生化课件第二章.ppt

第第 二二 章章核酸的结构与功能核酸的结构与功能Structure and Function of Nucleic AcidThebiochemistryandmolecularbiologydepartmentofJMUThebiochemistryandmolecularbiologydepartmentofLMUn核核酸酸(nucleicacid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。分子，携带和传递遗传信息。FriedrichMiescher(1844-1895)Friedrich Miescher worked at the Physiological Laboratory of the University of Basel and in Tbingen and is most well known for his discovery of the nucleic acids.(DNA Pioneers and Their Legacy by Ulf Lagerkvist,1998,Yale University Press,ISBN 0-300-07184-1).To read excerpts from this book,click DNA Pioneers.米歇尔米歇尔FriedrichMiescher（18441895）米歇尔，瑞士生物学家，生前工作于巴塞尔大学的生理学米歇尔，瑞士生物学家，生前工作于巴塞尔大学的生理学研究室。以发现核酸而闻名世界。研究室。以发现核酸而闻名世界。米歇尔小时候有严重的听力障碍，因此在童年时代，尽管米歇尔小时候有严重的听力障碍，因此在童年时代，尽管他非常聪明，但总是害羞并很内向。他酷爱音乐，与其父亲一他非常聪明，但总是害羞并很内向。他酷爱音乐，与其父亲一样是一个天才歌手，在学校的学习成绩很好。样是一个天才歌手，在学校的学习成绩很好。1865年米歇尔成年米歇尔成为一名医学生，为一名医学生，1868年获医学博士学位。但听力问题是他成为年获医学博士学位。但听力问题是他成为临床医生的障碍。临床医生的障碍。1868年，米歇尔感兴趣研究白细胞。为了得到足够的白细年，米歇尔感兴趣研究白细胞。为了得到足够的白细胞，他从医院的外科绷带中洗脱脓液的白细胞，分离细胞核，胞，他从医院的外科绷带中洗脱脓液的白细胞，分离细胞核，得到一些粘稠的物质，并经实验证明含有含磷和氮，称为核素。得到一些粘稠的物质，并经实验证明含有含磷和氮，称为核素。随后的研究证明这一物质具有酸性，故称为核酸。这是米歇尔随后的研究证明这一物质具有酸性，故称为核酸。这是米歇尔首次发现了重要的生命物质之一首次发现了重要的生命物质之一核酸。核酸。Reichard,P.J.Biol.Chem.2002;277:13355-13362OswaldT.Avery(1877-1955).埃弗里，埃弗里，O.T.OswaldTheodoreAvery(18771955)美国细菌学家。美国细菌学家。1877年年10月月21日生于加拿大新斯科舍哈利法克日生于加拿大新斯科舍哈利法克斯。斯。1904年毕年毕业于哥伦比亚大学医学院，后到布鲁克林的霍格兰实业于哥伦比亚大学医学院，后到布鲁克林的霍格兰实验室研究并讲授细菌学和免疫学。验室研究并讲授细菌学和免疫学。1913年转到纽约的洛克菲勒研究年转到纽约的洛克菲勒研究所附属医院工作，直到所附属医院工作，直到1948年退休。年退休。他和他和C.麦克劳德、麦克劳德、M.麦卡锡于麦卡锡于1944年共同发现不同型的年共同发现不同型的肺炎双球菌的转化因子肺炎双球菌的转化因子是是DNA。这项实。这项实验第一次证明了遗传物质是验第一次证明了遗传物质是DNA而不是蛋白质。而不是蛋白质。虽然这一发现，虽然这一发现，曾引起争论和怀疑，但的确推动了曾引起争论和怀疑，但的确推动了DNA的研究，直至的研究，直至1953年年DNA双双螺旋结构的发现。他还通过对肺炎双球菌的免疫性研究，提出肺炎螺旋结构的发现。他还通过对肺炎双球菌的免疫性研究，提出肺炎双球菌可根据其免疫的专一性来进行分类，而这种免疫专一性是由双球菌可根据其免疫的专一性来进行分类，而这种免疫专一性是由于不同菌型的荚膜中所含的多糖引起的。由此他建立起对不同型肺于不同菌型的荚膜中所含的多糖引起的。由此他建立起对不同型肺炎双球菌的灵敏检验法。炎双球菌的灵敏检验法。1955年年2月月20日卒于美国田纳西州纳什维日卒于美国田纳西州纳什维尔。尔。一、核酸的发现和研究工作进展一、核酸的发现和研究工作进展 1868年年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取从脓细胞中提取“核素核素”1944年年 Avery等人等人证实证实DNA是遗传物质是遗传物质1953年年 Watson和和Crick发现发现DNA的双螺旋结构的双螺旋结构1968年年 Nirenberg发现发现遗传密码遗传密码1975年年 Temin和和Baltimore发发现现逆转录酶逆转录酶1981年年 Gilbert和和Sanger建建立立DNA 测序方法测序方法1985年年 Mullis发明发明PCR 技术技术1990年年 美国启动美国启动人类基因组计划人类基因组计划(HGP)1994年年 中国人类基因组计划启动中国人类基因组计划启动2001年年 美、英等国美、英等国完成人类基因组计划基本框架完成人类基因组计划基本框架n核酸的分类及分布核酸的分类及分布存在存在于细胞核和于细胞核和线粒体线粒体 分布于细胞核、细胞质、分布于细胞核、细胞质、线粒体线粒体(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，携带遗传信息，并通过复制传递并通过复制传递给下一代。给下一代。是是DNA转录的产物，转录的产物，参与遗传信参与遗传信息的息的复制与复制与表达。某些病毒表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体也可作为遗传信息的载体第一节第一节核酸核酸的化学组成及其一级结构的化学组成及其一级结构The Chemical Component and Primary Structure of Nucleic Acid核酸核酸(DNA和和RNA)核苷酸核苷酸核苷或脱氧核苷核苷或脱氧核苷磷酸磷酸戊糖戊糖碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶核糖核糖脱氧核糖脱氧核糖n核酸组成核酸组成 n分子组成分子组成碱基碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱：嘌呤碱，嘧啶碱戊糖戊糖(ribose)：核糖，脱氧核糖：核糖，脱氧核糖磷酸磷酸(phosphate)一、核苷酸是构成核酸的基本组成单位一、核苷酸是构成核酸的基本组成单位碱基碱基(base)是含氮的杂环化合物。是含氮的杂环化合物。碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤尿嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶胞嘧啶存在于存在于DNA和和RNA中中仅存在于仅存在于RNA中中仅存在于仅存在于DNA中中n碱基碱基嘌呤嘌呤(purine，Pu)腺嘌呤腺嘌呤(adenine,A)鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine,G)嘧啶嘧啶(pyrimidine，Py)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine,T)n碱基的互变异构体碱基的互变异构体 五五种种碱基都能形成酮式碱基都能形成酮式-烯醇式或氨基烯醇式或氨基-亚氨亚氨基的互变异构。这两种异构体的平衡关系受介质基的互变异构。这两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。酸碱环境的影响。n戊糖戊糖（构成（构成RNA）12345核糖核糖(ribose)（构成（构成DNA）脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)n脱氧核苷脱氧核苷嘌呤嘌呤N-9或或嘧啶嘧啶N-1与脱氧核糖与脱氧核糖C-1 通过通过-N-糖苷键糖苷键相连形成相连形成脱氧核苷脱氧核苷(deoxyribonucleoside)。嘌呤嘌呤N-9-9或或嘧啶嘧啶N-1-1与核糖与核糖C-1C-1 通过通过-N-糖糖苷键苷键相连形成相连形成核苷核苷(ribonucleoside)。n核苷核苷NNNN9NH2OOHOHHHHCH2OHH12糖苷键糖苷键-CH3胸腺嘧啶脱氧核苷胸腺嘧啶脱氧核苷核苷或脱氧核苷与磷酸通过核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯键酯键结合构成结合构成核苷酸核苷酸(ribonucleotide)或或脱氧核苷酸脱氧核苷酸(deoxyribonucleotide)。n核苷酸核苷酸(ribonucleotide)NNNN9NH2OO HO HHHHCH2H1 2OPO-HOO糖苷键糖苷键酯键酯键n多磷酸核苷酸多磷酸核苷酸RNA和DNA的基本结构单位RNA的基本结构单位的基本结构单位DNA的基本结构单位的基本结构单位腺嘌呤核苷酸(adenosinemonophosphate,AMP)腺嘌呤脱氧核苷酸(deoxyadenosinemonophosphate,dAMP)鸟嘌呤核苷酸(guanosinemonophosphate,GMP)鸟嘌呤脱氧核苷酸(deoxyguanosinemonophosphate,dGMP)胞嘧啶核苷酸(cytidinemonophosphate,CMP)胞嘧啶脱氧核苷酸(deoxycytidinemonophosphate,dCMP)尿嘧啶核苷酸(uridinemonophosphate,UMP)胸腺嘧啶脱氧核苷酸(deoxythymidinemonophosphate,dTMP)Nucleic AcidsNucleotidephosphateRibonucleoside(deoxyribonucleoside)basePentosePurine(A、G)Pyrimidine(C、T、U)deoxyriboseribose环化核苷酸：环化核苷酸：cAMP、cGMP，是细胞信是细胞信号转导中的第二信使。号转导中的第二信使。cAMPn核苷酸衍生物核苷酸衍生物NADP+NAD+l含核苷酸的生物活性物质：含核苷酸的生物活性物质：NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD等都含有等都含有AMP二、二、DNA是脱氧核苷酸通过是脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键连接形成的大分子连接形成的大分子一一个个脱脱氧氧核核苷苷酸酸3 3 的的羟羟基基与与另另一一个个核核苷苷酸酸5 5 的的-磷磷酸酸基基团团缩缩合合形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键(phosphodiesterbond)。多多个个脱脱氧氧核核苷苷酸酸通通过过磷磷酸酸二二酯酯键键构构成成了了具具有有方方向向性性的的线线性性分分子子，称称为为多多聚聚脱脱氧氧核核苷苷酸酸(polydeoxynucleotide)，即即DNA链链。5-末末端端3-末末端端CGA磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键交交替替的的磷磷酸酸基基团团和和戊戊糖糖 构构 成成 了了 DNA的的 骨骨 架架 (backbone)。DNA链的方向是链的方向是5 5 3 3 三、三、RNA也是具有也是具有3,5-磷酸二酯键的磷酸二酯键的线性大分子线性大分子RNA也也是是多多个个核核苷苷酸酸分分子子通通过过酯酯化化反反应应形形成的线性大分子，并且具有方向性成的线性大分子，并且具有方向性；RNA的戊糖是核糖；的戊糖是核糖；RNA的嘧啶是胞嘧啶和尿嘧啶。的嘧啶是胞嘧啶和尿嘧啶。n定义定义核核酸酸中中核核苷苷酸酸的的排排列顺序。列顺序。由由于于核核苷苷酸酸间间的的差差异异主主要要是是碱碱基基不不同同，所所以也称为以也称为碱基序列碱基序列。55端端3端端CGA四、核酸的一级结构是四、核酸的一级结构是核苷酸的排列顺序核苷酸的排列顺序AGP5 PTPGPCPTPOH3 n书写方法：书写方法：5 pApCpTpGpCpT-OH3 5 ACTGCT3 线条式文字式核核酸酸分分子子的的大大小小常常用用碱碱基基(base或或kilobase)数数目目来表示。来表示。小小 的的 核核 酸酸 片片 段段(80)。rRNA与与核核蛋蛋白白体体蛋蛋白白结结合合组组成成核核蛋蛋白白体体(ribosome)，为蛋白质的合成提供场所。，为蛋白质的合成提供场所。三、以三、以rRNA为组分的核蛋白体是为组分的核蛋白体是蛋白质合成的场所蛋白质合成的场所核蛋白体的组成核蛋白体的组成原核生物（以大肠杆菌为例）原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸个核苷酸18S1874个核苷酸个核苷酸蛋白质蛋白质21种种占总重量的占总重量的40%33种种占总重量的占总重量的50%大亚基大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸28S5.8S5S4718个核苷酸个核苷酸160个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸蛋白质蛋白质31种种占总重量的占总重量的30%49种种占总重量的占总重量的35%n大肠杆菌的核蛋白体大肠杆菌的核蛋白体n1818S rRNA的二级结构的二级结构n蛋白质合成时形成的复合体蛋白质合成时形成的复合体*rRNA的功能的功能参参与与组组成成核核蛋蛋白白体体，作作为为蛋蛋白白质质生生物物合成的场所。合成的场所。RNA组组学学是是研研究究细细胞胞内内snmRNA的的种种类类、结结构构和和功功能能。同同一一生生物物体体内内不不同同种种类类的的细细胞胞、同同一一细细胞胞在在不不同同时时空空状状态态下下snmRNAs表表达达谱谱的变化，以及与功能之间的关系。的变化，以及与功能之间的关系。四、四、snmRNA参与了基因表达的调控参与了基因表达的调控细细胞胞的的不不同同部部位位存存在在的的许许多多其其他他种种类类的的小小分分子子RNA，统统称称为为非非mRNA小小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)。nsnmRNAsl核内小核内小RNAl核仁小核仁小RNAl胞质小胞质小RNAl催化性小催化性小RNAl小片段干涉小片段干涉 RNA 参与参与hnRNA的加工剪接的加工剪接nsnmRNAs的的种类种类nsnmRNAs的的功能功能n核酶核酶某某些些小小RNA分分子子具具有有催催化化特特定定RNA降降解解的的活活性性，这这种种具具有有催催化化作作用用的的小小RNA亦亦被被称称为为核核酶酶(ribozyme)或或催催化化性性RNA(catalyticRNA)。siRNA是是生生物物宿宿主主对对外外源源侵侵入入的的基基因因表表达达的的双双链链RNA进进行行切切割割所所产产生生的的特特定定长长度度和和特特定定核核酸序列的小片段酸序列的小片段RNA。siRNA可可以以与与外外源源基基因因表表达达的的mRNA相相结结合合，并诱发这些并诱发这些mRNA的降解。的降解。基基于于此此机机理理，人人们们发发明明了了RNA干干扰扰(RNAinterference，RNAi)技术。技术。n小片段干扰小片段干扰RNAn原核生物基因表达的特异性原核生物基因表达的特异性五、核酸在真核细胞和原核细胞中五、核酸在真核细胞和原核细胞中表现了不同的时空特性表现了不同的时空特性n真核生物基因表达的特异性真核生物基因表达的特异性核酸的理化性质核酸的理化性质The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid第四节第四节核酸的酸碱及溶解度性质核酸的酸碱及溶解度性质l核酸为多元酸，具有较强的酸性。核酸为多元酸，具有较强的酸性。核酸的高分子性质核酸的高分子性质l粘度：粘度：DNARNA dsDNA ssDNAl沉沉降降行行为为:不不同同构构象象的的核核酸酸分分子子的的沉沉降降的的速速率率有有很很大大差差异异，这这是是超超速速离离心心法法提提取取和和纯纯化核酸的理论基础。化核酸的理论基础。核酸在波长核酸在波长260nm处有强烈的吸收，是处有强烈的吸收，是由由碱基的共轭双键碱基的共轭双键所决定的。这一特性常用作所决定的。这一特性常用作核酸的定性和定量分析。核酸的定性和定量分析。一、核酸分子具有强烈的紫外吸收一、核酸分子具有强烈的紫外吸收n碱基的紫外吸收光谱碱基的紫外吸收光谱DNA或或RNA的定量的定量A260=1.0相当于相当于50g/ml双链双链DNA(dsDNA)40g/ml单链单链DNA(ssDNAorRNA)20g/ml寡核苷酸寡核苷酸确定样品中核酸的纯度确定样品中核酸的纯度纯纯DNA:A260/A280=1.8纯纯RNA:A260/A280=2.0n紫外吸收的应用紫外吸收的应用二、二、DNA变性是双链解离为单链的过程变性是双链解离为单链的过程在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA双链解双链解开成两条单链开成两条单链的过程。的过程。n定义定义DNA变性的本质是双链间氢键的断裂。变性的本质是双链间氢键的断裂。协同性的协同性的DNA解链解链高温或极端的高温或极端的pHnDNA的变性的变性DNA变性的本变性的本质是双链间氢质是双链间氢键的断裂键的断裂n部分变性部分变性DNA的电镜图像的电镜图像增增色色效效应应(hyperchromiceffect)：DNA变变性性时其溶液时其溶液OD260增高增高的现象。的现象。nDNA解链时的解链时的紫紫外吸收变化外吸收变化nDNA的解的解链链曲线曲线连连续续加加热热DNA的的过过程程中中以以温温度度相相对对于于A260值值作作图图，所所得得的的曲线称为曲线称为解链曲线解链曲线。解解链链过过程程中中，紫紫外外吸吸光光度度的的变变化化达达到到最最大大变变化化值值的的一一半半时时所所对对应应的温度。的温度。解链温度解链温度(meltingtemperature，Tm)G+C含量越高，解链温度就越高。含量越高，解链温度就越高。n解链解链曲线曲线的变化的变化经验公式：经验公式：(G+C)%=(Tm-69.3)2.44三、变性的核酸可以复性或形成三、变性的核酸可以复性或形成杂交双链杂交双链当当变变性性条条件件缓缓慢慢地地除除去去后后，两两条条解解离离的的互互补补链链可可重重新新配配对对，恢恢复复原原来来的的双双螺螺旋旋结结构构，这这一一现现象称为象称为DNA复性复性(renaturation)。减色效应：减色效应：DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低。降低。热热变变性性的的DNA经经缓缓慢慢冷冷却却后后即即可可复复性性，这这一一过程称为过程称为退火退火(annealing)。不不同同种种类类的的DNA单单链链分分子子或或RNA分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，只只要要两两种种单单链链分分子子之之间间存存在在着着一一定定程程度度的的碱碱基基配配对对关关系系，在在适适宜宜的的条条件件可可以以在在不不同同的分子间形成的分子间形成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。这这种种杂杂化化双双链链可可以以在在不不同同的的DNA与与DNA之之间间形形成成，也也可可以以在在DNA和和RNA分分子子间间或或者者RNA与与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。n核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization)DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子n核酸分子杂交核酸分子杂交核核酸酸分分子子杂杂交交研究研究DNA分子中某一种基因的位置。分子中某一种基因的位置。监定两种核酸分子间的序列相似性。监定两种核酸分子间的序列相似性。检测某些专一序列在待检样品中存在与否。检测某些专一序列在待检样品中存在与否。n核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用Southern blotting DNA分子之间的杂交分子之间的杂交 Northern blotting RNA分子之间的杂交分子之间的杂交 Western blotting 蛋白之间的相互作用蛋白之间的相互作用利用核酸的杂交可以研究不同来利用核酸的杂交可以研究不同来源的核酸序列的相似性。源的核酸序列的相似性。第五节第五节 核酸酶核酸酶 Nuclease依据底物不同分类依据底物不同分类DNA酶酶(deoxyribonuclease,DNase)：专一降解专一降解DNA。RNA酶酶(ribonuclease,RNase)：专一降解专一降解RNA。依据切割部位不同依据切割部位不同核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。性限制性核酸内切酶。核酸外切酶：核酸外切酶：53或或35核酸外切酶。核酸外切酶。核酸酶核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。是指所有可以水解核酸的酶。5533外切位点外切位点外切位点外切位点内切位点内切位点内切位点内切位点参与参与DNA的合成、修复以及的合成、修复以及RNA的剪接。的剪接。清清除除多多余余的的、结结构构和和功功能能异异常常的的核核酸酸，以以及及侵入细胞的外源性核酸。侵入细胞的外源性核酸。降解食物中的核酸。降解食物中的核酸。体外重组体外重组DNA技术中的重要工具酶技术中的重要工具酶。n核酸酶的功能核酸酶的功能 核核 酶酶u催化性催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脱氧人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。u催化性催化性RNA(ribozyme)序列特异性的核酸内切酶序列特异性的核酸内切酶参与参与RNA转录后加工修饰转录后加工修饰作为针对病毒或肿瘤基因的药物降解作为针对病毒或肿瘤基因的药物降解mRNA。