DB21∕T 3257—2020 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体酶联免疫检测方法(辽宁省).pdf

ICS1 1.220一04DB21宁省地方标准DB21/T3257一2020猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体酶联免疫检测方法Me t h o do fELISAf o rPRRSVa n t i b o d yNEQ一30发布2020一05一30实施l-nU冈曰夕,乃乙4一JCn匕，尹八乙辽宁省市 场监督 管理局发布DB21/T3257一2020目次、，生幽目叮舀.1范围.”2规范性引用文件.3缩略语.4原理.5仪器和器材.6试剂.7操作步骤.8试验成立条件与结果判定9检测过程中防止交叉污染的措施10废弃物处理.附录A（资料性附录）试剂配制二DB21/T3257一2020士一口一Rl J本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由动物卫生标准化技术委员会（辽宁）提出，辽宁省农业农村厅归口管理。本标准起草单位：辽宁省农业发展服务中心。本标准协助单位：洛阳现代生物技术研究院有限公司、辽宁佰瑞生物科技有限公司。本标准主要起草人：周晨阳、魏澎、高志峰、魏园 园、王冰、董娜、刘金玲、刘耀川、杨作丰、高原、王连山、马亮亮、潘婷婷、杨嵘长、姜斌、杨太东、于春玲。本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024一23447862;标准起草单位通讯地址：辽宁省动物及产品检疫中心（沈阳市沈河区万柳塘路105号甲），联系电话：024一24229579。DB21/T3257一2020猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体酶联免疫检测方法范围本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体酶联免疫检测方法的技术要求。本标准适用于在生物安全IT级（BSL一2)监测及流行病学调查，适用于猪血清或血浆样以上的实验室进行猪繁殖与 呼吸综合征病毒病的诊断、品中的猪繁殖与 呼吸综合征病毒抗体检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）仅所注日期的版本适用于本文适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T19495.2一2004转基因产品检测 实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本标准。EL1SA：酶联免疫吸附测定（e n z y m e1i n k e di m m u n o s o r b e n ta SSa y)PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒（Po r Ci n eRe p r o d u Ct i v ea n dRe s p i r a t o r ySy n d r o m eVi r u S)PBS：磷酸盐缓冲液（p h oSp h a t eb u f f e rSo l u t i o n)OD：光密度，表示被检测物吸收掉的光密度（叩t i Ca ld e n s i t y)4原理本方法原理是包被板上色被的万絮殖与 呼吸综合征病毒（PRRSV)性抗体反应，形成抗原一抗体复合物，中含有PRRSV抗体，显色深，为阳性，抗原，可与待测样品中的特异1耳加尹入酶标记的二抗，则形成免疫复合物，洗涤后，如待测样品反一分为阴性。5仪器和器材5.1微量可调移液器：50林L一200林L。5.2s m L采血针管5.3冰箱：4士1冰箱，一20士1冰箱。5.4酶标仪5.537恒温培养箱5.6高速台式离心机（离心范围O一20OO0r/m i n)5.7洗板机5.8离心管：4m L离心管、2m L离心管和1.5m L离心管。DB21/T3257一20206试剂注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。6.1猪繁殖与 呼吸综合征病毒抗原包被板。6.2阳性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性猪血清。6.3阴性对照：无猪繁殖与 呼吸综合征病毒抗体猪血清。6.4酶标复合物：过氧化物酶标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体。6.5PBs：磷酸盐缓冲液（0. 01m o l几p H7 .4）配制见第A.1章。6.6洗涤液：配制见第A .2章。6.7样品稀释液：配制见第A .3章。6.8底物溶液：配制见第A .5章。6.9终止液：配制见第A .6 章。7操作步骤注：试验操作过程中涉及生物安全的注意事项依据GB19489实验室生物安全通用要求的规定执行。7.1样品 的采集、前处理与存放7.1.1采样注意事项采集样品及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7.1.2采样工具5m L采血针管和4m L、2m L和1.5m L离心管经121士1OC高压灭菌20m i n。7.1.3样品的采集与前处理采集血液，用离户、机分离上清血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染。试验前将被检血清统一编号，并用样品稀释液车40倍稀释。7.1.4存放前处理后的样品密封装于灭菌高自管Fr 1一牛或一20OC保存或立即检验。7.2EL1SA检测7.2.1在使用前，所有的试剂盒组份应恢复到18一26OC、试剂应轻轻旋转或振荡混匀。7.2.2取出包被板，加入100林L没有稀释的阴性对照和山生刘下，每次检测各加两孔；在相应的孔中加入100林L己经稀释好的样品。7.2.3在37o C条件下温育30m i n（士1m i n）。7.2.4将各孔的液体弃入废液桶，用300林L洗涤液洗涤板孔，共洗涤5次。每次洗悠后应弃去孔内的液体。在最后一次洗涤液弃去后，将孔中残留 的洗涤液在吸水纸上拍干。7.2.5每孔加入100林L酶结合物。7.2.6在37o C条件下温育20m i n（士1m i n）。7.2.7重复步骤7.2.4。7.2.8每孔加入50林L显色液A和50林L显色液B（也可显色液A、B等比例混匀后加100林L）。DB21/T3257一20207.2.9在37o C条件下温育10m i n（士1m i n）。7.2.10每孔加入50林L终止液，终止反应。测量并且记录样品和对照的OD值（450nm)内读值有效。15m i f l8试验成立条件与结果判定8.1试验成立条件阴性对照平均值（NC尤）NC尤：(NCI+NCZ) /2阳性对照平均值（PC尤）PC尤(PCI+PCZ)/2试验成立判断标准：Pc尤一Nc X)0.5;Nc尤毛0.3。如果试验无效，试验中的操作值得怀疑，应按照操作说明书重做一次试验。8.2结果判定样品的计算S/ P=（样品一NC尤）/(PC尤一NC尤）如果样品S护值0.2，样品应判定为抗体阴性。如果样品S护值多0.2，样品应判定为抗体阳性。9检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2一2004的规定执行。10废弃物处理按照农业部关丁印发：病死及病害动物无害化处理技术规范的通知（农医发2017)25号）规定执行。DB21/T3257一2020附录A（资料性附录）试剂配制A.1磷酸盐缓冲液（PBs,0.01m o l几p H7.4 )氯化钠89氯化钾0 .29磷酸二氢钾0 .29十二水磷酸氢二钠2.839蒸馏水加至I000m LA.2洗涤液PBS1000m L吐温一20O.s m LA.3样品稀释液含体积分数为10新生猪血清的洗涤液A.4磷酸盐一柠檬酸缓冲液（p H5.0 )柠檬酸3.269十二水磷酸氢二钠12.99蒸馏水700m LA.5底物溶液用二甲基亚飒3355一四甲基联苯胺（TMB）配成1质量浓度，4OC保存。使用时按下列配方配制底物溶液。磷酸盐一柠檬酸绩冲（夜9.9m L1%3355一四甲基联苯胺0.1m L30双氧水1p LA.6终止液浓硫酸0于认蒸馏水IO0m仁