态态上上的的零零振振动动能能级级与与第第一一激激发发态态的的二二振振动动能能级级之之间间的的跃跃迁迁几几率率最最大大，相相反反跃跃迁也然迁也然。2024/5/6 周一200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱2024/5/6 周一三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure 1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（荧光量子产率（）：）：荧荧光光量量子子产产率率与与激激发发态态能能量量释释放放各各过过程程的的速速率率常常数数有有关关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；如外转换过程速度快，不出现荧光发射；2024/5/6 周一(3)荧光寿命荧光寿命激发光除去后，分子荧光强度降至最大荧光强度的激发光除去后，分子荧光强度降至最大荧光强度的1/e所需的时间（所需的时间（t），用），用t表示。表示。激发时激发时t0和除去激发光后时间和除去激发光后时间t时的荧光强度时的荧光强度F0和和Ft与与t和和t的关系为的关系为 利用利用 可计算荧光寿命。利用分子荧光寿命的差别，可计算荧光寿命。利用分子荧光寿命的差别，可进行荧光物质混合物的分析，如时间分辨荧光法可进行荧光物质混合物的分析，如时间分辨荧光法2024/5/6 周一2.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1）跃跃迁迁类类型型：*的的荧荧光光效效率率高高，系系间间跨跨越越过过程程的的速速率率常数小，有利于荧光的产生；常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚刚性性平平面面结结构构：可可降降低低分分子子振振动动，减减少少与与溶溶剂剂的的相相互互作作用用，故故具具有有很很强强的的荧荧光光。如如荧荧光光素素和和酚酚酞酞有有相相似似结结构构，荧荧光光素有很强的荧光，酚酞却没有。素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增上有供电基，使荧光增强。强。2024/5/6 周一2024/5/6 周一四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素 relation between fluorescence and molecular structure 影响荧光强度的影响荧光强度的外部因素外部因素1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除除一一般般溶溶剂剂效效应应外外，溶溶剂剂的的极极性性、氢氢键键、配配位位键键的的形形成成都将使化合物的荧光发生变化；都将使化合物的荧光发生变化；2.2.温度的影响温度的影响 荧荧光光强强度度对对温温度度变变化化敏敏感感，温温度度增增加加，外外转转换换去去活活的的几几率增加率增加。3.溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需要严格控制；2024/5/6 周一大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液光性质受溶液pH的影响很大的影响很大共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长有各自的荧光效率和荧光波长例：例：苯酚苯酚离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失pH1有有荧光荧光pH13无荧光无荧光2024/5/6 周一但但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光分子形式无荧光，离子化后显荧光例：例：苯酚苯酚有荧光有荧光无荧光无荧光另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性2024/5/6 周一4.4.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象 自自吸吸现现象象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；2024/5/6 周一5.5.荧光猝灭荧光猝灭 荧荧光光熄熄灭灭剂剂：卤卤族族离离子子、重重金金属属离离子子、硝硝基基化化合合物物、重重氮化合物及羰基化合物等。氮化合物及羰基化合物等。指指荧荧光光物物质质分分子子与与溶溶剂剂分分子子或或溶溶质质分分子子的的相相互互作作用用引引起起荧光强度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。荧光强度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。6.6.表面活性剂的影响表面活性剂的影响 表表面面活活性性剂剂形形成成胶胶束束，荧荧光光物物质质被被分分散散、固固定定在在胶胶束束中中，胶胶束束起起到到遮遮蔽蔽作作用用，减减弱弱了了荧荧光光质质点点之之间间的的碰碰撞撞，减减少少了了分分子无辐射跃迁，增加了荧光效率，增加了荧光强度。子无辐射跃迁，增加了荧光效率，增加了荧光强度。2024/5/6 周一7.7.散射光的影响散射光的影响 对荧光测定产生干扰对荧光测定产生干扰 瑞利光瑞利光：发射与激发光相同的光：发射与激发光相同的光 拉拉曼曼光光：发发射射比比激激发发光光波波长长较较长长（Stokes线线）或或较较短短（反（反Stokes线）的光线）的光 散散射射光光强强度度与与激激发发光光波波长长(exex)有有关关，荧荧光光波波长长与与 ex无无关关，通过选择适当的通过选择适当的ex可排除或降低散射光的干扰。可排除或降低散射光的干扰。2024/5/6 周一散 射 光 的 干 扰 示 意Inm320360Inm320448Inm350400Inm350448ABCDA,C为硫酸（0.05mol/L)在不同激发光下的干扰峰情况B,D为硫酸奎宁在不同激发光下的荧光和干扰峰情况2024/5/6 周一五、磷光分析法五、磷光分析法 分子磷光与分子荧光光谱的主要差别是磷光是第一激发单重态的最低能级，经系间跨越系间跨越跃迁到第一激发三重态，并经振动弛豫振动弛豫至最低振动能级，然后跃迁回到基态发生的。与荧光相比，磷光具有如下三个特点：（1）磷光辐射的波长比荧光长）磷光辐射的波长比荧光长 分子的T1态能量比S1态低。（2）磷光的寿命比荧光长）磷光的寿命比荧光长 由于荧光是S1 S0跃迁产生的，这种跃迁是自旋许可的跃迁，因而S1态的辐射寿命通常在10-7 10-9s，磷光是T1 S0跃迁产生的，这种跃迁属自旋禁阻的跃迁，其速率常数要小，因而辐射寿命要长，大约为10-4 10s，（3）磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子敏感。磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子敏感。2024/5/6 周一1.低温磷光低温磷光 由于激发三重态的寿命长，使激发态分子发生 T1 S0这种分子内部的内转化非辐射去活化过程以及激发态分子与周围的溶剂分子间发生碰撞和能量转移过程，或发生某些光化学反应的几率增大，这些都将使磷光强度减弱，甚至完全消失。为减少这些去活化过程的影响，通常应在低温下测量磷光。2024/5/6 周一 低温磷光分析中，低温磷光分析中，液氮液氮是最常用的合适的冷却剂。因此要是最常用的合适的冷却剂。因此要求所使用的溶剂，在液氮温度（求所使用的溶剂，在液氮温度（7777K K）下应具有足够的下应具有足够的粘度粘度并能并能形成透明的刚性玻璃体形成透明的刚性玻璃体，对所分析的试样应具有，对所分析的试样应具有良好的良好的溶解特性溶解特性。试样的刚性可减少荧光的碰撞猝灭。试样的刚性可减少荧光的碰撞猝灭。溶剂应易于提纯，以除去芳香族和杂环化合物等杂质。溶剂应易于提纯，以除去芳香族和杂环化合物等杂质。溶剂应在所研究的光谱区域内没有很强的吸收和发射。最常溶剂应在所研究的光谱区域内没有很强的吸收和发射。最常用的溶剂是用的溶剂是EPAEPA，它由乙醇、异戊烷和二乙醚按体积比为它由乙醇、异戊烷和二乙醚按体积比为2 2：5 5：5 5混合而成。使用混合而成。使用含有重原子的混合溶剂含有重原子的混合溶剂IEPAIEPA（由由EPAEPA：碘甲烷碘甲烷=10=10：1 1组成），有利于系间跨越跃迁，可以增加磷光组成），有利于系间跨越跃迁，可以增加磷光效应。效应。2024/5/6 周一 含重原子的溶剂，由于重原子的高核电荷引起或增强了溶质分子的自旋-轨函耦合作用，从而增大了 S0 T1吸收跃迁和S1T1系间跨越跃迁的几率，有利于磷光的发生和增大磷光的量子产率。这种作用称为外部重原子效应外部重原子效应。当分子中引入重原子取代基，例如，当芳烃分子中引入杂原子或重原子取代基时，也会发生内部重原子效应，导致磷光量子效率的提高。2024/5/6 周一2.2.室温磷光室温磷光 由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择的限制等因素，从而发展了多种室温磷光法（RTP）。（1 1）固体基质室温磷光法（固体基质室温磷光法（SS-RTPSS-RTP）此法基于测量室温下吸附于固体基质上吸附于固体基质上的有机化合物所发射的磷光。所用的载体种类较多，有纤维素载体（如滤纸、玻璃纤维）、无机载体（如硅胶、氧化铝）以及有机载体（如乙酸钠、聚合物、纤维素膜）等。理想的载体理想的载体是既能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加其刚性，并能减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程，而本身又不产生磷光背景。2024/5/6 周一（2 2）胶束增稳的溶液室温磷光法（）胶束增稳的溶液室温磷光法（MS-RTPMS-RTP）当溶液中表面活性剂的浓度达到临界胶束浓度后，便相互聚集形成胶束。由于这种胶束的多相性，改变了磷光团的微环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理性质，减小了内转化和碰撞能减小了内转化和碰撞能量损失量损失等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测量室温磷光。利用胶束稳定的因素，结合重原子效应，并对利用胶束稳定的因素，结合重原子效应，并对溶液除氧，是溶液除氧，是MS-RTP MS-RTP 的三个要素。的三个要素。2024/5/6 周一（3 3）敏化溶液室温磷光法（）敏化溶液室温磷光法（SS-RTPSS-RTP）该法在没有表面活性剂存在没有表面活性剂存在的情况下获得溶液的室温磷光。分析物质被激发后并不发射荧光，而是经过系间跨越系间跨越过程衰减变至最低激发三重态。当有某种合适的能量受体存在时，发生了由分析物质分析物质到受体到受体的三重态能量转移转移，最后通过测量受体所发受体所发射的室温磷光强度射的室温磷光强度而间接测定该分析物质。在这种方法中，分析物质本身并不发磷光，而是引发受体发磷光。2024/5/6 周一2024/5/6 周一2024/5/6 周一一、一、仪器与结构流程仪器与结构流程instrument and general process 二、二、荧光分析法和应用荧光分析法和应用fluorescence analysis and application三、三、磷光分析法的应用磷光分析法的应用phosphorescence analysis and application第二节 分子荧光与磷光分析法molecular fluorescence and phosphorescence analysis 2024/5/6 周一一、仪器结构流程一、仪器结构流程 测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由四四个个部部分分组组成成：激激发发光光源源、样样品品池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。特殊点特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：基本流程如图：单单色色器器：选选择择激激发发光光波波长长的的第第一一单单色色器器和和选选择择发发射射光光(测测量量)波波长长的的第第二二单单色色器；器；光光源源：氙氙灯灯和和高高压压汞汞灯灯，染染料料激激光光器器(可可见见与与紫紫外外区区)检测器：检测器：光电倍增管光电倍增管。2024/5/6 周一仪仪器器光光路路图图2024/5/6 周一荧光分光光度计分类荧光分光光度计分类滤光片-荧光计滤光片-光栅荧光分光光度计双光栅荧光分光光度计2024/5/6 周一同步扫描技术同步扫描技术 根根据据激激发发和和发发射射单单色色器器在在扫扫描描过过程程中中彼彼此此间间所所保保持持的的关关系系，同同步步扫扫描描可可分分为为固固定定波波长长差差()和和固固定定能能量量差差及及可可变波长三种；变波长三种；同同步步扫扫描描技技术术可可简简化化光光谱谱，谱谱带带变变窄窄，减减少少光光谱谱重重叠叠，提提高高分分辨辨率；率；如图如图。合适的合适的可可减少光谱重叠减少光谱重叠；酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸的的荧荧光光激激发发光光谱谱相相似似，发发 射射 光光 谱谱 严严 重重 重重 叠叠，但但156060nmnm时时，只只显显示示色色氨酸的特征光谱，实现分别测定。氨酸的特征光谱，实现分别测定。2024/5/6 周一可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷磷)光光谱图光光谱图2024/5/6 周一磷光检测磷光检测 荧荧光光计计上上配配上上磷磷光光测测量量附附件件即即可可对对磷磷光光进进行行测测量量。在在有有荧光发射的同时测量磷光。荧光发射的同时测量磷光。测量方法：测量方法：（1 1）通通常常借借助助于于荧荧光光和和磷磷光光寿寿命命的的差差别别，采采用用磷磷光光镜的装置将荧光隔开。镜的装置将荧光隔开。（2 2）采采用用脉脉冲冲光光源源和和可可控控检测及时间分辨技术。检测及时间分辨技术。室室温温测测量量时时，不不需需要要杜瓦瓶。杜瓦瓶。2024/5/6 周一二、荧光分析方法与应用二、荧光分析方法与应用1.1.特点特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级 检测下限：0.10.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少 缺点缺点：应用范围小。2024/5/6 周一2.2.定性分析定性分析激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱与纯品作对照与纯品作对照2024/5/6 周一3.3.定量依据与方法定量依据与方法(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ：If=Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律：Ia=I0(1-10-l c)If=I0(1-10-l c)=I0(1-e-2.3 l c)浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3 I0 l c =Kc2024/5/6 周一（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法：配配制制一一系系列列标标准准浓浓度度试试样样测测定定荧荧光光强强度度，绘绘制制标标准准曲曲线线，再再在在相相同同条条件件下下测测量量未未知知试试样样的的荧荧光光强强度度，在在标标准准曲曲线线上求出浓度；上求出浓度；比较法：比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；线性方程组法线性方程组法2024/5/6 周一4.4.荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约6060多种元素。多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 见表见表 2024/5/6 周一2024/5/6 周一2024/5/6 周一(3)3)在中药研究中的应用在中药研究中的应用 直直接接荧荧光光法法：测测定定中中草草药药中中本本身身有有荧荧光光的的成成分分，如如芦荟大黄素的测定芦荟大黄素的测定 荧荧光光衍衍生生物物法法：与与合合适适的的试试剂剂生生成成有有特特异异荧荧光光的的衍衍生物，如包公腾甲素的荧光分析生物，如包公腾甲素的荧光分析 化化学学引引导导荧荧光光法法：利利用用化化学学方方法法使使一一些些自自身身不不能能产产生生荧荧光光的的化化合合物物转转变变为为荧荧光光化化合合物物，如如通通过过氧氧化化还还原原、水解、缩合反应、配合反应等；如蕃泻苷的测定水解、缩合反应、配合反应等；如蕃泻苷的测定2024/5/6 周一荧光熄灭法：荧光熄灭法：利用某些物质使荧光物质的荧光熄灭的利用某些物质使荧光物质的荧光熄灭的性质，间接的测定其含量性质，间接的测定其含量胶束增敏荧光分析法：胶束增敏荧光分析法：利用表面活性剂（如十二烷基利用表面活性剂（如十二烷基磺酸钠）的胶束溶液能使荧光物质增溶、增敏及增稳磺酸钠）的胶束溶液能使荧光物质增溶、增敏及增稳的特点，将弱荧光、荧光不稳定及溶解度小的物质溶的特点，将弱荧光、荧光不稳定及溶解度小的物质溶解在表面活性剂的胶束溶液中，再进行荧光测定以提解在表面活性剂的胶束溶液中，再进行荧光测定以提高灵敏性和稳定性高灵敏性和稳定性2024/5/6 周一荧光分析方法荧光分析方法同步荧光分析法同步荧光分析法三位荧光光谱分析法三位荧光光谱分析法时间分辨和相分辨荧光分析法时间分辨和相分辨荧光分析法荧光偏振测定荧光偏振测定低温荧光分析法低温荧光分析法动力学荧光分析法动力学荧光分析法空间分辨荧光分析技术空间分辨荧光分析技术荧光免疫分析法荧光免疫分析法导数荧光分析法导数荧光分析法2024/5/6 周一三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用1.1.稠环芳烃分析稠环芳烃分析 采采取取固固体体表表面面室室温温磷磷光光分分析析法法快快速速灵灵敏敏测测定定稠稠环环芳芳烃烃和和杂环化合物（致癌物质）；见表杂环化合物（致癌物质）；见表2.2.农药、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱，烟碱、降烟碱、新烟碱，2 2，4-4-D D等分析等分析 检测限检测限0.01 0.01 g/cmg/cm-3-3 3.3.药物分析和临床分析药物分析和临床分析 见表见表2024/5/6 周一2024/5/6 周一2024/5/6 周一一、一、基本原理基本原理principle 二、化学发光分析的特点二、化学发光分析的特点characteristics三三 装置与技术装置与技术instrument and technology第三节第三节 化学发光分析法化学发光分析法chemiluminescenceanalysis2024/5/6 周一一、基本原理 principle1.1.化学发光反应化学发光反应 在在化化学学反反应应过过程程中中，某某些些化化合合物物接接受受能能量量而而被被激激发发，从从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A +B =C +D*D*D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；发光持续时间较长，反应持续进行；化化学学发发光光反反应应存存在在于于生生物物体体(萤萤火火虫虫、海海洋洋发发光光生生物物)中中，称生物发光称生物发光(bioluminescence)。2024/5/6 周一2.2.化学发光效率化学发光效率化学效率：化学效率：发光效率：发光效率：时刻时刻t t 的化学发光强度的化学发光强度(单位时间发射的光量子数单位时间发射的光量子数)：d dc c/d dt t 分析物参加反应的速率；分析物参加反应的速率；2024/5/6 周一3.3.化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：对于一级动力学反应：dc/dt=Kc；K 为反应速率常数。为反应速率常数。定性依据：定性依据：（1 1）在一定条件下，峰值光在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，在一定条件下，曲线下面积为发光总强度曲线下面积为发光总强度(S)，其其与被与被测物浓度成线性：测物浓度成线性：2024/5/6 周一4.4.化学发光反应的类型化学发光反应的类型（1 1）气相化学发光反应）气相化学发光反应a.一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO +O3 NO2*NO2*NO2+h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与氧原子与SO2、NO、CO的发光反应的发光反应 O3 O2+O（1000 C石英管中进行）SO2 +O+O SO2*+O2 SO2*SO2*+h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；2024/5/6 周一 O3 O2+O（1000 C石英管中进行石英管中进行）NO +O NO2*NO2*NO2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：4001400nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3；氧原子与氧原子与CO的发光反应：的发光反应：CO +O CO2*CO2*CO2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：300500nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3；氧原子与氧原子与NO的发光反应：的发光反应：2024/5/6 周一c.乙烯与乙烯与O3的发光反应的发光反应 乙烯与乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：反应，生成激发态乙醛：CH2O*CH2O+h 最大发射波长：最大发射波长：435nm；对对O3的特效反应；线性响应的特效反应；线性响应范围范围1 ng/cm-3 1 g/cm-3；2024/5/6 周一（2 2）火焰中的化学发光反应）火焰中的化学发光反应 在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮一氧化氮 NO +H HNO*HNO*HNO +h 发射光谱范围：发射光谱范围：660770nm；最大发射波长：最大发射波长：690nm；在在富氢火焰中：富氢火焰中：NO2 +2H NO+H2O 该反应十分迅速；该反应十分迅速；2024/5/6 周一b.硫化物硫化物 挥发性硫化物挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等等在富在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2 +2H2 S +2H2O S +S 2S2*S2*S2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：350460nm；最大发射波长：最大发射波长：394nm；灵敏度：灵敏度：0.2 ng/cm-3；发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。2024/5/6 周一（3 3）液相中的化学发光反应）液相中的化学发光反应 机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.150.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：反应过程：该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：反应过程：2024/5/6 周一5.5.化学与生物发光分析的应用化学与生物发光分析的应用（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等（2）可检测低至可检测低至 10-9 mol/L 的的H2O2；（3）间接测定某些生物试样间接测定某些生物试样 氨基酸氨基酸 +O2 酮酸酮酸 +NH3 +H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖葡萄糖 +O2+H2O 葡萄糖酸葡萄糖酸 +H2O2 通过测定生成的通过测定生成的H2O2，确定，确定氨基酸、葡萄糖氨基酸、葡萄糖含量。含量。葡萄糖氧化酶2024/5/6 周一 草酸二酯草酸二酯(能量提供体能量提供体)+高浓度双氧水高浓度双氧水+稠环芳烃稠环芳烃(能量接能量接受体受体)+金属离子金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷冷光源光源)。2024/5/6 周一生物发光分析应用生物发光分析应用 1 1 在pH 78；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：ATP +LH2+E+Mg2+AMP LH2 E+Mg ppi+2H+pH7-8复合物与氧反应，产生化学发光：AMP LH2 E+O2 氧化荧光素*+AMP+CO2+H2O氧化荧光素*氧化荧光素 +h最大发射波长562nm；2024/5/6 周一生物发光分析应用生物发光分析应用 2 2 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应：NADH+FMA+H+NAD+FMNH2NADH脱氢酶FMNH2+RCHO+O2 FMN+RCOOH+H2O+h黄素酶最大发射波长495 nm；2024/5/6 周一二、特点 characteristics1.1.灵敏度极高灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17。Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量2 2.仪器设备简单仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正；3.3.发射光强度测量无干扰发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰；4.4.线性范围宽线性范围宽5.5.分析速度快分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。2024/5/6 周一2024/5/6 周一2024/5/6 周一三、装置与技术 instrument and technology 装置流程：装置流程：发光反应室发光反应室光检测器光检测器信号放大器信号放大器显示与记录显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静静态态方方式式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；流流动动注注射射方方式式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；2024/5/6 周一