遗传病的基因诊断.ppt

遗传病的遗传病的基因诊断基因诊断药学药学2 2班班 辛鑫辛鑫一、一、基因诊断的概念基因诊断的概念及常用技术及常用技术基因诊断基因诊断利用分子生物学技术，利用分子生物学技术，从从DNA/RNADNA/RNA水平检测基因的存水平检测基因的存在在,分析基因的结构变异和表分析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。达状态，从而对疾病作出诊断。（一一）基本概念基本概念（二二）基因诊断常用方法基因诊断常用方法核酸分子杂交核酸分子杂交PCRPCRDNADNA序列测定序列测定 DNADNA芯片技术芯片技术1 1、核酸杂交核酸杂交基本原理基本原理-核酸变性和复性理核酸变性和复性理论论 即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链形成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存核苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在与其互补的同源核苷酸序列。在与其互补的同源核苷酸序列。probeprobe核酸杂交的关键要素核酸杂交的关键要素probe DNAprobe DNAtarget DNAtarget DNAsignal detectionsignal detection核酸杂交方法分类核酸杂交方法分类按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。中。固相杂交分类固相杂交分类Southern 印记杂交Northern 印记杂交斑点杂交原位杂交Southern blotSouthern blot是最经典的基因分析方法，不但能检出特异是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的的DNADNA片段，而且能进行定量和测定分子量，片段，而且能进行定量和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。等。NorthernNorthern杂交杂交用于用于RNARNA的检测，能对组织细胞中总的检测，能对组织细胞中总RNARNA或或mRNAmRNA进行定性和定量分析。进行定性和定量分析。斑点杂交（斑点杂交（Dot blotDot blot）可用基因组中特定基因及其表达的定性及定可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。特异性不高，有一定比例的假阳性。原位杂交原位杂交（Colony in situ hybridizationColony in situ hybridization）可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。检出基因和基因产物的亚细胞定位。2 2、利用利用PCRPCR及结合其他技术进行基因诊断及结合其他技术进行基因诊断直接采用直接采用PCRPCR进行基因诊断进行基因诊断采用采用PCRPCR产物的限制性片段长度多态性分析（产物的限制性片段长度多态性分析（PCR-PCR-RFLPsRFLPs）进行基因诊断）进行基因诊断采用采用PCRPCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASOASO）斑点杂交进行基因诊断斑点杂交进行基因诊断 通过通过PCRPCR产物的反相点杂交产物的反相点杂交(RBD)(RBD)进行基因诊断进行基因诊断采用采用PCRPCR产物的单链构象多态性产物的单链构象多态性(SSCP)(SSCP)分析进行基因分析进行基因诊断诊断采用采用PCRPCR技术对靶核酸进行定量分析技术对靶核酸进行定量分析寡核苷酸杂交分析寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特和等位基因特异寡核苷酸杂交异寡核苷酸杂交（ASO）3 3、DNADNA序列测定序列测定 DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位，突变的性质。4 4、DNADNA芯片技术芯片技术 应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。（三）三）基因诊断的特点基因诊断的特点高特异性高特异性高灵敏度高灵敏度获得稳定的结果获得稳定的结果早期快速早期快速适用性强，应用范围广适用性强，应用范围广二、二、遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断（以血红蛋白病为例）（一）血红蛋白病概述（一）血红蛋白病概述血红蛋白由四条链组成，两条血红蛋白由四条链组成，两条链和两链和两条条链，每一条链有一个包含一个铁原链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素。子的环状血红素。血红蛋白病（血红蛋白病（hemoglobinopathyhemoglobinopathy）是由于是由于血红蛋白分子结构异常（异常血红蛋白血红蛋白分子结构异常（异常血红蛋白病），或珠蛋白肽链合成速率异常（珠病），或珠蛋白肽链合成速率异常（珠蛋白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血）蛋白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血）所引起的一组遗传性血液病。临床可表所引起的一组遗传性血液病。临床可表现溶血性贫血、高铁血红蛋白血症或因现溶血性贫血、高铁血红蛋白血症或因血红蛋白氧亲和力增高或减低而引起组血红蛋白氧亲和力增高或减低而引起组织缺氧或代偿性红细胞增多所致紫绀。织缺氧或代偿性红细胞增多所致紫绀。（二）血红蛋白病的分类二）血红蛋白病的分类 异常血红蛋白病：异常血红蛋白病：Hb结构发生了变化结构发生了变化 导致贫血病导致贫血病 如：镰刀状细胞贫血如：镰刀状细胞贫血地中海贫血：组成地中海贫血：组成Hb的珠蛋白很成降低的珠蛋白很成降低 或消失，或消失，Hb的结构不发生的结构不发生 变化变化 亦称：珠蛋白合成障碍性贫血亦称：珠蛋白合成障碍性贫血 （三）镰状细胞贫血红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。患者多在成年以前死亡患者多在成年以前死亡Mst酶切位点酶切位点(CCTNAGG)53正常基因正常基因53突变基因突变基因1.15kb1.35kb1 1、镰状红细胞贫血分子机制镰状红细胞贫血分子机制5 67-Pro GluGlu-CCT GAG GAG-5 67-Pro AlaGlu-CCT GTG GAG-2.2.镰状细胞贫血的基因诊断方法镰状细胞贫血的基因诊断方法常用方法有限制性内切法（常用方法有限制性内切法（RERE），），ASOASO，ARMSARMS，跨越断裂点的，跨越断裂点的PCRPCR技技术（裂口术（裂口-PCR-PCR）最常用的是最常用的是RERE限制性内切酶限制性内切酶/Southern blot/Southern blot采集制备血液采集制备血液DNADNA内切酶内切酶MstMst消化消化电电泳泳转膜转膜3232P P标记的标记的珠蛋白珠蛋白cDNAcDNA杂交杂交放射自显影放射自显影+0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析PCR/PCR/限制性内切酶限制性内切酶设计引物设计引物PCRPCR扩增扩增产物进行产物进行限制性内切酶酶限制性内切酶酶切切电泳电泳EBEB染色染色直接观察直接观察例：例：引物引物1 1：5 5-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3引物引物2 2：5 5-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3扩增产物扩增产物294bp294bp引物引物1CCT GAG GAGCCT GTG GAG引物引物1引物引物2引物引物2294bp103bp191bpMst酶切位点酶切位点(CCTNAGG)+103bp191bp294bp正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者镰状红细胞贫血患者PCRPCR产物的限制性酶切分析产物的限制性酶切分析（四）（四）、地中海贫血地中海贫血(ThalassaemiaThalassaemia,简写简写thalthal或或T T)珠珠蛋蛋白白基基因因突突变变导导致致该该多多肽肽链链的的合合成成大大为为减减少少（）或完全缺失（）或完全缺失（0）珠珠蛋蛋白白合合成成速速率率降降低低，导导致致链链和和链链合合成成的的不不平平衡衡多多余余的的珠珠蛋蛋白白链链沉沉积积在在红红细细胞胞膜膜上上改改变了膜的通透性和硬度变了膜的通透性和硬度导致溶血性贫血。导致溶血性贫血。高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。病率最高。缺乏有效治疗措施。缺乏有效治疗措施。1 1、地贫病的分子基础地贫病的分子基础珠蛋白基因全长珠蛋白基因全长2053bp2053bp，含，含2 2个内含子个内含子（IVSIVSI I和和IVS-IIIVS-II），），3 3个外显子。个外显子。目前发现突变有百余种，中国人群发现约目前发现突变有百余种，中国人群发现约2020种；种；一般对特定种族来说，一般对特定种族来说，90%90%的的地贫基因仅地贫基因仅由由4 46 6种突变组成。种突变组成。2 2、地中海贫血的基因诊断地中海贫血的基因诊断PCR/ASOPCR/ASO斑点杂交法斑点杂交法合成合成2 2对对PCRPCR引物（扩增区段引物（扩增区段700bp700bp和和580bp580bp，分别包含，分别包含1414种和种和1 1种可能突变）种可能突变）合成等合成等位特异寡核苷酸位特异寡核苷酸(ASO)(ASO)探针（探针（4 46 6对，分别对，分别标记）标记）制备制备DNADNA样品样品PCRPCR扩增扩增斑点印迹杂交斑点印迹杂交RFLPRFLP分析法分析法ac左侧缺失左侧缺失4.2kb右侧缺失右侧缺失3.7kbbbba2112N端端1C端端正常基因序正常基因序列列PCRPCR扩增法扩增法定性分析定性分析左侧缺失型基因左侧缺失型基因序列序列右侧缺失型基因右侧缺失型基因序列序列ac扩增0.4kbab无扩增片段ab扩增1.2kb+0.4kb1.2kb正常人正常人右侧缺右侧缺失患者失患者地中海贫血患者基因组的地中海贫血患者基因组的PCR分析分析左侧缺失左侧缺失患者患者Thank you！